Extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires

Chemistry

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Summary

Ce travail détaille une méthode étape par étape pour préparer des extraits riches en polyphénols à partir de poudres de baies lyophilisées. En outre, il fournit une description détaillée de la façon d'utiliser ces extraits riches en polyphénols dans la culture cellulaire en présence de l'hormone peptidique angiotensine II (Ang II) à l'aide de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).

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Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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Abstract

Des études épidémiologiques indiquent que l'augmentation de la consommation de flavonoïdes est en corrélation avec la diminution de la mortalité due aux maladies cardiovasculaires (ECV) aux États-Unis (États-Unis) et en Europe. Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont un contenu polyphénolique élevé. On a montré que les polyphénols interagissent avec de nombreuses cibles moléculaires et exercent de nombreuses fonctions biologiques positives, y compris les effets antioxydants, anti-inflammatoires et cardioprotecteurs. Les polyphénols isolés de la mûre (BL), de la framboise (RB) et de la framboise noire (BRB) réduisent le stress oxydatif et la sénescence cellulaire en réponse à l'angiotensine II (Ang II). Ce travail fournit une description détaillée du protocole utilisé pour préparer les extraits de polyphénols à partir de baies lyophilisées. Les extractions de polyphénols à partir de poudre de baies lyophilisées ont été réalisées en utilisant de l'éthanol aqueux à 80% et un procédé d'extraction assisté par ultrasons. L'extrait brut a été encore purifié et fractionné en utilisant du chloroforme et de l'acétate d'éthyle,respectivement. Les effets des extraits bruts et purifiés ont été testés sur des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) en culture.

Introduction

Les polyphénols sont des composés contenant au moins un anneau phénolique dans leur structure et sont abondamment présents dans le règne végétal 1 . Les humains ont consommé des plantes pendant des millénaires à des fins médicales sans connaître l'existence de tels composés 2 . Beaucoup de fruits et légumes ont des composés polyphénoliques partagés, bien qu'avec des quantités différentes, y compris les flavonoïdes, les stilbènes et les acides phénoliques 3 . Bien que les polyphénols soient souvent associés à des fruits et légumes colorés, cela n'est pas strictement vrai. Par exemple, la zéaxanthine et la xanthine sont présentes dans les légumes qui ne sont pas très colorés, comme les oignons et l'ail, qui proviennent de la famille des écrevisses et sont associés à de nombreux avantages pour la santé 4 . En plus d'être associé à plusieurs avantages pour la santé 5 , les polyphénols servent également les plantes en les protégeant des insectes etD rayonnement ultraviolet 2 . Les polyphénols sont couramment présents dans l'alimentation humaine et sont considérés comme des antioxydants puissants, car ils peuvent éliminer les espèces d'oxygène réactif (ROS) 6 , 7 , 8 . Ils ont également des propriétés anti-inflammatoires 9 , antimicrobiennes 10 , anti-hypertensives 11 et anti-cancérogènes 12 , 13 .

Les études épidémiologiques démontrent une association inverse entre la consommation de flavonoïdes et l'incidence des maladies cardiovasculaires (MCV) 16 , 17 et la mortalité 14 , 15 . Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont une grande quantité de polyphénols, y compris les flavonoïdes. Par exemple, la consommation de jus de mûre (BL) (300 ML / d) pendant huit semaines a diminué de manière significative la tension artérielle systolique chez les patients dyslipidémiques 18 . Jeong et al. 19 ont rapporté que les hommes et les femmes pré-hypertendus consommant 2,5 g d'extrait de framboise noire (BRB) par jour avaient une pression artérielle inférieure de 24 h et une nuit par rapport à ceux qui consommaient un placebo. Les framboises (RB) ont diminué la tension artérielle tout en augmentant l'expression de la superoxyde dismutase (SOD) chez les rats spontanément hypertendus 20 . Il a récemment été démontré que BL, RB et BRB réduisent les niveaux de ROS et de sénescence induite par l'angiotensine II (Ang II) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) 21 . De plus, la fraction anthocyanique de l'extrait BL a réduit l'expression de l'oxyde nitrique synthase inducible (iNOS) et a inhibé l'activité du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK) dans le lipopolysaccharide (LPS) - stimulée Cellules J774Ass = "xref"> 22. Les extraits de BRB ont diminué l'activation NF-κB et l'expression de la cyclooxygénase 2 (COX-2) in vitro 23 , amélioré le profil lipidique et empêché la formation de la lésion de l'athérosclérose chez des souris nourries avec un régime riche en matières grasses 24 . Les anthocyanines, qui sont considérées comme les flavonoïdes les plus abondants dans les baies, modulent la réponse inflammatoire dans les macrophages RAW 264.7 stimulés par le LPS en diminuant la production de facteur 25 de nécrose tumorale (TNF-α) 25 et en diminuant la prolifération et la migration des VSMC 26 .

