Fabricage van Driedimensionale Paper-based microfluïdische apparaten voor een immunoassay

Published 3/09/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

We detail een werkwijze driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen te vervaardigen voor gebruik bij de ontwikkeling van immunoassays. Onze benadering inrichtingsamenstel is een type van gelaagde, additive manufacturing. We tonen een sandwich immunoassay representatieve resultaten voor deze soorten papier gebaseerde apparaten verschaffen.

Cite this Article

Copy Citation

Fernandes, S. C., Wilson, D. J., Mace, C. R. Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays. J. Vis. Exp. (121), e55287, doi:10.3791/55287 (2017).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Paper wieken vloeistoffen autonoom als gevolg van capillaire werking. Door patroonvorming papier met hydrofobe barrières, kan het vervoer van vloeistoffen worden gecontroleerd en gericht op een laag papier. Bovendien stapelen meerdere lagen patroonpapier creëert geavanceerde driedimensionale microfluïdische netwerken die de ontwikkeling van analytische en bio-analytische assays kunnen ondersteunen. Papieren microfluïdische inrichtingen zijn goedkoop, draagbaar, eenvoudig te gebruiken en vereisen geen externe apparatuur te bedienen. Als gevolg daarvan houden ze een grote belofte als een platform voor point-of-care diagnostiek. Om het nut en analytische prestaties papieren apparaten goed te kunnen beoordelen, moeten geschikte werkwijzen worden uitgebreid zodat hun vervaardiging reproduceerbaar en op een schaal die geschikt is voor laboratorium instellingen is. In dit manuscript, een werkwijze voor fabriceren van een algemene inrichting architectuur die kan worden gebruikt voor papieren immunoassays beschreven. We maken gebruik van een vorm van additief manufacturing (meerlaagse laminering) apparaten die meerdere lagen patroonpapier en gevormd kleefmiddel omvatten bereiden. Naast het aantonen van het juiste gebruik van de drie-dimensionale papieren microfluïdische apparaten met een immunoassay voor humaan choriongonadotrofine (hCG), worden fouten in het productieproces dat kan resulteren in fouten inrichting besproken. Wij verwachten dat deze benadering van productie papieren apparaten brede toepasbaarheid bij de ontwikkeling van analytische toepassingen specifiek ontworpen voor beperkte hulpbronnen instellingen vinden.

Introduction

Papier is op grote schaal verkrijgbaar in een reeks van formuleringen of rangen, kunnen worden gefunctionaliseerd om af te stemmen zijn eigenschappen, en kan vloeistoffen autonoom transporteren door capillaire werking of opzuigen. Als het papier is gevormd met een hydrofobe stof (bijvoorbeeld fotoresist 1 of was 2), het opzuigen van vloeistoffen kan worden ruimtelijk geregeld binnen een laag papier. Bijvoorbeeld kan een aangebrachte waterige monster gericht in verschillende zones te reageren met chemische en biochemische reagentia opgeslagen in het papier. Deze papieren microfluïdische inrichtingen is aangetoond dat zij een nuttig platform voor de ontwikkeling van draagbare en goedkope analytische methodes 3, 4, 5, 6, 7 zijn. Toepassingen van papier gebaseerde microfluïdische apparaten zijn point-of-care diagnostiekef "> 8, monitoring van milieuverontreinigende stoffen 9, detectie van valse geneesmiddelen 10 en gedelokaliseerd gezondheidszorg (of" telemedicine ") in beperkte-resource-instellingen 11.

Meerdere lagen gevormd document kunnen worden samengevoegd tot een geïntegreerde inrichting waarin hydrofiele zones van aangrenzende lagen (dat wil zeggen hoger of lager) aansluiten op continue fluïde netwerken waarvan de inlaten en uitlaten kunnen worden gekoppeld of links onafhankelijke vormen. 12 Elke laag kan een unieke patroon, waarbij de ruimtelijke scheiding van de reagentia en meerdere tests worden uitgevoerd op een enkel apparaat mogelijk maakt omvatten. Het verkregen driedimensionale microfluïdische apparaat is niet alleen in staat absorberende vloeistoffen analytische methodes maken (bijvoorbeeld, leverfunctietesten en 13 elektrochemische detectie van kleine moleculen 14), maar het kan ook suppoort van een aantal geavanceerde functies (bijvoorbeeld kleppen 15 en eenvoudige machines 16) gemeenschappelijk voor de traditionele microfluïdische benaderingen. Belangrijk, omdat papier transporteert vloeistoffen door capillaire werking, deze inrichtingen kunnen worden gebruikt met minimale inspanning van de gebruiker.

Aangezien reagentia in de driedimensionale structuur van een papieren apparaat kan worden opgeslagen, kunnen complexe protocollen door één enkel toevoeging van waterig monster op een apparaat. Onlangs hebben we een algemene driedimensionale architectuur apparaat dat kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van op papier gebaseerde immunoassays met de wasachtige druktechniek gevormde lagen te creëren. 17, 18 Deze studies gericht op hoe aspecten van de vormgeving van de inrichting-aantal gestapelde lagen gebruikte samenstelling van de lagen en het model van de driedimensionale microfluïde-netwerkgestuurde de totale perUITVOEREN van de immunoassay. Uiteindelijk konden we deze ontwerpregels om de snelle ontwikkeling van een multiplex immunoassay 19 vergemakkelijken. In dit manuscript een eerder ontwikkelde immunoassay voor humaan chorion gonadotropine (hCG; zwangerschapshormoon) wordt 17 gebruikt als een voorbeeld voor de strategieën die we hebben ontwikkeld voor de assemblage en fabricage van driedimensionale papieren immunoassays illustreren. Daarom richten we ons op de montage en de werking van een apparaat in plaats van de ontwikkeling van een test.

