Name: Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer neurosfeercultuurmethoden voor neurale stamcellen om biogenese en eiwittransport van primaire cilia te bestuderen. Deze techniek biedt inzicht in ciliafunctie in neurale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het werk in S.M.'s laboratorium wordt gefinancierd door wervingssubsidies van CPRIT (R1220) en NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolatie van Neurosferen van de volwassen muis Brain <ol><li> Euthanaseren een volwassen muis (ongeveer 2 maanden oud) door een overdosis van isofluraan. Double-check dat de muis ademhaling is gestopt en ontleden onmiddellijk na de dood. </li><li> Met een schaar, maak een middellijn incisie aan de schedel te openen. Verwijder de hersenen. </li><li> Plaats de hersenen in koude PBS in een 10 cm schotel op ijs. Volg de hele-mount versnijdingsmethode de SVZ van het laterale ventrikel 48 te verkrijgen. </li><li> Plaats de laterale ventrikel in een 1,5 ml buis, voeg 500 ul van 0,05% trypsine-EDTA in PBS en incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 37 ° C in een waterbad. </li><li> Na 15 minuten, voeg 500 ul stoppen medium en voorzichtig pipetteren 20-30 keer met 1 ml tip. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het pipetteren. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de overleving van de cel. </li><li> Draai de cellen bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PBS en resuspendeer tHij cellen door voorzichtig pipetteren met een 5x 1 ml tip. </li><li> Spin down bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 1 ml basismedium. </li><li> (Optioneel) Als celresten worden opgemerkt, laat de cellen door een 70 urn cel zeef. </li><li> Tel het aantal cellen met een hemocytometer; in het algemeen, ongeveer 30.000 - 60.000 cellen / SVZ verkregen. </li><li> Plaat de cellen van de ene SVZ in een 10 cm schaal met 10 ml NSC medium en kweek bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> (Optioneel) fusie tussen gebieden 49 te vermijden, zet 1.000 cellen in één putje van een ultralage binding 6-wells plaat die is voorgevuld met 1,5 ml NSC medium en kweek bij 37 ° C met 5% CO2. OPMERKING: Na het 5-7 dagen, neurospheres kan worden waargenomen (Figuur 2A). De kweekperiode kan verschillen met de leeftijd van de muis of de genetische achtergrond. </li><li> Voeg 2 ml van NSC medium elke 3-4 dagen om de cultuur te behouden(Niet bij de reguliere medium te verwijderen). </li></ol> 2. Analyse van het differentiatievermogen neurosferen en ciliogenese Tests <ol><li> Om de differentiatie capaciteit te analyseren, het analyseren van de neurospheres onder klevende omstandigheden in differentiatie medium. </li><li> Steriliseren 12 mm rond dekglaasjes autoclaaf of met UV-blootstelling voor gebruik. Voor een hechtende celkweek, zet een gesteriliseerde 12 mm rond dekglaasje in een putje van een plaat met 24 putjes onder steriele omstandigheden. </li><li> Bekleden van het dekglas gedurende 10 s met 500 ui 0,002% poly-L-lysine (PLL). Aspireren de oplossing en drogen gedurende 10-15 minuten. </li><li> Voeg 500 ul van laminine-oplossing (5 ug / ul). Incubeer de dekglas gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Zuig het laminine en voeg 500 ul van differentiatiemedium of NSC medium (ongedifferentieerde controle). </li><li> Voor de differentiatie assay, pak een 100-200 urn bol met een 200 pi tip onder de microscoop. Toevoegen5-10 neurospheres aan elk putje van een 24-well plaat en cultuur voor 7-10 dagen in differentiatie medium. </li><li> Om ongedifferentieerde neurospheres analyseren, voeg 