Étant donné qu'il y a eu un intérêt grandissant à comprendre le rôle des polyphénols dans la santé humaine et les maladies, il est important d'optimiser la méthode d'extraction. L'extraction par solvants est largement utilisée à cette fin, car elle est rentable et facilement reproductible. Dans cette étude, une extraction par solvant a été utilisée avec de l'éthanol, avec une extraction assistée par ultrasonsN méthode, qui a été adaptée de Kim et Lee 27 . La purification et le fractionnement des extraits bruts (CE) à l'aide de chloroforme et d'acétate d'éthyle ont été réalisés pour obtenir la fraction d'extrait purifié (PE) adaptée de Queires et al 28 . En outre, on a comparé l'efficacité des extraits de polyphénols bruts versus purifiés de BL pour réduire la phosphorylation basale de ERK1 / 2 et des exemples représentatifs de l'effet inhibiteur de l'extrait de polyphénol BL purifié sur les réductions de signalisation induites par Ang II dans les VSMC ont été fournis.

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Protocol

1. Préparation des réactifs

  1. Préparez 80% d'éthanol (100 mL) en mélangeant 80 mL d'éthanol absolu (biologie moléculaire) et 20 mL d'eau stérile de culture cellulaire.
  2. Pour préparer l'extrait de polyphénol (10 mg / mL), pesez 10 mg de CE ou de PE. Ajouter 1 ml de milieu d'Eagle modifié Modifié Dulbecco (DMEM) sous un capot de culture cellulaire. Vortex la solution. Aliquote dans des portions de 200 μL et stockez à -20 ° C.
  3. Préparer le tampon de lyse.
    1. Ajouter 5 ml d'une solution mère HEPES 1 M (pH 7,4, finale 50 mM), 1 ml d'une solution mère NaCl 5 M (finale 50 mM), 1 ml d'une solution mère EDT 0,5 M (finale 5 mM), 2 ml de 0,5 M NaF stock solution (10 mM finale), 286 μL de solution mère de Na 3 VO 4 700 mM (2 mM de finale), 5 ml d'une solution mère de Na4P2O7 200 mM (10 mM de finale) et 5 ml de 20% de solution mère Triton-X-100 préparée dans l'eau (1% finale). Ajouter de l'eau pour atteindre un volume de 100 ml. Conserver à 4 ° C.
  4. Préparer le tampon d'échantillon de Laemmli (4x).
    1. Ajouter 31,25 ml de solution mère Tris 2 M (pH 6,8), 100 ml de glycerol, 50 ml d'une solution à 20% de sulfate de sodium et de sodium (SDS) préparée dans de l'eau et 50 ml de β-mercaptoéthanol. Ajouter de l'eau jusqu'à 250 ml. Conserver à 4 ° C.
  5. Pour préparer un tampon salin tamponné au Tris (TBS), pesez 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (2,5 mM finale) et 8,76 g de NaCl (150 mM finale). Réglez le pH à 7,4 et ajoutez de l'eau jusqu'à 1 L. Conserver à la température ambiante.
  6. Pour préparer TBS-T, ajouter 997,5 ml de TBS et 2,5 ml d'une solution à 20% de Triton-X-100 préparée dans de l'eau. Garder à la RT.