In een sandwich immunoassay, het formaat waarin hCG, een capture-antilichaam specifiek voor één subeenheid van het hormoon wordt bekleed op een vast substraat, dat vervolgens geblokkeerd met de niet-specifieke adsorptie van een monster of een volgende reagens worden opgespoord. Dit substraat is meestal een polystyreen microtiterplaat plaat (bijvoorbeeld een enzymgekoppelde immunosorbent assay of ELISA). Het monster wordt vervolgenstoegevoegd aan een put en geïncubeerd gedurende een tijdsperiode. Na grondige wassen wordt een antilichaam dat specifiek is voor de andere subeenheid van hCG toegevoegd en geïncubeerd. Deze detectie antilichaam worden geconjugeerd aan een colloïdale deeltjes, enzym of fluorofoor om een ​​meetbaar signaal te produceren. De put opnieuw gewassen voorafgaand aan het interpreteren van de resultaten van een test (bijvoorbeeld met behulp van een plaatlezer). Voor het commerciële kits vertrouwen op dit tijdrovende proces van meerdere stappen, kunnen al deze stappen snel worden uitgevoerd papieren microfluïdische inrichtingen met minimale tussenkomst van de gebruiker.

Het toestel waarmee de hCG immunoassay omvat zes actieve lagen, die zijn van boven naar beneden, voor toevoegen van het monster, conjugaat opslag, incubatie, vang, wassen en blot (Figuur 1). Het toevoegen van een monster laag is gemaakt uit kwalitatief filtreerpapier. Het vergemakkelijkt de introductie van een vloeistofmonster en beschermt de reagentia in het conjugaat Layer van verontreiniging van het milieu of toevallig contact door de gebruiker. Het conjugaat laag (kwalitatief filtreerpapier) houdt de kleur producerende reagens (bijvoorbeeld colloïdaal goud gemerkt antilichaam) voor de immunoassay. De incubatie laag (kwalitatief filterpapier) kan de sample lateraal reizen op het vlak van het papier om binding van de analyt met reagentia bevorderen alvorens de volgende laag, de laag vangen. De capture laag (nylon membraan) bevat liganden specifiek voor de analyt geadsorbeerd aan het materiaal. Nadat de test is voltooid, wordt deze laag geopenbaard visualisatie van de voltooide immuuncomplex mogelijk maken. De wash laag (kwalitatief filtreerpapier) trekt overtollig vocht, zoals gratis conjugaat reagentia weg uit het gezicht van de vangst laag in de blot laag (dik chromatografie papier). De zes-layer-apparaat wordt bij elkaar gehouden door vijf lagen van een patroon, dubbelzijdige kleefband: vier lagen van permanente kleefstof de integriteit van de Assem behoudenontlucht inrichting en een laag van verwijderbare kleefstof vergemakkelijkt afpellen van het apparaat om de resultaten van de immunotest van de vastlegmodus laag inspecteren.

Ten behoeve van dit manuscript gebruiken we enige negatieve en positieve controlemonsters van hCG (0 mIU / ml en 81 mIU / ml, respectievelijk) representatief resultaat van een papieren immunoassay, die daarover een bespreking van de relatie tussen toestaat bieden vervaardigingswerkwijzen en de prestaties van een hulpmiddel. Naast het laten zien hoe je apparaten succesvol produceren, hebben we aandacht voor een aantal fabricagefouten die kunnen leiden tot het falen van een apparaat of reproduceerbare testresultaten. Het protocol en de discussie beschreven in dit manuscript zal onderzoekers waardevol inzicht in hoe papier gebaseerde immunoassays zijn ontworpen en gefabriceerd bieden. Terwijl we onze demonstratie op immunoassays richten, we verwachten dat de hierin gegeven richtlijnen algemeen bruikbaar voor de vervaardiging van driedimen zalvoorlopige op papier gebaseerde microfluïdische apparaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van Papieren microfluïdische apparaat Lagen

  1. Bereid je patronen voor lagen papier, nylon, en lijm met behulp van een grafisch ontwerp software programma. 6 Elke laag kan een ander patroon hebben.
    OPMERKING: Het patroon kunnen uitlijngaten die niet nodig zijn voor een functionele papieren immunoassay, maar helpen bij de reproduceerbare productie van driedimensionale apparaten. Plaatsing van deze gaten zal verschillen als apparaten afzonderlijk worden geassembleerd, in banden, of als volledige vellen. Het programma wordt gebruikt om patronen te ontwerpen kunnen variëren, afhankelijk van de keuze van patronen techniek (bijvoorbeeld fotolithografie, was druk, of snijden). 6
  2. Spray het werkgebied met een oplossing van 70% (v / v) ethanol en water. Veeg het werkgebied met een schone papieren handdoek.