5-10 neurospheres aan elk putje van een 24-well plaat en cultuur voor 1-2 dagen in NSC medium. Bevestigd neurosferen verspreiden en groeien als een monolaag (figuur 2B). </li><li> Na zorgvuldige verwijdering van het medium, bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en daarna wassen met PBS tweemaal gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De plaat kan 1-2 maanden worden bewaard bij 4 ° C. Opmerking: Om neurale stam / progenitorcellen in NSC medium en gedifferentieerde cellen in differentiatiemedium visualiseren Voer immunokleuring tegen Nestin (neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker), β-tubuline III (TUJ1 monoklonaal neuronale merker), GFAP (glia fibrillair zuur eiwit , astrocyt marker) en O4 (oligodendrocyt marker) (Figuur 2B-E). Om de trilharen te analyseren, uitvoeren van immunokleuring tegen Arl13b (primair cilia marker) en Gpr161 (ciliaire GPCR) (figuur 3). </li><li> Monteer het dekglaasje met montage oplossing op een glasplaatje. Kantel het objectglaasje om overmaat oplossing te verwijderen. </li></ol> 3. Analyse van ciliogenese in Neurosferen <ol><li> Aan cellen in intacte neurosferen geanalyseerd door immunokleuring breng 1 ml kweekmedium bevattende meervoudige neurosferen een 1,5 ml buis en spin neer op 500 xg gedurende 8 minuten. Bevestig de bolletjes met 4% (PFA) na verwijdering van het medium gedurende 15 minuten en wassen met PBS. Spin down bollen bij 500 xg gedurende 8 minuten, verwijder supernatant en incubeer de sferen O / N met 30% sucrose bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 500 ul van oktober oplossing wordt een ondergrens 1 ml tip. Snijd de rand van het uiteinde van de opening groter naarmate oktober viskeus. </li><li> Breng de oktober oplossing die de neurosferen in een wegwerp plastic bevriezing vorm (10 mm x 10 mm x 5 mm). </li><li> Bevries de moud op droog ijs gedurende ten minste 15 min. </li><li> (Optioneel) Stop het experiment en bewaar de schimmel in een -80 ° C vriezer gedurende 1 jaar. </li><li> Snijd de secties met een cryostaat; de dikte van gedeelten moeten 15-30 urn. </li><li> De primaire cilia in een neurosfeer visualiseren voeren immunokleuring tegen Arl13b (figuur 4). </li></ol> 4. Cultuur en Passage van Neurosferen en Adherent NSC <ol><li> Passage de neurospheres terwijl de bol grootte is tussen 100-200 urn; wanneer de neurospheres zijn te groot (300 micrometer of hoger), ze zijn niet ideaal voor experimenten. </li><li> Breng de neurosferen in een 50 ml buis met een 1 ml tip en spin neer op 500 xg gedurende 8 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant met behulp van een zuigpomp, voeg 500 ul van 0,05% trypsine-EDTA in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. De hoeveelheid trypsine afhankelijk van het aantal sferen. </li><li> Voeg 500 ul serum medium en voorzichtig pipet 20 maal met 1 ml tip. </li><li> Spin down bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 1 ml basismedium. </li><li> (Optioneel) Als celafval of gedissocieerde neurosferen worden gezien, laat de cellen door een 70 urn cel zeef. </li><li> Passage van de cellen in een schaal van 10 cm bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm2 in NSC medium; de cellen klaar voor de volgende passage na een week zijn. </li><li> (Optioneel) cellen in te vriezen, voeg invriesmiddel 500.000 tot 1.000.000 cellen / ml suspensie te genereren. Bevries de cellen met behulp van cryo invriezen containers; gedissocieerde neurosferen kunnen ook worden bevroren. </li><li> De hechtende kweek, dillute de cellen 50.000 cellen / cm2 op PLL en laminine beklede dekglaasjes