2. Préparation des extraits de Blackerry

  1. Préparation de l'extrait brut de la poudre de baies lyophilisée.
    1. Peser 10 g de poudre de mûre lyophilisée (ou 5 g de poudre fraîche). Si des fruits surgelés sont utilisés, coupez-leÀ de très petits morceaux avant de commencer l'extraction.
    2. Mélangez la poudre de fruit avec 100 ml d'éthanol aqueux à 80% dans une fiole Erlenmeyer à fond rond de 1 L.
    3. Sonicate le mélange pendant 20 min à 42 kHz, 135 W en utilisant un bain à ultrasons à 25 ° C, sans intervalle de temps entre les deux. Effectuez la sonication avec une purge continue d'azote en lumière modérée. Pour les fruits surgelés, augmenter le temps d'incubation à 4 h.
    4. Filtrer le mélange à travers un papier filtrant n ° 2 à l'aide d'un entonnoir Buchner refroidi avec aspiration sous vide.
      REMARQUE: à la fin de cette étape, les résidus de l'échantillon apparaissent sur le papier filtre; C'est ce qu'on appelle le gâteau de filtre.
    5. Rincer le gâteau de filtration avec 50 ml d'éthanol à 100%. Enregistrer le filtrat et ajouter le gâteau de filtre dans un ballon à fond rond de 1 L contenant 100 ml d'éthanol aqueux à 80%.
    6. Répétez le processus d'extraction du résidu (étapes 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Mélanger les deux filtrats dans un ballon à fond rond avec 50 ml supplémentairesD'éthanol aqueux à 80%.
      REMARQUE: Le volume final devrait être d'environ 300 mL.
    8. Utilisez un évaporateur rotatif à 62 ° C et 50 tr / min pour évaporer le solvant. Continuez ce processus jusqu'à ce que l'éthanol ne s'évapore plus.
      REMARQUE: ce processus dure environ 45 minutes.
    9. Transférer l'échantillon dans un tube conique de 50 ml. Evaporer l'éthanol en injectant de l'azote gazeux au sommet du tube pendant 10 min.
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour assurer l'évaporation complète de l'éthanol. Le volume de l'échantillon à cette étape est d'environ 20 ml.
    10. Geler l'échantillon à -80 ° C pendant au moins 24 h.
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour permettre un processus de lyophilisation plus efficace.
    11. Sécher l'échantillon à -50 ° C pendant environ 8 h. Stockez les échantillons à -20 ° C.
      REMARQUE: Le séchoir à glaçons crée un vide puissant à -50 ° C à l'intérieur de la chambre pour sécher les échantillons mais conserve la plupart des composés, tels que le polypheNols.
  2. Préparation d'extraits de polyphénols purifiés à partir d'extraits bruts.
    1. Peser les échantillons prélevés par lyophilisation.
      REMARQUE: Le volume de l'extrait à cette étape est d'environ 10 mL.
    2. Ajouter deux volumes (~ 20 mL) de chloroforme à l'extrait brut et agiter la solution pendant 5 minutes dans une plaque d'agitation.
    3. Verser le mélange dans un entonnoir de séparation. Laissez l'extrait brut décanter pendant 1 h à la température ambiante pour obtenir la fraction purifiée.
      REMARQUE: à cette étape, un mélange en deux phases se formera.
    4. Jeter la couche inférieure (phase chloroforme) de l'entonnoir de séparation et collecter la couche aqueuse dans un bécher propre.
    5. Ajouter deux volumes d'acétate d'éthyle à la fraction aqueuse et utiliser une barre d'agitation magnétique pour agiter le mélange pendant 5 min à la température ambiante.
    6. Filtrer le mélange à travers du papier filtre n ° 2 à l'aide d'un entonnoir Buchner refroidi avec aspiration sous vide.
    7. Recueillir l'échantillon filtré et le transférer dans un ballon à fond rond pour être nousAvec l'évaporateur rotatif.
    8. Mettre l'évaporateur rotatif à 62 ° C et à 50 tr / min et évaporer l'acétate d'éthyle pendant environ 30 minutes.
    9. Sécher l'échantillon à -50 ° C pendant environ 8 h. Transférer l'échantillon dans un tube conique de 50 ml et le conserver à -20 ° C.