2. Voorbereiding papier Lagen: Sample Addition, Conjugate opslag, Incubation en Wash Lagen

  1. Bereid lagen van kwalitatieve filter papier met behulp van een grote tabletop papiersnijder. Snijd een voorraad vel papier in een standaard papierformaat om patronen te vergemakkelijken met behulp van een solid ink (was) printer. Zo kan een enkele 460 x 570 mm 2 vel 4 vel US Letter papier (8,5 x 11 inch 2) te maken. Handvat papier met schone handschoenen te allen tijde om besmetting te minimaliseren.
  2. Plaats een losse vellen van chromatografie papier in de printer lade. Print eerder ontworpen lagen (zie figuur 1).
    LET OP: Een patroon kan direct worden afgedrukt op dit blad met behulp van de automatische voeding. Slechts één vel papier moet tegelijk worden afgedrukt om papierstoringen te voorkomen. Voor alle lagen, gebruik dan de "Enhanced" print-instellingen.

3. Bereiding van nylon membraanlaag: Vangst Layer

  1. Snijd de voorraad rol van nylon membraan in vellen (7,5 x 10 inch 2) met behulp van een tafelblad papiersnijder. Besteden veel aandacht in de behandeling van de nylonmembraan om de integriteit te behouden en te beschermen tegen scheuren. Bewaar ongebruikt materiaal in een exsiccator kabinet, zoals nylon membranen zijn gevoelig voor vocht.
    OPMERKING: Knip platen zijn smaller dan US Letter papier. Omdat nylon membranen zijn dun en kwetsbaar, zij niet door de printer rechtstreeks verwerkt en vereisen ondersteuning. Details worden hieronder besproken.
  2. Met behulp van een wax printer een capture laag patroon op een stuk van kopieerpapier en tape het om een ​​lichtbak om te dienen als leidraad voor de positionering van het nylon membraan. De lichtbak helpt de uitlijning van meerdere lagen.
  3. Leg een schone lei van kopieerpapier op de eerder afgedrukte vel kopieerpapier. Tape de schone vel papier aan de lichtbak, maar niet tape de twee vellen aan elkaar.
  4. Plaats een los vel van nylon membraan op de schone stuk kopieerpapier. Controleer of membraan bedekt het bedrukte oppervlak van de onderste laag van het kopieerpapier. Tape alle vier zijden van de nylon membraan naar de schone leivan kopieerpapier.
    LET OP: Zorg ervoor dat de nylon membraan is vlak en glad, zodat er geen problemen zijn met het afdrukken (bijvoorbeeld vastgelopen papier of ongelijkmatige afdrukken van was). Was kan worden afgedrukt op de band waar de nylon membraan naar het kopieerpapier is bevestigd. Als dit gebeurt, moet de ruimte waar nylon onvolledig is gevormd als gevolg van tape dekking worden weggegooid. Voor toekomstige preparaten kunnen grotere stukken nylonmembraan worden gebruikt om dit drukfout voorkomen.
  5. Plaats een vel van nylon membraan (gesteund door de kopie papier aangebracht op het) in de handmatige invoer invoer printer. Print slechts één vel nylonmembraan tegelijk.
    NB: Er zijn geen voorbereiding stappen die nodig zijn voor de blot laag, want het is niet een patroon.

4. Het creëren van Hydrofobe Belemmeringen in de gedrukte laag

  1. Tape de gedrukte lagen op een acrylkader zelfs boven en onder de laag verwarmen bij plaatsing in een heteluchtoven zwaartekracht. Houd de nylon membraan vastgebonden aanondersteuning blad kopieerpapier totdat de was gesmolten en hydrofobe barrières gevormd.
    LET OP: De acryl frame is een op maat gemaakt, laser gesneden stuk van 1/2 ".. Dik acrylaat twee bouwgroottes, afhankelijk van het aantal apparaten worden gefabriceerd werden gebruikt De buitenste rand van het kleinere kader hoogte van 11 5/8" x 2 3/4 ", en de binnenste opening van het frame van 10 3/8" x 1 3/4 ". de buitenste rand van het grotere kader hoogte van 11 5/8" x 8 7/8 ", en de binnenste gat van het frame van 10 1/4 "x 7 7/8". de open, innerlijke ruimte maakt zelfs het smelten van was door de gehele dikte van het papier.
  2. Plaats de lagen in de oven op 150 ° C gedurende 30 seconden tot de was smelt in de dikte van het papier. Controleer of de was de dikte van het papier is doordrongen om te keren en het controleren op onvolkomenheden in het ontwerp.
    OPMERKING: geforceerde lucht ovens of hete platen kunnen ook worden gebruikt om de vaste was ink smelten. Smelten tijdenof temperaturen kunnen variëren afhankelijk van de wijze van verwarming.
  3. Verwijder het papier en nylon membraan van het acryl frame. Ook, verwijder nylon membraan van de steun vel kopieerpapier.

5. Bereiding van hechtlagen

  1. Patroon dubbelzijdige vellen van zelfklevende films met behulp van een robot mes plotter, gebruik van design files vooraf bereid (stap 1.1). Bescherm onbedekte plakstrook oppervlak met behulp van een vel wax liner.
    OPMERKING: De dubbelzijdig klevende worden gevormd met gaten waardoor het monster door lagen te stromen als een continue vloeibare route. De was voering wordt gemakkelijk verwijderd uit de lijm en dient om het te beschermen tegen verontreiniging en scheuren tijdens het snijden. Een laser cutter or die druk kan ook worden gebruikt om patroon lijmlagen films.