met NSC medium en kweek gedurende 1-2 dagen. </li></ol> 5. Honger en analyse van Cilia <ol><li> Bereid uitputtingsmedium (tabel 1). </li><li> 1-2 dagen na de eerste plating hechtende cellen na dissociatie, wijziging NSC medium in een putje (controle) en uitputtingsmedium in een andere put (experiment). </li><li> Kweek de hechtende cellen gedurende 24 uur. </li><li> Fixeer de cellen met 4% PFA in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal wassen met PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur. </li><li> (Optioneel) Stop het experiment en bewaar de 24-wells platen met dekglaasjes in PBS bij 4 ° C gedurende 1-2 maanden. </li><li> Uitvoeren van een protocol voor immunofluorescentie kleuring 7, 50. </li><li> Monteer de dekglaasjes u aan een montage-oplossing. Droog het objectglaasje O / N bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Acquire beelden op een samengestelde microscoop op de noodzakelijke vergroting. Gebruik een microscoop, een camera, en doelstellingen (40X / 1.3 olie- en 63x / 1,4 olie), geregeld met behulp van de meegeleverde software. Neem voldoende z-secties 0.5-0.8 urn intervallen (Figuur 5). </li><li> Voor de kwantitatieve analyse van trilharen lokalisatie inhechtende cellen verwerven stapels beelden 3-8 opeenvolgende velden met confluente cellen door te kijken naar de DAPI kanaal. Kwantificeren van het aantal primaire cilia behulp ImageJ / Fiji. Typisch, gebruik dan de &quot;Cell teller&quot; tool in de ImageJ Plugins&gt; Analyse dialoogvenster om de cellen met GPCR-positieve cilia te tellen; maximale projecties van stapels beelden kunnen ook van ImageJ / Fiji.Use gelijke beeldintensiteit en contrast parameters worden uitgevoerd voor alle beelden van hetzelfde experiment voor het tellen en export doeleinden. </li></ol> 6. Transfectie van Neurosferen <ol><li> Hechten gedissocieerde cellen dekglaasjes gedurende 24 uur. Gebruik een celdichtheid typisch tussen 75.000 en 150.000 cellen in 500 pl medium NSC in een enkel putje van een plaat met 24 putjes. </li><li> Meng 25 pl verlaagde serum medium en 1,5 pl transfectiereagens in een 0,5 ml microbuisjes door wervelen gedurende 5 s. </li><li> Voeg 2,5 ug endotoxine-vrij plasmide DNA aan een afzonderlijke 0,5 ml microtube bevattende 25 pl verminderde serum media en meng door vortexen gedurende 5 s. </li><li> Voeg 1 ul van transfectiereagens tot de tweede microbuis die DNA en mengen door vortexen gedurende 5 s. </li><li> Voeg het mengsel van het DNA-bevattende buis naar de eerste microbuisjes en meng door pipetteren. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie voorzichtig het transfectiemengsel druppelsgewijs toevoegen putjes bovenop de NSC medium (500 pl / putje). </li><li> Verander het medium 24 h na transfectie met medium (NSC gemiddeld) of uitputtingsmedium (500 ul / putje) besturen. </li><li> Fixeer de cellen door het veranderen van het medium tot 4% PFA na 24 uur en immunokleuring voeren; kenmerkend tot 10% transfectie efficiëntie verkregen met dit protocol. </li></ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier beschrijven we een methode om te genereren en te onderhouden neurosphere culturen uit volwassen muis SVZ. Enkele relevant ten aanzien van de culturen zijn als volgt. Ten eerste, de afmetingen van de bolletjes zijn typisch tussen 50-200 urn. In onze ervaring, wanneer een neurosphere groter wordt dan 300 micrometer in diameter, is de optimale tijd voor passage gemist. Deze grotere bolletjes bevatten dode cellen in de kern. Ten tweede, als neurosferen algemeen worden gebruikt voor neurale stamcellen / voorlopercellen ...