3. Traitement des VSMC avec des extraits de baies

  1. La culture des VSMC.
    1. Isoler les VSMC des aortas thoraciques des rats Sprague-Dawley en effectuant une digestion enzymatique, comme décrit précédemment 29 . Culturez les VSMC comme décrit 29 .
    2. Préparer un milieu complet pour la culture de VSMC en utilisant du DMEM contenant 1 g / L de glucose et supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / mL de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Conserver le milieu complet à 4 ° C.
  2. Incubation de VSMC avec des extraits de polyphénols.
    1. Pour diviser les VSMC, jeter le cultuRe medium et lave les cellules deux fois avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 4 mL de PBS et 2 mL de trypsine EDTA 0,25%. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur de CO 2 .
      1. Recueillir les cellules, les mélanger avec 2 ml de milieu complet dans un tube de centrifugation de 15 ml et centrifuger à 1 100 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de PBS. Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre.
      2. Graine 50 000 VSMC par puits dans des plaques de culture à 6 puits et développez-les en milieu complet contenant 10% de FBS jusqu'à atteindre 90% de confluence (environ 3 jours). Maintenir les VSMC à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 .
    2. Préparer le milieu pour le traitement en utilisant un milieu DMEM contenant 1 g / L de glucose, 100 U / mL de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,5% de FBS. Conserver le milieu de traitement à 4 ° C.
      REMARQUE: Les extraits de polyphénols et Ang II sont ajoutés directement aux cellules en utilisant ce moiDium.
    3. Préparez une solution mère d'extrait brut (CE) de 10 mg / ml ou d'extrait purifié (PE) de polyphénols en dissolvant 10 mg d'extrait dans 1 mL de milieu DMEM ordinaire. Conserver le stock dans des aliquotes de 200 μL à -20 ° C.
    4. Incuber les VSMC avec 2 mL de milieu de traitement contenant 0,5% de FBS et ajouter des extraits CE ou PE pour obtenir une concentration de 50 à 500 μg / mL. Changer le milieu toutes les 24 h en ajoutant des extraits de polyphénols frais. Traiter les cellules pendant 3 jours.
    5. Pour le traitement avec Ang II ou d'autres hormones et facteurs de croissance, affamer les cellules pendant au moins 24 h en incubant les cellules avec un milieu de traitement contenant 0,5% de FBS avant l'addition d'Ang II (100 nM).
      NOTE: L'incubation avec et sans CE et PE dans un milieu de traitement FBS à 0,5% avant l'addition d'Ang II est recommandée.
      1. Après 24 h de famine, ajouter 100 nM Ang II. Remplacez le milieu de traitement par CE, PE ou Ang II frais toutes les 24 h pendant 3 jours.
  3. Préparation des échantillons de cellules.
    1. Lavez les cellules traitées deux fois dans du PBS froid et lysez-les avec 200 μL de tampon de lyse sur de la glace.
    2. Recueillir des lysats cellulaires à l'aide de grattoirs cellulaires et transférer les lysats dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Incuber les lysats cellulaires totaux pendant 20 min sur de la glace et du vortex toutes les 5 min.
    3. Sonicate les extraits de cellules avec trois rafales à 125 W pendant 10 s chacune, avec une pause de 2 s entre les deux. Gardez les échantillons sur de la glace tout au long de la sonication.
    4. Mesurer la concentration de protéines en utilisant un réactif de dosage de protéines à 595 nm.
    5. Conservez les échantillons à -20 ° C pour analyse par Western blot.
  4. Western blot.
    1. Mélanger des quantités égales de protéines (environ 50 μg) à partir d'échantillons traités non traités et traités avec des polyphénols ou Ang II avec un tampon de lyse pour obtenir un volume total maximal de 50 μL. Ajouter 16 μL d'un tampon d'échantillon 4x Laemmli. Chauffer les échantillons pendant 5 min à 75 ° C.
    2. Séparer l'échantillonnageEs dans 10% de gels SDS-PAGE et les transférer dans des membranes PDVF à 10 V pendant 75 minutes dans un système de transfert semi-sec pour une analyse Western Blot avec des anticorps spécifiques.
    3. Bloquer la membrane avec 2% de lait dans du tampon Triton-X100 à 0,05% de TBS (TBS-T) pendant 20 minutes.
    4. Retirer le lait en lavant la membrane au moins trois fois avec du TBS (5 min chacun) et incuber avec des anticorps primaires pendant 1 h à TA ou O / N à 4 ° C.
    5. Laver la membrane trois fois, 10 min chacune, avec TBS-T et incuber avec un anticorps secondaire lié à HRP pendant 45 minutes.
    6. Laver la membrane trois fois, 10 min chacune, avec TBS-T et se développer par une chimioluminescence améliorée (ECL).