6. Drager van Device Lagen met Adhesive

  1. Spuit de lichtbak met een oplossing van 70% (v / v) ethanol en water. Veeg met een schone papieren tOwel.
  2. Tape een patroon laag papier of nylon membraan dat moet worden ondersteund met lijm op de lichtbak met de bedrukte zijde naar beneden.
  3. Schil de ene kant van de beschermende folie van het patroon vel lijm en brengt het naar de laag van papier of nylon membraan. Gebruik de lichtbak om een ​​goede uitlijning van patronen te waarborgen. In elkaar drukken. Plaats het gedeeltelijk geassembleerd apparaat in een beschermende slip.
    NB: De beschermende slip is een opgevouwen stuk lamineren filmsteunlaag dat de apparaten van verontreiniging of beschadiging beschermt door ervoor te zorgen dat ze geen contact met de laminator rollen.
  4. Passeer de resulterende twee-lagen assemblage via een geautomatiseerd laminator om volledig samen te drukken de lijm en papier, het verwijderen van eventuele luchtbellen uit de grensde lagen.
    LET OP: Air zakken tussen de lagen van het apparaat kunnen interfereren met de integriteit van het apparaat en wicking reproduceerbaarheid door het veroorzaken van lekkages.

7. Behandeling van Conjugate Layer met reagentia voor Immunoassays Voorafgaand aan Device Assembly

  1. Tape conjugaat laag op een acrylkader zodat de hydrofiele zone te behandelen zweeft geen contact met het frame.
  2. Voeg 2,5 ul van 100 mg / ml runderserumalbumine (BSA) in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de hydrofiele zone aan het conjugaat laag. Laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten en vervolgens bij 65 ° C gedurende 5 minuten.
    LET OP: Dit volume is net genoeg om de zone van het papier nat. De BSA oplossing maakt de aggregatie van colloïdale nanodeeltjes tijdens het droogproces te voorkomen, dat de afgifte van de nanodeeltjes vergemakkelijkt wanneer het papier en reagentia worden gerehydrateerd door het monster.
  3. Voeg 5 ul van 5 OD colloïdaal goud nanodeeltjes geconjugeerd anti-β-hCG-antilichaam, en herhaal het droogproces.
    OPMERKING: De eenheden van concentratie colloïdaal goud nanodeeltjes worden vaak uitgedrukt als optische dichtheid (OD) gemeten bij absorbance bij λ = 540 nm. Geen behandeling nodig is voor de lont pad voordat het apparaat de montage in paragraaf 10.

8. Behandeling van Lateral Channel met Reagens voor Immunoassays Voorafgaand aan Device Assembly

  1. Tape zijkanaal laag op een acrylkader zodat de hydrofiele zone te behandelen zweeft geen contact met het frame.
  2. Voeg 10 pl blokkerende stof (5 mg / ml vetvrije melk en 0,1% (v / v) Tween 20 in 1x PBS) aan de laterale kanaal te behandelen. Herhaal hetzelfde droogproces (2 min bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens bij 65 ° C gedurende 5 min) als conjugaat laag.

9. Behandeling van Capture Layer met reagentia voor Immunoassays Voorafgaand aan Device Assembly

  1. Tape capture laag op een acrylkader zodat de hydrofiele zone te behandelen zweeft geen contact met het frame.
  2. Behandel de opname laag met 5 ui 1 mg / ml anti-α-hCG antilichaam, waarna hetmonster gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten gevolgd door 8 min bij 65 ° C.
  3. Voeg 2 uL blokkerende stof (5 mg / ml vetvrije melk en 0,1% (v / v) Tween 20 in 1x PBS). Herhaal het droogproces voor de vangst laag.
    Opmerking: Dit bedrag dient te bekleden zonder de papieren occluderen de poriën van het nylon membraan, wat kan gebeuren wanneer er te veel blokkeermiddel wordt gebruikt is.

10. Montage van de drie-dimensionale papier gebaseerde microfluïdische apparaten

  1. Tape het wassen laag naar de lichtbak (bedrukte zijde naar boven). Als de uitlijning gaten worden gebruikt, verwijder ze uit de daaropvolgende lagen met behulp van een handheld hole-punch tool.
  2. Verwijder de beschermende film op de achterkant van de opname laag om de kleefstof vrij. Lijn de capture laag boven de was laag met behulp van de uitlijning gaten als een gids. Druk op de twee lagen aan elkaar. Raak hydrofiele zones verontreiniging of beschadiging van het apparaat te verkorten. Pincet kan worden gebruikt om te helpen assembly.
  3. Verwijder de beschermende film op de rug van de incubatie laag om de kleefstof vrij. Lijn de incubatie laag boven de vangst laag en druk ze samen. Voeg meer lagen zo door totdat alle actieve lagen worden geassembleerd.
  4. Plaats het gedeeltelijk geassembleerd apparaat in een beschermende slip en stevig aanbrengen van de lagen aan elkaar met behulp van een laminator.
  5. Verwijder de beschermende film op de achterkant van de was laag en brengt de blot laag aan de onderkant van het apparaat. Herhaal lamineren stap 10.4 aan de montage van de drie-dimensionale papier gebaseerde microfluïdische apparaat te voltooien. Cut gewenste aantal apparaten van stroken of vellen volledig geassembleerde apparaten met behulp van een schaar.
    OPMERKING: Volledige vellen inrichtingen, stroken apparaten of individuele componenten kunnen worden bereid met een soortgelijke aanpak.