De primaire cilium is een microtubulus gebaseerde dynamische subcellulair compartiment dat functioneert als een zintuiglijke antenne coördinatie cellulaire signaalroutes, zoals de Sonic-hedgehog (Shh) route tijdens de embryonale neuronale ontwikkeling 1, 2 en gecompartimenteerde subcellulaire signalering bij volwassen neuronale functie 3, 4 . Signaleringscomponenten van deze routes, zoals Shh receptor Patched 5; het pad activator Smoothened (Smo) 6; en Gpr161 7, wees G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) die negatief reguleert de Shh route, lokaliseren op cilia op een dynamische wijze. Meerdere GPCRs zijn gerapporteerd te lokaliseren aan de cilia van neuronen in de hersenen 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defecten in cilia en trilharen gegenereerde signaalroutes beïnvloeden meerdere weefsels en zijn gezamenlijk bekend als ciliopathieën 17, 18, 19. De ciliopathie ziektespectrum omvat vaak neurologische afwijkingen zoals craniofaciale abnormaliteiten 20, 21, 22. Daarnaast kunnen primaire cilia in neuronen van de hypothalamus regelen centrale verzadiging paden en defecten leiden centrale obesitas 23, mirroring obesitas bij syndromale ciliopathieën zoals Bardet Biedel syndroom 24. Bovendien, neuropeptide receptor signalering bij cilia regelt central verzadiging trajecten 11, 14. Ciliaire lokalisatie van adenylylcyclase III (ACIII) en GPCR&#39;s zoals somatostatine receptor 3 in hippocampale neuronen leiden tot nieuwe defecten objectherkenning en geheugenstoornissen 25, 26 en parallel met een gebrek aan integriteit ciliaire 27. De ontwikkelingsdoelen aspecten van trilharen-gegenereerde signalering zijn nauw verbonden met weefsel homeostase; met name cilia zijn belangrijk voor de voortgang van Shh-subtype medulloblastomas gevolg van granule voorlopers in het cerebellum 28, 29. Zo primaire cilia een belangrijke rol spelen tijdens de embryonale, postnatale en volwassen neuronale ontwikkeling en functie. Neurale stamcellen (NSC&#39;s) zijn gehuisvest in de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel, de subgranulaire zone van de dentate gyrus van de hippocampus, enventriculaire zone van het derde ventrikel in de hypothalamus bij zoogdieren 30, 31, 32. NSCs zijn multipotente, bezitten het vermogen tot zelf-vernieuwing, en zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen en regeneratieve geneeskunde 30. De meeste NSC in de SVZ zijn rust en beschikken over een eenzame primaire cilium dat, in veel gevallen, strekt zich uit naar de laterale ventrikel 33. De primaire cilium signalen via de lokalisatie van de verschillende receptoren induceren stroomafwaartse cellulaire reacties, met name met betrekking tot Shh, TGFp en receptor tyrosine kinase pathways 2, 34, 35, 36. Aangezien primaire cilia uitstrekken in de laterale ventrikel, wordt verondersteld dat primaire cilia cytokines gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistof (CSF) om NSC&#39;s 37 activeren </sup&gt;. Recente studies suggereren dat de Shh signaleringsroute en primaire cilia zijn cruciaal voor de activering van stamcellen in de reparatie en regeneratie van meerdere weefsels, waaronder de reukepitheel, longen en nieren 38, 39, 40, 41. Echter, de mechanismen die CSF communiceert met NSC en of primaire cilia zijn betrokken zijn niet bekend. Hechtende NSCs in cultuur worden trilharen; lokaliseren Shh pathway componenten zoals Smo en Gpr161 in trilharen; en zijn Shh responsief 42. Aldus kan NSC dienen als een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen Shh route, ciliaire handel en neuronale differentiatie paden. Bovendien kunnen neuronen opzichte van NSC ook voor ciliaire handel assays. Neurospheres zijn samengesteld uit clusters van vrij zwevende cellen die voortvloeien uit de proliferatie van neural stam / progenitorcellen die groeien in de aanwezigheid van specifieke groeifactoren en klevende oppervlakken 43, 44. Neurosferen zijn belangrijke in vitro cultuurmodellen neurale stam / progenitorcellen in de normale ontwikkeling en ziekte 31, 45, 46, 47 bestuderen. We beschrijven hier een neurosfeer gebaseerde test voor het kweken van neurale stam / progenitorcellen en differentiatie tot neuronen / glia. Wij benadrukken het bijzonder het transport van signaleringscomponenten op cilia van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen (Figuur 1). In tegenstelling tot het kweken van primaire neuronen, primaire neurosferen zijn relatief gemakkelijk te kweken, zijn ontvankelijk voor meervoudige passages en vries-dooicycli en kunnen differentiëren tot neuronen / glia. Belangrijker, we vastgesteld dat neurosfeer afgeleide neuralestam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen zijn trilharen in kweek en te lokaliseren signalerende moleculen trilhaarfunctie in deze compartimenten relevant. Neurosphere-gebaseerde kweekmethoden kan dienen als een ideaal model voor het bestuderen ciliogenese en trilharen handel in NSCs en gedifferentieerde neuronen.