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Representative Results

On a déjà démontré que les extraits de polyphénols isolés de BL, RB et BRB réduisaient la sénescence des VSMC en réponse à Ang II 21 . Il a été démontré que ces extraits de polyphénols purifiés modulent la signalisation Ang II en réduisant la phosphorylation d'Akt, de la protéine Kinase Activée par Mitogen (MAPK) et de l'ERK1 / 2. BL empêche la sénescence en réduisant l'expression de la NADPH oxydase (Nox) 1, une enzyme qui produit des anions superoxyde et est fortement régulée par Ang II. En revanche, RB et BRB empêchent la sénescence par un mécanisme indépendant de Nox1, car ils augmentent l'expression des enzymes antioxydantes SOD1, SOD2 et glutathion peroxydase 1 (GPx-1). BL ne parvient pas à augmenter l'expression de la SOD2, alors qu'aucun des extraits n'atténue la régulation négative de la catalase par Ang II 21 . BL a été concentré sur pour déterminer si le manque d'effet de BL sur l'expression de SOD2 et de catalase pourraitS'expliquer par une perte de composés de polyphénols pendant le processus de purification ou par une concentration insuffisante d'un certain composé polyphénolique dans l'extrait. Les VSMC ont été incubées avec 50-500 μg / mL de CE ( Figure 1A ) ou PE ( Figure 1B ) dans un milieu contenant 0,5% de FBS pendant trois jours. Ni CE ni PE ont augmenté les niveaux de SOD2 ou de catalase à l'une des concentrations testées. En tant que témoin positif, la phosphorylation ERK1 / 2 a été mesurée et il a été constaté que CE a réduit la phosphorylation de cette kinase à des concentrations supérieures à 300 μg / mL. En revanche, le PE était efficace à environ 100 μg / mL ( figure 1B ). De faibles taux de phosphorylation ont été observés à des concentrations de 200-500 μg / mL. Ces données prennent en charge l'observation précédente montrant que 200 μg / mL BL PE est suffisant pour réduire la signalisation Ang II 21 . Ces résultats suggèrent que des concentrations plus élevées de polyphénol cOmpounds dans PE, par rapport à CE, pourrait expliquer l'efficacité plus élevée de cet extrait à la réduction de la phosphorylation ERK1 / 2. Pour tester cette idée, on a comparé les compositions de polyphénols des deux extraits. L'identification et la quantification des composés de polyphénols dans CE ont été effectuées par HPLC, comme décrit précédemment 21 ( tableau 1 ). L'acide o- aqueffeoylquinique et la quercétine ont été présents à des niveaux supérieurs en PE par rapport à CE, tandis que l'acide ferulique et la rutine ont été retrouvés uniquement en CE. Ensuite, les VSMC ont été traités avec 200 μg / mL de BL PE pendant 24 h avant l'addition de 100 nM d'Ang II ( Figure 1C ). Comme indiqué précédemment 21 , l'extrait de polyphénol BL a réduit la phosphorylation ERK1 / 2 induite par Ang II mais n'a démontré aucun effet sur l'expression de catalase et de SOD2.

Figure 1
B ) ou de 200 μg / mL de PE ( C ) en 0,5 % De milieu DMEM FBS pour 3 jours. C ) Après 24 h d'incubation avec BL PE, on a ajouté Ang II (100 nM) et on a incubé les cellules pendant 3 jours. Le moyen, avec des extraits frais et Ang II, a été changé tous les jours. Les cellules ont ensuite été lavées et lysées, et les extraits cellulaires totaux ont été séparés dans des gels PAGE-SDS à 10%. Les transferts de Western ont été testés avec des anticorps de lapin contre ERK1 / 2 phosphorylé (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, catalase et SOD2 et anticorps de souris contre la β-actine. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Analytes (ppm) PE CE
Les acides phénoliques
acide gallique 243,5 321,9
Acide p-coumarique 32,9 46,5
Acide ferulique - 236,5
Acides chlorogènes
Acide 3-O-caffeoylquinique 235.3 170,5
Acide 4-O-caffeoylquinique 13 76,9
Acide 5-O-caffeoylquinique 14.1 49,9
FLAVONOIDES
Flavonols
La quercétine 95 24,5
Flavanones
Rutine - 37,8

Tableau 1: Analyse de la composition de polyphénols de mûre dans des extraits purifiés et polyphénols purifiés. Les acides phénoliques et les flavonoïdes dans l'extrait brut (CE) et l'extrait purifié (PE) ont été analysés à l'aide de la chromatographie liquide haute performance (HPLC). La concentration des analytes est exprimée en ppm. La composition des polyphénols dans BL PE a récemment été publiée 21 et ajoutée à la table pour être comparée à CE.

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Discussion

Les polyphénols isolés des baies contiennent des compositions distinctes. Le protocole d'extraction à base d'éthanol décrit ici a permis d'identifier différents niveaux d'acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans des extraits de polyphénols bruts et purifiés de BL ( Tableau 1 ). CE a été enrichi en acide gallic, en acide ferulique, en acide 4-O-caffeoylquinique et en acide 5-O-caffeoylquinique. Le processus de purification n'a pas modifié de manière significative les niveaux d'acide gallic et d'acide p-coumarique. Cependant, il a augmenté les niveaux d'acide otoxylique de 3- O à partir de 170,5 à 235,3 ppm et de quercétine de 24,5 à 95 ppm. En revanche, l'acide ferulique et la rutine ont été perdus lors de la purification de CE.