11. Het uitvoeren van een Papieren Immunoassay

  1. Voeg 20 ul van een monster op de hydrofiele zone bovenop het apparaat (bijv thij proeven layer).
  2. Wacht tot het monster volledig lont in het apparaat, voeg dan 15 ul van wasbuffer (0,05% v / v Tween 20 in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing). Na de eerste portie van wasbuffer volledig goddelozen in het toestel, voeg een tweede 15 ul portie wasbuffer.
    OPMERKING: De wasbuffer volledig is slecht in het apparaat als de vloeistofdruppel verdwenen, toont geen meniscus op het oppervlak van het papier. De test is voltooid wanneer het tweede volume wasbuffer volledig het apparaat is ingevoerd.
  3. Om de resultaten van de test te onthullen, afpellen de drie bovenste lagen van het apparaat met behulp van een pincet om de vangst laag bloot te leggen.
    1. Interpretatie van de resultaten van de test kwalitatief door het observeren van de aanwezigheid of afwezigheid van kleur. Als alternatief imago van de uitlezing laag met behulp van een desktop scanner en het gebruik beeldverwerking software of algoritmen om resultaten te kwantificeren en karakteriseren van de verdelingen van de intensiteit binnen eendetectie zone. 20

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verkrijgen reproduceerbare assay prestaties in driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen gebaseerd op een vervaardigingswerkwijze die consistent is tussen apparaten. Op weg naar dit doel te bereiken, hebben we een aantal van de productieprocessen en materiële overwegingen geïdentificeerd, en bespreek ze hier in het kader van het aantonen van een op papier gebaseerde immunoassay. We maken gebruik van een wax printmethode aan hydrofobe belemmeringen op papier gebaseerde microfluïdische apparaten (Figuur 2A) te vormen. 2 Deze methode is ideaal omdat het berust enkel op grote schaal beschikbaar kantoorapparatuur, vereist een minimale procedurele stappen te voltooien, en niet het gebruik van chemische stoffen (bv lichtgevoelige), die kunnen interfereren met eiwit adsorptie of de bevochtigbaarheid van papiervezels veranderen vereisen. Verder was het afdrukken produceert vloeibare paden met reproduceerbare afmetingen, die van cruciaal belang voor het testen met herhaalbare prestaties en de duur times. Nadat de hydrofobe barrières gevormd worden kleefvellen aangebracht op lagen assemblage van driedimensionale apparaten (figuur 2B) te vergemakkelijken. Elke reagentia nodig voor de immunoassay kan worden toegepast na de kleeffolie toegevoegd aan de achterzijde van een laag (figuur 2C). Deze procedure is bruikbaar voor assemblageprocessen academische laboratoria omdat veel apparaten worden parallel bereid. Het samenstellingsproces een immuunanalysemedium voltooid nadat alle lagen van de inrichting zijn gestapeld en gelamineerd aan elkaar (figuur 2D). We voegen monster aan de test te beginnen. In dit voorbeeld gebruiken we een urinebeheersing instellen voor zwangerschapstesten, die negatieve en positieve monsters van hCG in buffer bevat, als monsters om de werking van onze apparaten te tonen en de reproduceerbaarheid van testen uitgevoerd gebruik ervan. Twee fracties van wasbuffer worden daarna achtereenvolgens toegevoegd. Zodra de uiteindelijke hoeveelheid wasbuffer volledig ging de inrichting, deassay als voltooid. De bovenste drie lagen worden vervolgens gepeld weg om de vangst laag (figuur 3A) te onthullen. Deze stap onomkeerbaar beschadigt de inrichting waarmee het niet opnieuw kan worden gebruikt. De voltooiing van een op papier gebaseerde immunoassay resulteert in een kwalitatieve kleur uitlezing die een negatieve of positieve output bij de visuele inspectie kan aangeven. De objectiviteit van deze resultaten blijkt in ongecorrigeerde beelden die met behulp van een flatbed scanner (Figuur 3B).

Mislukte experimenten kunnen vaak markeren bepaalde procedurele stappen, waarvan het belang anders misschien niet waarneembaar zijn bij de analyse van een experiment richt zich op succesvolle resultaten. We tonen drie fouten in de fabricage en montage van driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen die resulteren in defecten in de immunoassay: (i) Soms apparaatstoringen niet zichtbaar nadat een test is voltooid. Bijvoorbeeld, een misalignment tussen lagen omvattend de incubatie kanaal en vangzone kan de ontwikkeling van een onregelmatig patroon in het positieve signaal, wat kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de kwalitatieve signaal door een gebruiker (figuur 4A) veroorzaken. (Ii) Indien de was niet wordt afgedrukt in een voldoende hoeveelheid of niet toegestaan ​​om volledig te smelten door de volledige dikte van het papier en de integriteit van de resulterende hydrofobe barrières kunnen worden aangetast. Onvolledige vorming van deze belemmeringen zal een verlies van controle over wicking veroorzaken en leiden tot lekkages in het apparaat. Bijvoorbeeld, in plaats van beperken stroom naar een kanaal in een laag, een semi-permeabele wax slagboom fluïdum elders lont in het vlak van het papier. Zonder gedefinieerde kanalen, het monster is het onwaarschijnlijk dat het vangen of wassen lagen te bereiken. De gebruiker zal dit soort fouten zien als een sterk verkorte duur assay tijd. We tonen deze mislukking apparaat door het aanbrengen van een oplossing van rode kleurstof naar een layer wiens wax patroon was niet toegestaan om te smelten voor de volledige 30 seconden (Figuur 4B). Een immunoassay met dergelijke laag is "voltooid" in 6 min, wat duidelijk verschilt van de verwachte duur van 15 min. (Iii) Testen die langer dan verwacht in beslag kan een storing in de vervaardiging van een inrichting duiden nemen. Bijvoorbeeld onjuist gesneden kleefstof of verstopte poriën door toepassing van een overmatige hoeveelheid reagentia (bijvoorbeeld blokkers of colloïdaal goud) een monster of wasbuffer in het apparaat (figuur 4C) kunnen verbieden.