<table><tbody><tr><td>12 mm round cover glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm dish</td></tr><tr><td>70 &micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td></tr><tr><td>Arl13B, Clone N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vial</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G solution</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>mounting solution</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td></tr><tr><td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>home made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>human bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 mm deep</td><td>improved neubauer</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Isofluorane</td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminin</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF protein, CF</td><td>R and D systems</td><td>236-EG-200</td><td>EGF</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine science tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slide</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>slides</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>ultra-low binding 6-well plate</td></tr><tr><td>&beta;-tubulin III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

met behulp van primary neurosfeerculturen om te studeren primary cilia

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Het primaire cilia is fundamenteel belangrijk voor de proliferatie van neurale stam-/voorlopercellen en voor neuronale differentiatie tijdens embryonale, postnatale en volwassen leven. Bovendien bezitten de meeste gedifferentieerde neuronen primaire cilia die signaalreceptoren huisvesten, zoals G-proteïnegekoppelde receptoren, en signaalmoleculen, zoals adenylcyclasen. Het primaire cilia bepaalt de activiteit van meerdere ontwikkelingspaden, inclusief de sonic hedgehog-route tijdens embryonale neuronale ontwikkeling, en functioneert ook in het bevorderen van gecompartimenteerd subcellulair signaalverkeer tijdens volwassen neuronale functie. Het is niet verrassend dat defecten in primaire cilia-biogenese en -functie zijn gekoppeld aan ontwikkelingsstoornissen van de hersenen, centrale obesitas en tekorten in leren en geheugen. Daarom is het van essentieel belang om primaire cilia-biogenese en ciliair verkeer te bestuderen in de context van neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen. Cultuurmethoden voor primaire neuronen vereisen echter aanzienlijke expertise en zijn niet geschikt voor bevriezing-ontdooi cycli. In dit protocol bespreken we kweekmethoden voor gemengde populaties van neurale stam-/voorlopercellen met behulp van primaire neurosferen. De neurosfeer-gebaseerde kweekmethoden bieden de gecombineerde voordelen van het bestuderen van primaire neurale stam-/voorlopercellen: geschiktheid voor meerdere passages en bevriezing-ontdooi cycli, differentiatiepotentieel naar neuronen/glia en transfecteerbaarheid. Belangrijk is dat we hebben vastgesteld dat neurosfeer-afgeleide neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen bewimperd zijn in cultuur en signaleringsmoleculen lokaliseren die relevant zijn voor ciliaire functie in deze compartimenten. Met behulp van deze culturen beschrijven we verder methoden om cilogenese en ciliair verkeer te bestuderen in neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen. Deze neurosfeer-gebaseerde methoden stellen ons in staat om cilia-gereguleerde cellulaire paden te bestuderen, inclusief G-proteïnegekoppelde receptor- en sonic hedgehog-signalering, in de context van neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen.

Na plating van de cellen van de SVZ in NSC medium voor een week, dreven neurosferen waargenomen (Figuur 2A). De afmetingen van de bolletjes varieerde tussen 50 en 200 urn. Te onderzoeken of de bolletjes werden afgeleid van neurale stam / progenitorcellen werden de neurosferen uitgeplaat op PLL en laminine beklede dekglaasjes in NSC medium gedurende 2 dagen. Zij werden vervolgens immunostained tegen de neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker, Nestin. Twee dagen wa...

De primaire cilium fundamenteel belang neurale proliferatie, neuronale differentiatie en volwassen neuronale functie. Hier beschrijven we een werkwijze voor ciliogenese en het transport van signalerende eiwitten trilharen neurale stam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen in het primaire neurosfeerculturen bestuderen.

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Het algemene doel van deze procedure is om gebruik te maken van kweekmethoden op basis van neurosferen voor primaire neurale stam- en progenitorcellen om de biogenese en het transport van het primaire cilium te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van primaire cilia, zoals de biogenese van cilia en het transport van cilia-moleculen naar de primaire cilia in primaire neurale stamcellen, neurale progenitoren en neuronen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de primaire celcriteria van neurale stamcellen, neurale progenitoren en neuronen kunnen gebruiken om biogenese en ciliaire pathways te analyseren in de context van het primaire cilium. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het kweken van neurale stamcellen technisch uitdagend is voor beginners. We zullen laten zien dat een demonstratie van deze methode cruciaal is, aangezien de dissectie van het laterale ventrikel en stappen zoals het kweken van neurosferen en de kwantificering van primaire cilia gemakkelijk worden aangeleerd door de kritieke stappen te observeren.Begin deze procedure met een subventriculaire z

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.

Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.

Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Deze methode beschrijft de exploitatie van het endogene signaal in een ARL13B-CENTRIN-2 transgeen muismodel om primaire cilia in situ in beeld te brengen, in drie dimensies over grote delen van gemineraliseerd weefsel, van weefselverzameling tot analyse van de organisatie van cilia's. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere soorten weefsels.

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Leer neurosfeercultuurmethoden voor neurale stamcellen om biogenese en eiwittransport van primaire cilia te bestuderen. Deze techniek biedt inzicht in ciliafunctie in neurale ontwikkeling.

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

Meer video's verkennen