Le traitement des VSMC avec 50 à 500 μg / mL CE et PE a montré que les deux extraits étaient efficaces pour réduire la phosphorylation basale de ERK1 / 2. Cependant, PE a montré une régulation négative plus forte dans l'activité de cette kinase à une concentration inférieure: 100 et #181; g / mL pour PE comparativement à 400 - 500 μg / mL pour CE. Ces résultats peuvent refléter la concentration plus élevée d'acide otoxylique de 3- O ou de quercétine dans l'EP. L'utilisation de composés phénoliques individuels dans les cellules en culture est nécessaire pour identifier le (s) composé (s) spécifique (s) responsable (s) de la dégradation de la phosphorylation ERK1 / 2.

L'activité diminuée de la signalisation des kinases, y compris Akt, ERK1 / 2 et p38MAPK, causée par des polyphénols purifiés isolés de BL, RB et BRB 21 , ainsi que de ERK1 / 2 provoquée par BL CE, montrée ici, est en accord avec Rapports précédents. Par exemple, les extraits de polyphénols isolés à partir de myrtille ont diminué la croissance tumorale des cellules cancéreuses mammaires, en partie en réduisant l'activité d'Akt et ERK1 / 2 30 . Comme mentionné précédemment, ces kinases sont également impliquées dans l'induction de la sénescence cellulaire par Ang II 21 , ce qui suggère que les polyphénols de BL, RB et BRB shoulD réduire le vieillissement vasculaire et le dysfonctionnement associé aux MCV.

Comme nous l'avons déjà signalé 21 , l'expression de la catalase et de la SOD2 n'a pas été régulée à la hausse par l'EP, même à des concentrations aussi élevées que 500 μg / mL. Étant donné que la CE était également inefficace à l'augmentation de l'expression de la catalase et de la SOD2, ces données suggèrent que les composés phénoliques perdus pendant le protocole de purification ne sont pas impliqués dans la régulation de ces enzymes antioxydantes. Ces données suggèrent également que le protocole de purification a montré ici des composés phénoliques concentrés efficacement pertinents à la régulation de la signalisation Ang II, du stress oxydatif et de la sénescence cellulaire. Par exemple, les résultats représentatifs montrent que la phosphorylation ERK1 / 2 induite par Ang II a fortement régressé négativement. L'évaluation de la phosphorylation de cette kinase est pertinente car l'inhibition de l'activité ERK1 / 2 a empêché la sénescence cellulaire induite par Ang II 21 .

En tDes modifications apportées aux protocoles précédents, une sonication a été ajoutée ici pour augmenter le rendement d'extraction pour CE. En outre, pour la purification des polyphénols, au lieu d'utiliser une cartouche C18, comme l'ont décrit Kim et Lee 27 , une méthode plus traditionnelle de Queires et al . 28 a été adopté ici. Une étape de filtration, en utilisant du papier filtre pour éliminer les impuretés, a été ajoutée à la purification de la section des polyphénols. En termes de limites, les étapes de sonication et d'évaporation doivent être soigneusement surveillées en fonction du type d'instrument utilisé, car la durée et la température de la sonication et de l'évaporation sont les étapes critiques de ce protocole. Les modifications ajoutées à cette méthode ont entraîné le rendement le plus élevé des polyphénols par rapport aux méthodes précédentes 27 , 28 utilisées dans notre laboratoire (données non présentées), probablement en raison de l'addition d'une étape de sonication. Comme mentiDans la section du protocole, ce protocole peut être utilisé pour la poudre lyophilisée de diverses baies, ainsi que pour les fruits surgelés. Cette méthode a été utilisée avec succès pour extraire et purifier les polyphénols des framboises et des framboises noires 21 , ainsi que des myrtilles et des fraises (données non présentées). Ainsi, cette méthode pourrait également être utilisée pour extraire des polyphénols d'autres types d'aliments, y compris les légumes.

En conclusion, ce travail décrit une méthode rapide, rentable et facilement reproductible pour isoler les polyphénols des baies, ce qui permet la rétention et la concentration des composés qui protègent contre le stress oxydatif dans les VSMC.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par l'American Heart Association (14GRNT20180028) et le Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

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