Algemeen is de productie protocol is nuttig voor tal papieren microfluïdische inrichtingen parallel fabriceren op een schaal die bruikbaar is voor een academische laboratorium. We tonen de prestaties van de hCG op papier gebaseerde immunoassay bereid met deze werkwijze door het uitvoeren van assays 70 tegelijk: 35 replicaten negatieve en 35 positieve replicates. Voor de toepassing van deze demonstratie, bereid we een aantal lagen met de ontwerpen van ons apparaat, bevestigd de lagen van papier met lijm, en snijd de vellen in rijen van apparaten. Elk vel werd gesneden in 7 rijen, waarin tien apparaten bevatte. Dit vergemakkelijkt het aanbrengen van de lagen op het kleinere acryl frames waar de lagen worden geplakt en dan behandeld met reagentia nodig assays. Deze bereidingswijze inrichting wordt voorgesteld in een notitie in het protocol. Na de behandeling van lagen, werden de inrichtingen geassembleerd in stroken van tien gelamineerd. Na de laatste inrichting fabricagestappen zijn vervuld, de inrichtingen bleven de stroken van tien monster werd toegevoegd aan elk apparaat. We zagen een 0% failure rate voor apparaten vervaardigd met behulp van ons protocol. We gebruikten een open source beeldverwerkingssoftware 20 de resultaten van deze assays kwantificeren. Hoewel een aantal werkwijzen beschikbaar om de intensiteit distribut analyserenion cirkelvormige vlekken (bijvoorbeeld radiale of lineaire versies) 21 meten we de gemiddelde intensiteit van het groene kanaal van een RGB-beeld van de inrichting op het volledige detectie plek als een van belang. 17, 18, 19 We normaliseren bij de metingen van zowel positieve als negatieve testen door het aftrekken van de negatieve onbewerkte data (Figuur 3B). We bepaalden de variatiecoëfficiënt voor elke set 1% zijn gegevens Voor bepalingen met behulp van negatieve monsters en 3% Voor bepalingen met behulp van positieve monsters.

Figuur 1
Figuur 1: Schema van drie-dimensionale papieren apparaat. Deze illustratie toont de hydrofobe en hydrofiele gebieden die de vloeibare route binnen de inrichting te definiëren, evenals de Patterned lagen van permanente en verwijderbare lijm die lagen bij elkaar te houden. Elke laag wordt aangeduid door de functie is in de test. Rood, blauw of groen overzicht op elke laag geeft het materiaal te vervaardigen dat bepaalde laag (rood: chromatografiepapier, blauw: nylonmembraan, groen: dik chromatografiepapier). De afmetingen zijn gegeven voor elke zone in het apparaat in mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Procedure gebruikt voor immunoassays vervaardigen van driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen. (A) Foto's van de voor- en achterzijde van een vel papier gevormd middels chromatografie was tijdens printen voor en na verwarmen. (B) Een blad chromatografiepapierondersteund met een film van lijm patroon. (C) behandelingen toegepast op de hydrofiele zones van een strook patroon nylonmembraan. (D) Montage van stroken van een meerlaagse apparaat met behulp van een lichtbak en uitlijning gaten als een gids. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Het interpreteren van de resultaten van een op papier gebaseerde immunoassay. (A) De drie lagen van de papieren apparaat worden afgepeld de vangst laag bloot te leggen en de resultaten van de test. (B) Grafische weergave van de prestaties van een papieren immunoassay voor hCG. De resultaten die zijn weergegeven zijn de gemiddelden van 70 herhalingen uitgevoerd tegelijkertijd, waar 35 repliceert elke worden gebruikt for positieve en negatieve monsters van hCG. Fout balken geven de standaardafwijking van de dataset. Ongecorrigeerde, representatieve beelden beeltenis van positieve (rode kleur) en negatieve (witte kleur) vloeit voort uit een hCG immunoassay worden getoond boven hun respectieve data. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Voorbeelden van fabricagefouten. (A) Door verplaatsing van de laterale kanaal boven de capture-laag, wordt de positieve signaal geconcentreerd in een klein gebied van de uitlezing zone. Een "natte" cirkelvormig gebied (gestippelde lijnen) kan worden waargenomen aan de rechterkant van de uitlezing zone als gevolg van contact tussen de laterale kanaal uitgelijnd met de capture laag (links). Afbeelding van een positieve uitlezing opde vangst laag van een goed uitgelijnd apparaat (rechts). (B) Incomplete smelten van was over de dikte van een laag kan leiden tot lekken in de inrichting. Kleurstof is toegevoegd aan de oplossing om te helpen bij visualisatie van monster in lagen met onvolledige of volledig gevormde hydrofobe barrières. (C) Onjuist snijden lijm kan het vloeibare netwerk tussen lagen papier, die de stroom van een monster stopt blokkeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Productie driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen. Het schema toont de montage en lamineren van meerdere lagen van patroonpapier in voltooide driedimensionale apparaten. In dit voorbeeld 70 c inrichtingenEen gelijktijdig worden. De lijmlagen en uitlijngaten zijn verwijderd uit het schema ter vereenvoudiging. Na montage kunnen afzonderlijke apparaten worden verwijderd en gebruikt in testen. De rode, blauwe en groene lijnen op elke laag te geven aan het materiaal van die bepaalde laag fabriceren (rood: chromatografiepapier, blauw: nylonmembraan, groen: dik chromatografiepapier). De schaal bar = 25 mm met uitzondering van de apart apparaat (rechts), die afmetingen van 12 x 28 mm2 heeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het identificeren van een reproduceerbare productie-strategie is een essentieel onderdeel van de ontwikkeling van testsystemen. 22 We gebruiken een sequentiële, laag voor laag benadering driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen te vervaardigen. In tegenstelling tot die werkwijzen die vouwen of origami technieken meerlagige apparaten van een vel papier 23 produceren toepassen, 24 additive manufacturing biedt een aantal voordelen: (i) meerdere materialen in een enkele apparaatarchitectuur werkwijzen worden verwerkt zonder modificatie voor de drukkerij, uitlijning, of assemblage lagen. (Ii) gevormde zelfklevende folie kan worden geïntegreerd in het assemblageproces. Deze films aanbrengen aangrenzende lagen, en op basis van de sterkte van het kleefmiddel, kan reversibel te schakelen schillen en evaluatie van interne lagen zijn. Bovendien kleefmiddelen verschaffen structurele integriteit aan de driedimensionale inrichting, die de noodzaak uitsluitvoor bindmiddel 25 clips of bewerkte behuizingen. 23 (iii) Onafhankelijke vel US Letter chromatografiepapier kan een reeks herhalingen, die sterk de doorvoer van laboratoriumschaal productie kan verbeteren (figuur 5). Dit is bijzonder gunstig bij de evaluatie van een groot aantal experimentele omstandigheden dat de technische repliceert vereisen. Door deze benadering kan 70 driedimensionale papieren apparaten tegelijk worden voorbereid. (iv) dezelfde meerlaagse laminering benaderingen worden gebruikt voor high-volume productie van talrijke commerciële producten in de gezondheidszorg (bijv wondverzorging dressings en transdermale pleisters), die vervolgens verlaagt de productie barrière voor de drie-dimensionale papieren microfluïdische inrichtingen vertalen.

Naast het vergemakkelijken peeling en assemblage, de keuze van de lijm is ook kritisch voor het ontwerp van de driedimensionale vloeibare netwerk. Een advertentievaste lijmresten film kan dienen als een extra barrière tussen lagen papier, die maskeren van hydrofiele zones op aangrenzende lagen kunt inschakelen. In de praktijk is het gebruik van dunne lijmlagen gewenst. Als de lijm te dik (bijvoorbeeld veel dubbelzijdig klevende banden) en de spleet gevormd tussen twee lagen papier te groot vergemakkelijken wicking en moet worden gevuld met een hydrofiel middel (bijvoorbeeld cellulose poeder) functioneren weer. 12 Hoewel deze extra stap voegt complexiteit te vervaardigen en de substantie die kunnen storen met testen, deze gaten tot een nuttig kenmerk voor de productie controleerbaar, vloeibare push-down kleppen. 15 Andere vormen van lijm zijn gebruikt bij de vervaardiging van driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen. Spuitbuslijmen bieden een eenvoudige methode om lagen aan elkaar hechten. 26 Met deze methode wordt het kleefmateriaal gelijkmatig aangebracht op beide tHij hydrofobe en hydrofiele deel van het papier. Een voordeel van deze methode is dat extra apparatuur (bijvoorbeeld messen of plotter lasersnijmachine) niet nodig is om het patroon van de kleeflaag te ontwerpen. Wel moet de voorwaarden voor een uniforme toepassing van de lijmspray proefondervindelijk worden bepaald voor elk type materiaal. De topografie van het materiaal kan beïnvloeden de hechtende materiaal interface en langere tijden nevel nodig zijn voor ruwe oppervlakken. Bovendien, sproeien lijm op de hydrofiele gebieden van het vloeibare enzym kan resulteren in verminderde wicking door het veranderen van de bevochtigbaarheid van het papier. Alternatief kan het gebruik van sjablonen 27 of zeefdruk 8 worden gebruikt voor het in patroon kleefmiddel direct op lagen patroonpapier.

Twee belangrijke overwegingen voor de ontwikkeling van drie-dimensionale papieren microfluïdische inrichtingen zijn de materiaalkeuze en het ontwerp van de fluidic-netwerk. (I) selecteren we materialen en combinaties van materialen op basis van opzuigsnelheid, natte sterkte, dikte en eiwitbindende capaciteit. Opzuigsnelheid kan de duur van de test en de hoeveelheid tijd reagens beïnvloeden reageren of binnen een laag binden. Verschillende papierkwaliteiten worden gekenmerkt door wicking tarieven op basis van, bijvoorbeeld, de behandeling van het papier, de porositeit en de dikte. Het is mogelijk om meerdere lagen papier om de effectieve opzuigsnelheid van een apparaat te vergroten. 28 Een goede natte sterkte gewenst voor toepassingen die vereisen hanteren (bijvoorbeeld peeling een immunoassay) nadat het apparaat is verzadigd met een monster. Materialen die te dik zijn of die niet door de drukker worden doorgegeven door breekbaarheid wordt een alternatieve methode vereist patroonmatig kanalen (bijvoorbeeld fotolithografie) produceren. In tegenstelling, dikkere materialen zijn ideaal voor blot lagen (of sinks) om vloeistoffen te trekken door The-apparaat. Veel soorten nylon membranen zijn commercieel verkrijgbaar, die kunnen verschillen in hun vermogen om proteïnen irreversibel binden aan de vangzone. Materiaalvervangingen (bijvoorbeeld nitrocellulose plaats van een nylon membraan) kan beïnvloeden bindingscapaciteit, die de gevoeligheid van de assay kunnen beïnvloeden. (ii) Het gebruik van symmetrie in het ontwerp van vloeibare netwerken zorgt de unieke kanalen gevormd in driedimensionale apparaten gedragen identiek (bijvoorbeeld tegelijkertijd gevuld), die essentieel is voor multiplex assays. 19 Symmetry vereenvoudigt verdere laag ontwerp, helpt bij laag uitlijning bij het monteren volledige vellen met apparaten en kan afval te minimaliseren. Wijzigingen aan het apparaat ontwerp kan de werking van de test beïnvloeden. Bijvoorbeeld, het verhogen van de lengte van het zijkanaal in de incubatie laag zal de duur van de test beïnvloeden, omdat de vloeistof een naar verhouding langere afstand zal lont alvorens de outlet. 17 In toepassingen die gebruik maken van de binding van een doelbiomolecuul, kan een langere testtijd voordelig zijn omdat het de fractie gebonden, gemerkte species voorafgaand aan immobilisatie kan verhogen de opname laag.

Concluderend hebben wij voorgesteld een werkwijze driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen die de ontwikkeling van immunoassays ondersteunen fabriceren. Deze werkwijze, die een bepaald type additive manufacturing gebruikt meerlaagse produceren van inrichtingen, vergemakkelijkt de productie van apparaten op een schaal die geschikt is voor laboratoriumonderzoek. De in dit manuscript beschreven protocol is specifiek voor papier gebaseerde immunoassay apparaten; echter, verwachten we dat de procedures met betrekking tot de montage van deze immunoassays-wax printing, patroonvorming lijm, het uitlijnen van lagen en lamineren-zal gemakkelijk uitbreidbaar tot een groot aantal driedimensionale papier gebaseerde microfluïdische apparaat architecturen. Een goed begrip van de fabricatie methodologie kan leidende ontwikkeling van nieuwe point-of-care tests met een breed scala aan toepassingen in de gezondheidszorg, milieu en landbouw.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illustrator CC Adobe to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer Amazon B00R92C9DI to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven Fisher Scientific 15-103-0509 to melt wax into paper
Artograph LightTracer Amazon B000KNHRH6 to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator Amazon B00AXHSZU2 to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter Graphtec America CE6000-40 to pattern adhesive films
Swingline paper cutter Amazon B0006VNY4C to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner Amazon B000VG4AY0 to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch McMaster-Carr 3488A9 to remove alignment holes 
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 Sigma Aldrich WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)  Fisher Scientific 05-714-4 to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) Pall Corporation NBCHI3R to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF021621 to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF051521
wax liner FLEXcon FLEXMARK 80 D/F PFW LINER to assist with patterning adhesive
acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266  to fabricate frame
self-adhesive sheets Fellowes CRC52215 to use as protective slip
absolute ethanol VWR 89125-172 to sanitize work area
bovine serum albumin AMRESCO 0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls Fisher Scientific 22-071-066 to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) Arista Biologicals  CGBCG-0701 to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody Arista Biologicals  ABACG-0500 to treat capture layer
10X phosphate buffered saline Fisher Scientific BP3991
Oxoid skim milk powder Thermo Scientific OXLP0031B
Tween 20 AMRESCO M147

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8, (12), 2146-2150 (2008).
  2. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81, (16), 7091-7095 (2009).
  3. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46, (8), 1318-1320 (2007).
  4. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82, (1), 2-10 (2010).
  5. Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87, (1), 19-41 (2015).
  6. Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
  7. Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
  8. Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4, (152), 152ra129 (2012).
  9. Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84, (10), 4474-4480 (2012).
  10. Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85, (13), 6453-6460 (2013).
  11. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80, (10), 3699-3707 (2008).
  12. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (50), 19606-19611 (2008).
  13. Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84, (6), 2883-2891 (2012).
  14. Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10, (22), 3163-3169 (2010).
  15. Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10, (19), 2499-2504 (2010).
  16. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87, (15), 7595-7601 (2015).
  17. Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14, (24), 4653-4658 (2014).
  18. Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8, (26), 5204-5211 (2016).
  19. Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88, (12), 6161-6165 (2016).
  20. Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11, (7), 36-42 (2004).
  21. Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6, (5), e18940 (2011).
  22. Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16, (5), 801-809 (2014).
  23. Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133, (44), 17564-17566 (2011).
  24. Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
  25. Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86, (13), 6501-6507 (2014).
  26. Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12, (15), 2630-2633 (2012).
  27. Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14, (22), 4354-4361 (2014).
  28. Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15, (23), 4461-4466 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats