N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

Bioengineering

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Summary

Sialic acid는 전형적인 단 당 류 단위 glycoconjugates에서 발견입니다. 그것은 분자 및 세포 상호 작용의 과다에 관여. 여기 우리가 N-acetylmannosamine 유도체와 대사 glycoengineering를 사용 하 여 셀 표면 sialic 산 식을 수정 하는 방법을 제시.

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Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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Abstract

Sialic acid (Sia) glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 매우 중요 한 구성입니다. 올리고-및 다 당 류, 뿐만 아니라 독특한 화학 특성의 비 감소 테르미니에서 그것의 위치 때문 sialic acid는 다른 수용 체 ligand 상호 작용의 무리에 포함 된다. 세포 표면에 sialic acid의 식을 수정 하 여 sialic acid 종속 상호 작용 따라서 좌우 될. 이 sialic acid 종속 상호 작용을 조사 하는 데 도움이 될 수 있습니다 하 고 유익한 방식으로 특정 질병에 영향을 미칠 가능성이 있다. 신진 대사 glycoengineering (MGE)을 통해 세포 표면에 sialic acid의 식이 변조 수 있습니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 전체 동물 N-acetylmannosamine (ManNAc)의 파생 상품 c 2 수정 처리 됩니다. 이러한 아미노 설탕 sialic 산 성 선구자 분자 역할 따라서는 해당 sialic acid 종 대사와 glycoconjugates에 표현. 이 방법을 적용 다양 한 생물학 과정에 흥미로운 효과 생성 합니다. 예, 그것은 치료 신경 세포에 있는 polysialic 산 (polySia)의 식을 획기적으로 줄일 수 있다 고 따라서 신경 성장과 분화에 영향을 줍니다. 자, 우리 N-butanoylmannosamine (ManNBut), 뿐만 아니라 가장 일반적인 C2 수정 N-acylmannosamine 유도체, N-propionylmannosamine (ManNProp)의 2의 화학 합성을 보여 더 보여 어떻게이 아닌 자연 아미노 설탕은 세포 배양 실험에 적용할 수 있습니다. 수정된 sialic acid 종의 식 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 계량 하 고 더욱더 질량 분석을 통해 분석. Polysialic 산 식에 대 한 효과 서쪽 오 점 상용 polysialic 산 성 항 체를 사용 하 여 통해 해명.

Introduction

Sialic acid glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 비 감소 테르미니에서 일반적으로 찾을 수 있는 단 당 류 이다. 모든 단 중 sialic acid는 몇 가지 독특한 화학 특성이 있다. 9 C 원자 백본, deprotonated 이며 그로 인하여 부정 청구에서 생리 적 조건, C-1 위치에 carboxylic 그룹 및 아미노 기능 C-5 위치에 있다. 날짜1, 자연스럽 게 sialic acid의 변종 발생 50 이상 성격 되었습니다 sialic acid 인간에서 발견의 주된 형태는 N-acetylneuraminic 산 (Neu5Ac). 다른 포유동물은 또한 N-glycolylneuraminic 산 (Neu5Gc)2,3의 더 높은 금액을 표현 한다.

Glycoconjugates, 노출된 위치로 인해 sialic acid 수용 체 ligand 상호 작용의 과다 한 예를 들어, 호스트 셀4인플루엔자 바이러스의 조류 종속 바인딩 포함 된다. 중요 한 생물 학적 기능, 특히 embryogenesis 동안와 신 경계에 sialic acid epitope polysialic 산 이다. Polysialic 산 최대 200 알파 2, 8-연결 sialic 아미노산의 중합체 이다. Polysialic 산의 주요 단백질 캐리어는 신경 세포 접착 분자 (여). Polysialic 산 식 polysialic 산 식 접착을 감소 하 고 신 경계5가 소성을 증가 보안의 접착제 속성을 조절 한다.

변화 (폴 리) sialic acid의 식에서 궁극적으로 여러 다른 생물 학적 상호 작용을 영향을 줍니다. 이 알려진된 sialic acid 종속 프로세스 밝히기 소설 glycoconjugate 상호 작용, 또는 가능한 치료 방법 탐구를 분자 수준에서 연구를 사용할 수 있습니다. 다른 방법이 있다 사용할 수 있는 세포 표면에 sialic acid의 표현을 변조 수, sialic acid 특정 glycosidases (sialidases),6 sialic 산 생 합성에 관련 된 효소의 억제와 치료 예 ,7,8또는 노크 하거나 sialic 산 생 합성9의 주요 효소의 표현 변경.

또 다른 다재 다능 한 sialic acid 식 변조 하 방법은 MGE (일컬어 대사 처리한후 공학, 모에)입니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 동물 아닌 자연의 파생 상품 ManNAc는 c 2-아미노 수정 처리 됩니다. 세포질 통풍 관 후 sialic acid에 대 한 선구자 분자 이기 때문에, 이러한 ManNAc 아날로그 단방향 비 자연적인 대사 sialic 산 이며 sialylated glycoconjugates에 표현 될 수 있습니다. 와 같은 ManNProp 또는 ManNBut, N-propionylneuraminic 산 (Neu5Prop) 또는 그들의 glycoconjugates10 N-butanoylneuraminic 산 (Neu5But)를 통합 할 셀 들고 지방 족 C2-수정, ManNAc 유도체로 치료 , 11. ManNAc의 C2 위치에 도입 하는 기능적인 그룹을 사용 하 여 발생 비 자연적인 sialic 산 결합 될 수 있다, 예를 들어, Staudinger 결 찰 이나 아 지 드 alkine cycloaddition 형광 염료를 통해 따라서 12셀 표면 시각.

이러한 비 자연적인 sialic이 표현 병원 체 감염, 접착 및 종양 세포, 일반 세포 접착으로 vascularization와 차별화 (검토를 위해의 마이그레이션 등 많은 생물 학적 과정에 흥미로운 효과가 참조: Wratil 외. 13). 흥미롭게도, MGE n-acyl 수정 mannosamines polysialic 산의 표현에 방해가 사용할 수 있습니다. Polysialic 산 (ST8SiaII 및 ST8SiaIV) 두 개의 서로 다른 polysialyltransferases에 의해 생성 됩니다. 그것은 입증 되었습니다, 그 polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp 또는 ManNBut,1415등 부자연 스러운 sialic acid 선구자에 의해 저해. 또한, 그것은 증명 되었습니다 인간의 신경 세포에서 ManNProp 또는 ManNBut 응용 프로그램 또한 총15sialylation를 감소 시킨다.

MGE n-acyl 수정 mannosamines는 성공적으로, 뿐만 아니라 포유류와 꼬마 선 충16, 같은 다른 종족의 전체 동물에 뿐만 아니라 박테리아 세포 배양에 사용 된 메서드를 적용 하 게 쉬운 zebrafish17또는 쥐18,19,,2021. 특히 ManNAc 파생 상품 지방 족 수정, ManNProp 및 ManNBut, 포함 한 베어링은 사소, 셀 문화 매체 또는 혈액 플라스마 millimolar 농도 에서도 세포 독성. 또한, 그들은 비교적 쉽게 합성 하기입니다.

여기, 우리는 nMGE를 사용 하는 방법에 세부 정보를 제공-틸 수정 mannosamines. 첫째, ManNProp 및 ManNBut,이 분야에서 가장 널리 사용 되는 ManNAc 파생 상품의 2의 화학 합성은 설명 했다. 다음으로, 우리는 어떻게 MGE vivo에서 실험에 적용할 수 보여줍니다. 예를 들어, 신경 세포 선 켈리 선정 되었다 polysialic epitope의 감소 식 보여 서양 오 점 ManNAc 유도체 치료 후. 세포 표면에 비 자연 sialic 산 HPLC로 정량 이었고 더 질량 분석을 통해 분석.

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Protocol

1입니다. 버퍼 및 시 약의 준비

  1. 3mm 나트륨 methoxide 솔루션의 준비
    1. 8.1 mg 나트륨 methoxide 메탄올 50 mL (3 m m)에 저 어 바 100 mL 유리 용기에 녹. 몇 주 동안 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
  2. Tris HCl 버퍼의 준비
    1. 저 어 바 8.766 g NaCl, 157 mg Tris HCl 및 146 mg 100 mL 유리병에 EDTA 결합 하 고 80 mL 물에 용 해.
    2. PH-미터, pH를 관찰 하는 동안 교 반 솔루션을 수산화 나트륨 (1 M, 물) 또는 HCl (20%, 물)를 추가 하 고 pH 8.0에 조정.
    3. 물 100 mL의 최종 볼륨을 달성 하는 데 필요한 볼륨을 추가 합니다. 0.22 μ m 살 균 필터 시스템을 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
      참고: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl 및 5 mM EDTA (pH 8.0) 100 mL Tris HCl 버퍼 포함 됩니다. 솔루션 4 ° C에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.
  3. Aprotinin 솔루션의 준비
    1. 1 mL 물 (1.54 m m)에 10 mg aprotinin 디졸브. 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 (100 µ L 각) x 10에 aprotinin 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.
  4. Leupeptin 솔루션의 준비
    1. 2 물 (10 m m)에 10 mg leupeptin 분해. 약 leupeptin 솔루션 수 10 mL-플라스틱 튜브 1.5 배. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.
  5. Phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 솔루션의 준비
    1. 2 mL 에탄올 (100 mM)에 34.8 mg PMSF 디졸브. 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 x 10에서 PMSF 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.
  6. 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) 솔루션의 준비
    1. 15.62 mg DMB, 352 µ L β-mercaptoethanol, 및 48 µ L 나트륨 중 아 황산 염-솔루션 (39%), 결합 하 고 추가 9.6 mL 물 (6.9 m DMB m, 500 m m β-mercaptoethanol, 그리고 0.19% 나트륨 중 아 황산 염). 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 (250 µ L 각) x 40에서 DMB 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 빛에서 보호 하는 상점.
  7. 1 M trifluoroacetic 산 (TFA) 솔루션의 준비
    1. 100%의 770.3 µ L 추가 TFA 9.23 물 15 mL 플라스틱 튜브 (1 M)에. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.
  8. 120mm TFA 솔루션의 준비
    1. 9.91 물 (120mm) 15 mL에 플라스틱 튜브를 92.4 µ L TFA (100%)를 추가 합니다. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.
  9. 400 m m 수산화 나트륨 (NaOH) 용액의 준비
    1. 160 mg 10 mL 물 (400mm) 15 mL에 플라스틱 튜브에 NaOH를 분해. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.
  10. 서쪽 오 점 세포의 용 해 버퍼의 준비
    1. 분해 5.84 g NaCl, 0.1 g 트리 (hydroxymethyl)-aminomethan (트리 스), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2, 100ml에 1 g 트리톤 X100 물 및 7.8에 pH를 조정. 4 ° c.에 게 세포의 용 해 버퍼 사용 하기 전에 각 protease 억제제 (aprotinin, leupeptin, 및 PMSF)의 100 µ L를 추가 합니다.
  11. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 버퍼의 준비
    1. 0.3 g 트리 스, 1.5 g 글리신, 그리고 0.1 g SDS 물 100 mL에에서 녹이 고 pH 7.3 조정. 실시간에 저장소
  12. 서쪽 오 점 버퍼의 준비
    1. 0.3 g 트리 스, 1.1 g 글리신 물 90 mL에에서 녹이 고 에탄올 10 mL을 추가. 실시간에 저장소
  13. 차단 하는 솔루션의 준비
    1. 1 g 25 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 지방 무료로 우유 힘의 분해. 항상 신선한 준비.

2. 합성 ManNProp 및 관련된 N-acyl-Mannosamines를 수정

  1. 저 어 바 50 mL 유리 용기에 10 mL 3 m m 나트륨 methoxide 솔루션에서 431.2 mg mannosamine 염 산 염을 분해.
  2. 차가운 얼음 0 ° c에 혼합물 감동적인 솔루션에 천천히 dropwise 210 µ L propionyl 염화 (2.4 mmol), 또는 합성 ManNProp 또는 ManNBut, 각각 248 µ L butanoyl 염화 (2.4 mmol)를 추가 합니다. 4 h 0 ° C에서 교 반 혼합 품 어.
  3. 솔루션 50 mL 플라스틱 튜브로 전송 합니다. 얇은 바늘으로 플라스틱 튜브의 뚜껑으로 4-8 구멍을 찌른. 액체 질소를 사용 하 여 솔루션을 급속 동결 하 고 이후 (동결 건조) lyophilize 48 h 또는 그것은 완전히 건조 될 때까지 그것.
  4. 750 mL 에틸-아세테이트/메탄올/물 (15:2:1) (이 서 스 펜 션) 믹스 350 g 실리 카 젤 60. 실리 카 젤 60 서 스 펜 션 유리 열 (35 m m 직경 70 cm 길이)를 사용 하기 전에 추가 100 mL 에틸-아세테이트/메탄올/물으로 (15:2:1) 준비 열을 씻어.
  5. 2.3 단계에서 말린된 제품 분해 (5 g 건조 제품) 10ml 에틸-아세테이트/메탄올/물 (15:2:1) 및 부하에는 실리 카에 피 펫을 사용 하 여 열 젤. (ManNProp)에 대 한 후 500 mL 4 mL 분수를 수집 합니다. 참고: ManNBut 약 700 mL 후 열에서 elute 것입니다.
  6. 15 mL 플라스틱 튜브에 eluted 분수를 전송 합니다. 3-6 구멍 플라스틱 튜브의 뚜껑에 얇은 바늘 찌른. 빠른 액체 질소를 사용 하 여 솔루션을 동결 하 고 이후 그것은 완전히 건조 될 때까지 lyophilize.
    참고: 동결 건조 된 제품 실시간에 몇 달 동안 저장 될 수 있다
  7. 질량 분석 (섹션 9 참조) 하 여 제품의 순도 확인 합니다.
    참고: 또는, 순도 확인할 수 있습니다 1H 핵 자기 공명 (NMR).

3. 세포 배양

  1. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 U 페니실린, 100 mg 스, 37 ° C, 5% CO2에서 2 mM L-글루타민 포함 5 m ManNAc m, 5 m ManNProp, m 또는 5 mM ManNBut, 포함 된 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 문화 켈리 신경 세포.
    참고: ManNAc 또는 그것의 아날로그 매체에 경작 하는 세포는 컨트롤로 사용 됩니다.
  2. 전에 mannosamines의 응용 프로그램, 트립 신/EDTA (0.25%, PBS에서 0.02%)와 10 분 동안 그들을 배양 하 여 켈리 신경 세포를 분리 하 고 Neubauer 챔버 또는 셀 카운터를 사용 하 여 계산 합니다. 시드 플레이트/접시의 크기에 따라 정의 된 숫자에서 셀입니다.
    1. 측정 sialic 산 단, 48-잘 조직 문화 접시에 500 µ L 매체에 1 x 105 셀을 씨. Polysialic 산의 분석에 대 한 1 x 106 셀 6 cm 직경 셀 문화 접시에 3 mL 매체에 씨. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 매체 마다 24 h를 교체 합니다.
      참고: MGE의 효과 치료의 총 시간으로 증가합니다. 높은 신진 대사 효율을 위한 5-7 일에 대 한 셀을 취급 합니다.
  3. 치료 후, 매체를 가만히 따르다. PBS 가진 접시/접시를 씻어. 트립 신/EDTA (0.25%, PBS에서 0.02%)와 10 분 동안 그들을 배양 하 여 세포를 분리 합니다. 분리 된 세포에 세포 배양 매체의 동일한 볼륨을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 15 mL 플라스틱 튜브로 분리 된 세포를 전송 합니다. 원심 500g x 3 분에 대 한 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
    1. 5 mL PBS와 원심 분리기 세포 (단계 3.3 참조)을 추가 합니다. 두 번 더 세척 절차를 반복 합니다.
      참고: 상쾌한 없이 씻어 셀 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 몇 일 동안. Polysialic 산의 식 해명 될 것입니다 섹션 10 계속.

4. HPLC 분석을 위한 세포 세포의 용 해

  1. HPLC 세포의 용 해 버퍼의 준비
    1. 5 mL Tris HCl 버퍼, 5 µ L aprotinin 솔루션, 20 µ L leupeptin 솔루션 및 50 µ L PMSF 솔루션을 결합 합니다.
      참고: 5 mL HPLC 세포의 용 해 버퍼 150 m m NaCl, 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 1.54 μ M aprotinin, 40 µ M 포함 됩니다 Leupeptin, 및 1 밀리미터 PMSF (pH 8.0). 이 버퍼 항상 신선한 세포 세포의 용 해 전에 대비해 야.
  2. 다시 500 µ L 얼음 HPLC 세포-버퍼에 수집 된 셀 펠 릿 (단계 3.3) 각을 일시 중단 하 고 울트라-sonicate 샘플 초음파 프로세서 바늘 3 시간 동안 30의 중간-높은 진폭에서 s. 주기 사이 적어도 1 분 동안 얼음에 샘플 멋진.

5입니다. 분리 막 분수의

  1. 2 h g와 4 ° C x 20000에 대 한 lysed 세포 샘플을 원심 상쾌한 (약 480 µ L), 1.5 mL 플라스틱 튜브에 있는 cytosolic 단백질 대표를 구분 합니다. 이 분수를 사용 하 여, 예를 들어는 브래드 퍼 드 또는 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과의 단백질 농도 결정 합니다.
    참고: cytosolic 분수의 단백질 농도 (약 1 mg/mL) 나중에 존경 받는 sialic acid 종의 양이 측정된 연관 될 수 있습니다. 펠 릿 단계 6.1에서에서 사용 되는 막 비율을 나타냅니다.

6. 산 성 가수분해

참고: 올리고-및 다 당 류는 세포 막에 단을 분해. 또한, 가능한 O-는 단에서 수정, 또한 분해는. 이 양적 HPLC 분석에 필요한 막 분수에 sialic 산의 압도적 glycoconjugates에 자연스럽 게 통합 됩니다 이며 O부담 가능성이 있습니다 때문-틸 또는 O-lactolyl 수정.

  1. 150 µ 1 M L 추가 TFA-솔루션 분리 막 분수 (섹션 5에서에서 펠 릿). 200-600 rpm에서 떨고와 80 ° C에서 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
  2. 20000 x g와 상위 단계 볼륨은 20 µ L까지 3 kDa 제외 멤브레인과 0.5 mL 필터 튜브를 사용 하 여 21 ° C에서 약 30 분 동안 샘플 원심
    참고:이 단계는 높은 분자 파편을 처분 하는 것이 중요.
  3. 2 mL 플라스틱 튜브에 sialic acid 종을 포함 하 여 작은 분자를 포함 하는 낮은 단계를 전송 합니다. 얇은 바늘으로 구멍을 2-4 플라스틱 튜브의 뚜껑에 구멍. 빠른 액체 질소를 사용 하 여 샘플을 동결 하 고 하룻밤 사이 그들을 lyophilize.
    참고: 말린된 견본 저장을 위해 실시간 바꾸기 구멍 없이 모자에 며칠 동안 저장할 수 있습니다.

7. 형광 라벨

  1. 다시 10 µ L 120 m m TFA 솔루션에서 말린된 견본을 일시 중단 하 고 50 µ L DMB 솔루션을 추가 합니다. 자외선 으로부터 보호 하기 위해 어두운 1.5 mL 튜브에 샘플을 전송 합니다.
  2. 표준, 디졸브 1 µ L Neu5Ac (60 ng/mL, 물에서) 또는 1 µ L Neu5Gc (60 ng/mL, 물에) 어두운 1.5 mL 튜브에 10 µ L 120 m m TFA 솔루션에서. 50 µ L DMB 솔루션을 추가 합니다.
  3. 세포 막 샘플을 품 어와 56 ° C에서 1.5 h에 대 한 표준 빛에서 보호. 부 화, 후 라벨 반응을 중지를 각 샘플을 4 µ L 400 m m NaOH 솔루션을 추가 합니다.

8. HPLC 분석

참고: 레이블된 샘플 C18 RP 열을 갖춘 HPLC 시스템에 분석 (110 Å, 3 µ m 입자 크기, 4.6 x 150 m m), 형광 검출기, 그리고 분수 수집. 사용 하는 용 매는 메탄올, 이기, 그리고 물 있습니다. HPLC 시스템 내부 degasser를 결여 하는 경우는 측정 전에 모든 용 매를 드 되었는지 확인 합니다.

  1. 열 온도 40 ° C를 설정 하 고 373와 형광 검출기를 구성 구동 및 448 nm nm 방출에 대 한 각각. 10 µ L 샘플 볼륨을 주입 하 고 메탄올/이기/물 (6:8:86)는 eluent으로 0.5 mL/min 흐름 속도로 50 분에 대 한 프로브를 분리. 질량 분석 분석에 대 한 관심의 봉우리를 수집 합니다.
    참고: Neu5Gc 6-8 분, 9-12 분, 17-23 분 후 Neu5Prop와 38-44 분 후 Neu5But 후 Neu5Ac 후 eluate을 예정 이다. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 여러 h에 대 한 분류 한 샘플을 저장할 수 있습니다.
  2. 각 샘플을 측정 한 후 1.0 mL/min 유량 (≈ 1.5 열 볼륨) 메탄올/이기/물 (6:25:69)에서 7.5 분에 대 한 열을 세척 하 고 다시 메탄올/이기/물 (6:8:86)로 1.0 mL/min 흐름 속도로 7.5 분에 대 한 시스템을 equilibrate.
  3. 정량 분석을 위해22각각 HPLC 시스템 운영 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 sialic 산 봉우리의 곡선 아래의 영역을 계산 합니다.
    참고: cytosolic 분수 (섹션 5.1 참조)에 측정 된 단백질 농도 Neu5Ac 또는 Neu5Gc 표준을 얻은 데이터 관련 될 수 있습니다.

9. 질량 분석 분석 Sialic 산 단

참고: 관심의 HPLC 보존 봉우리 분석할 수 있습니다 추가 액체 크로마토그래피 (LC) 분무 이온화 질량 분석 (MS ESI)에 의해 부자연 스러운 sialic acid 종 확인.

  1. 질량 분석 분석을 위해 수집 된 샘플의 20 µ L에 주입 LC/대량 선택적인 검출기 (MSD) 시스템 79.9% 메탄올, 20% 이소프로필 알콜, 및 0.1% 개미 산 성 eluent, 0.5 mL/min 유량, 4 kV 모 세관 전압, 및 모 세관 온도 350 ° C 22 , 23.
  2. 해당 하는 LC/엠 시스템의 평가 소프트웨어에서 총 이온 크로마의 피크를 선택 합니다. 확인 된 피크의 질량 스펙트럼 보기 300과 700 사이의 긍정적인 질량/전 비를 표시 합니다.
    참고: DMB sialic 산의 라벨 116.2 g/mol의 분자 질량에 있는 증가에 지도 한다. DMB 라는 sialic acid 종가지고 다음 분자 질량: DMB Neu5Ac 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g = mol. 공통 adducts/이기, 나트륨, 또는 소 프로필 알코올.

10. 서쪽 오 점 분석 켈리 신경 세포에 Polysialic 산의

  1. 세포 lysates의 준비
    1. 3.3 단계 및 소용돌이에서 셀 펠 릿을 1 mL 서쪽 오 점 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 얼음에 30 분 동안 품 어. 5 분 마다 소용돌이입니다. 1.5 h g와 4 ° C x 20000에 대 한 샘플을 원심 Lysed 세포에서 단백질을 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
    2. 단백질 분수, 예를 들어,는 브래드 퍼 드 또는 BCA 분석 결과의 단백질 농도 결정 합니다. 세포의 용 해 버퍼에서 µ 1.5 µ g/L의 단백질 농도에 샘플을 희석.
    3. 90 µ L 단백질 분수 (1.5 µ g / µ L) 10 µ L Laemmli 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 하 고 5 분24에 대 한 샘플을 끓여.
  2. Immunoblotting
    1. 20-30 µ L 주머니와 0.75 또는 1 m m 두께 8 %SDS-아크릴 아 미드 젤을 사용 합니다. 25에 젤을 실행 실시간에서 2 h mA
    2. 젤에서 유리 덮개를 조심 스럽게 제거. 잘라 고 로드 주머니를 포함 하는 젤의 위쪽 부분을 삭제. 서쪽 오 점 버퍼에 배어 이전 니트로 멤브레인 (0.2 µ m)에 젤을 놓습니다. 단백질은 니트로 시스템 (4 ° C에서 1 시간예를 들어, 250 mA)의 권고에 따라 전송.
    3. 더 럽 히 시스템에서 니트로 멤브레인을 제거 합니다. 단백질을 시각화 하기 위해 빨간색 Ponceau와 얼룩 얼룩. 니트로 막 플라스틱 챔버로 전송 하 고 차단 솔루션 10 mL를 추가 합니다. RT에 1 h incubate 또는 4 ° c.에서 하룻밤
    4. 차단 솔루션을 가만히 따르다와 PBS에서 안티-polySia 735의 단일 클로 널 항 체 (1 µ g/mL)를 추가 합니다. RT에 1 h 막 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 부 화, 후 세 번 이상 PBS 가진 5 분 동안 막 세척.
    5. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 또는 PBS에 형광 라벨 결합 polyclonal 항 마우스 IgG 이차 항 체 (1 µ g/mL)를 추가 합니다. 실시간에서 1 h 막 품 어 부 화, 후 세 번 이상 PBS 가진 5 분 동안 막 세척.
    6. 적절 한 영상 접시에 막 전송. 제조업체의 지침에 따라 신호를 감지 합니다.

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Representative Results

Neu5Ac 그리고 Neu5Gc 표준 형광의 HPLC chromatograms는 그림 2에 묘사 된다. 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여, DMB 라는 Neu5Gc 일반적으로 elutes 7-9 분 차입, 시간과 DMB-Neu5Ac 10-12 분 사이. 여러 작은 봉우리는 크로마는 일반적으로 2-6 분 사이 나타납니다. 이러한 봉우리 unreacted DMB 나타내고 반응 중개자25.

그림 3 는 세포 lysates의 대표적인 chromatograms를 보여준다. DMB 라는 기준 (그림 2)의 chromatograms에 비해이 chromatograms에서 여러 정의 되지 않은 봉우리를 볼 수 있습니다. 이 세포 lysates의와 DMB를 뿐만 아니라 sialic acid 종 뿐만 아니라 세포 lysates, pyruvate, 호박, 그리고 α ketoglutarate26를 포함 하 여에 다른 α-keto 산으로 반응 하는 사실에 내부 불순물으로 인해 가장 높습니다. 적은 양의 sialic 산 O베어링의 존재-아세트산 가수분해에 의해 죽 습 하지는 틸 수정 또한 이러한 정의 되지 않은 봉우리23대 한 이유로 논의 될 수 있습니다. 치료 lysed 세포에서 chromatograms chromatograms 이전 ManNAc 또는 그 유사 체로 치료 받고 있는 셀에서와 비교 됩니다. 다음과 같이, 종종 ManNAc 치료 세포 표면에 Neu5Gc의 거의 전체 소모 이어집니다. Neu5Prop 또는 Neu5But로 치료 lysed 세포의 chromatograms, 봉우리는 볼 수 있는 치료 세포의 chromatograms에 표시 되지 않습니다. 이러한 봉우리 (ManNProp에 대 한 시 약 19 분 차입 셀을 처리 하 고 ManNBut에 대 일 분 세포를 처리) 해당 비 자연적인 sialic 산, Neu5Prop 및 Neu5Gc의 모양을 나타냅니다. 프로토콜의 8.3 섹션에 설명 된 대로 HPLC chromatograms는 세포 lysates의 다른 sialic acid 종의 양을 계량 하려면 분석할 수 있습니다.

고유한 HPLC 보존 봉우리 특정 sialic acid 종에 해당 하는 사실 질량 분석을 통해 확인 했습니다. 대표 ESI-MS 데이터의 수집된 HPLC 봉우리에서 그림 4에 묘사: 상단 왼쪽된 패널, 오른쪽 상단 패널에 두 개의 비 자연적인 sialic 산 종, DMB-Neu5Gc에서에서 수집 된 DMB Neu5Ac 보존 피크의 스펙트럼 DMB-Neu5Prop 및 낮은 왼쪽 및 오른쪽 패널에서 DMB-Neu5But. DMB와 반응이이 염료와 함께 표시 되지 않는 sialic acid 종에 비해 116.2 Da의 분자 질량에 있는 증가에 지도 한다. 질량 스펙트럼, 300와 700 사이 주입 된 샘플의 긍정적인 질량/전 비를 표시할 때, 여러 봉우리를 볼 수 있습니다. 이 존경 받는 DMB 표시 된 프로브 형성 adduct 예정 이다. [M + H]+protonated 이온 외 나트륨 adducts [M + 나]+ [M + 2Na-h]+ 나타납니다. 이기 (ACN) LC 분석 중으로, 그것은에서 찾을 수 있습니다 한 adduct로 질량 스펙트럼 (DMB-Neu5Gc, 그림 4에 대 한 표시: 오른쪽 위 패널). 모 세관 사이의 첫 번째 스키 머 electronspray 전송 지역의 생성 collisional에서는 정품 인증으로 인 한 조각화로 인해 탈수 sialic acid 종 [M + H]+-H2O는 또한 관찰 될 수 있다 (표시 DMB-Neu5Ac, 그림 4: 상단 왼쪽된 패널)23,27. LC 설정에서 DMB Neu5Gc unreacted 또는 부분적으로 반작용 DMB 종 직후 elutes. 따라서, 수집된 DMB Neu5Gc 프로브는 이러한 반응 중간체에 의해 발생 하는 불순물을 포함할 수 있습니다. 이 역할 DMB Neu5Gc의 질량 스펙트럼에 정의 되지 않은 봉우리의 모양에 대 한 설명 (그림 4: 오른쪽 위 패널).

ManNProp 또는 ManNBut 켈리 신경 세포의 치료 lysed 세포 (그림 5)에서 세포 막의 서쪽 오 점 분석에 의해 표시 된 대로 보안에 polysialic 산의 감소 식 지도 한다. 얼룩의이 크기에 (≈ 200 kDa)의 충전 할 Polysialic 산 일반적으로 나타납니다. ManNAc 유사 체로 치료는 세포 표면에 polysialic 산의 감소에 리드: 더 이상 지방 족 N-acyl 사이드 체인, 강한 감소28.

Figure 1
그림 1: nMGE의 일반 원칙-acyl 수정 mannosamines. N치료 후-acyl 수정 mannosamines, 이러한 ManNAc 아날로그 unidirectionally 대사 (세포내 물질 대사) 해당 비 자연적인 sialic 산. 이러한는 Golgi 이송, sialyltransferases에 의해 각각 처리한후 수락자로 그리고 sialosides (여기에서는 당단백질)으로 세포 표면에 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: DMB 라는 sialic acid 표준의 대표 chromatograms. DMB 라는 Neu5Ac (위 패널) 및 Neu5Gc (하단 패널) HPLC에 의해 분석 되었다. (점선) 시간 보존 및 두 sialic 산의 피크 넓이 후 결정 10 주입 HPLC 시스템으로 존경 받는 DMB 라는 종족의 ng. 여기 표시 된 대표 chromatograms, DMB-Neu5Gc eluted 후 약 8 분 유지 시간 및 DMB Neu5Ac에서 11 분, 각각. 여러 작은 봉우리는 크로마 unreacted DMB 및 반응 중간체를 대표 하는 2-6 분 사이 일반적으로 나타납니다. DMB 라는 Neu5Ac의 작은 분수 DMB Neu5Gc 표준 (하단 패널)에 작은 불순으로 나타납니다. 이 그림은 참조22에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: DMB HPLC에 의해 막 도약 sialic 류의 특성. 셀 부재 (치료 되지 않는, 위 패널) 또는 5 mM ManNAc 가진 존재에 교양 있었다 (위에서 두 번째 패널), ManNProp (위에서 세 번째 패널) 또는 ManNBut (하단 패널), 7 일 동안 각각. 매체 마다 24 h. 변경 된 세포 수확 했다 고 막 분수 준비 했다, DMB, 분류 및 HPLC 분석. 비교해보면 sialic acid DMB 라는 기준 (그림 2)의 chromatograms, 8-9 분 사이 보존 시간에 봉우리 DMB-Neu5Gc, 그리고 DMB Neu5Ac로 10-11 분 사이 봉우리로 확인 되었다. DMB 라는 sialic acid 표준 주입에서 얻은 봉우리에 비해 세포 lysates에서 chromatograms 추가, 정의 되지 않은 봉우리를 표시 합니다. 이것은 내부 불순물 프로브 뿐만 아니라 DMB sialic 산 세포 lysates에 뿐만 아니라 세포 lysates, pyruvate, α ketoglutarate, 호박, 등에 다른 α-keto 산으로 반 작용할 수 있다는 사실에. N의 배양 세포에서 샘플의 chromatograms에만 나타나는 봉우리-acyl 수정 mannosamine 아날로그 나타냅니다 해당 DMB 라는 비 자연적인 sialic 산. 이 그림은 참조22에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 세포 lysates에 sialic acid DMB 라는 종의 스펙트럼 질량. 관심의 HPLC 보존 봉우리 수집 되었다 ( 그림 3참조) 및 이후 봉우리 수집된 보존의 ESI 양 20 µ L에 의해 분석 LC 엠 시스템에 주입 했다. DMB와 반응 해당 unreacted sialic acid 종에 비해 116.2 Da의 분자 질량에 있는 증가에 지도 한다. 다른 sialic acid 종에서 얻은 긍정적인 질량/충전 비율 스펙 표시 됩니다 (DMB-Neu5Ac: 상단 왼쪽된 패널, DMB-Neu5Gc: 오른쪽 위 패널, DMB-Neu5Prop: 하단 왼쪽된 패널, DMB-Neu5But: 하단 오른쪽 패널). 인해 형성 adduct에 여러 봉우리 볼 수 있습니다. [M + H]+protonated 이온 외 나트륨 adducts [M + 나]+ [M + 2Na-h]+ 나타납니다. 존재 하는 LC 분석 하는 동안, 이기는 adduct (오른쪽 위 패널)로 찾을 수 있습니다. 탈수 DMB-Neu5Ac, 악기 [M + H]+-H2O의에서 조각화에 의해 생성 된 (위 왼쪽된 패널)을 관찰할 수 있습니다. 수집 된 DMB Neu5Gc 프로브 unreacted DMB, 반응에 의해 발생 하는 불순물을 포함 될 수 있습니다 추가 정의 되지 않은 봉우리 (오른쪽 위 패널)로 본 중간체. ACN, 이기; H, 수소; Na, 나트륨 이 그림은 참조22에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 보안의 polysialylation의 분석. 켈리 신경 세포는 7 일에 대 한 부재 또는 5mm ManNAc의 존재, ManNProp, 또는 ManNBut에 경작 했다. 셀 수확 했다 고 단백질 8 %SDS-아크릴 아 미드 젤에서 분리 되었고 안티 polySia 단일 클로 널 항 체 735를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석. Note는 polySia Sia, 서로 다른 크기와 polySia의 결과의 수에는 인해 얼룩으로 나타납니다.

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Discussion

화학적 합성된 ManNAc 파생 상품, ManNProp 및 ManNBut는 질량 분석을 통해 분석 하는 경우만 두 표본에 대 한 올바른 대량 피크 식별 되어야 합니다. 따라서, 제품 99% 이상의 순도가지고 추측 될 수 있다. 일반적으로 찾을 수 없는 인간의 셀29에, Neu5Gc의 적은 양은 lysed 세포의 막 분수에서 검색 됩니다. 이 대부분 미디어30에 소 태아 혈 청 sialoglycoconjugates에서 Neu5Gc 신병 회수 통로 통해 발생 합니다. Sialic 산 생 합성, ManNAc의 자연 스러운 전조와 치료는 크게 세포 표면에 Neu5Gc epitope의 식을 낮춘 다.

수정 된 mannosamines의 응용 프로그램은 지금까지 조사 하는 모든 셀에 사소 하 게 독성. 셀은 N-acylmannosamines에 대 한 특정 전송기 없는 때문에 필요한 매체 내의 증가 millimolar 설탕 농도 받아들인다. 그것은 신호 변환 통로의 N-acylmannosamines, 세포 성장 또는 감 별 법31,32에 영향을 미칠 수 있는 응용 프로그램에 따라 활성화 됩니다 시연 하고있다. 이 변경 된 sialylation 패턴은 여부 수정된 sialylation에 직접적인 영향을 반영 한다 지금까지 알려져 있지 않다. 셀 C2 수정 ManNAc 아날로그, ManNProp 또는 ManNBut의 존재의 성장 결과 해당 N운반 비 자연적인 sialic acid의 식이-acyl 대체. 두의 대사 효율 테스트 N-acyl 수정 mannosamines 다릅니다. ManNProp 치료는 일반적으로 해당 Neu5Prop 세포 표면에 표현 하 고 Neu5Ac Neu5Gc의 감소 식 리드. 다른 N-acyl 수정 mannosamine 아날로그 N-cyclopropylcarbamyl mannosamine와 같은 더 높은 신진 대사 효율22를 하는 경향이.

이전 연구 sialic 선구자 polysialylation 방해는 밝혔다. Polysialic 산 거의 독점적으로 보안에 표시 됩니다. 흥미롭게도, 보안 두 가지 polysialyltransferases 골 (ST8SiaII 및 ST8SiaIV)에 표현에 의해 polysialylated 될 수 있습니다. 알고 보 니 그 ManNProp, ManNBut, 및 다른 N-acyl-수정된 mannosamines polysialylation 방해 하 고 이것은 주로 ST8SiaII14와 상호 작용. 이 sialyltransferase은 개발 하는 동안 표시 하 고 두뇌의 개발에 대 한 중요 하다. 재미 있게도, 많은 종양 신경 기원 다시 익스프레스 ST8SiaII 증가에서 그들의 종은 고 추가 면역 시스템33에서 탐지. 반면, ManNAc의 응용 프로그램 polySia의 증가 이후 두 polysialyltransferases의 자연 기판은 CMP-Neu5Ac의 증가를 리드 리드.

MGE는 관심사 (예: erythropoietin)의 단백질에 소설 sialic 산을 소개 하 고 그로 인하여 그것의 기능을 조절 하는 독특한 방법입니다. 또한, 그것 때문에 많은 암 세포 sialic acid의 높은 레벨을 표현 하 여 면역 시스템을 탈출 하려고 암, 등 많은 질병에 대 한 관심의 수도 셀 표면 glycosylation 변조 하 사용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 메서드 수 있습니다: 첫째, 세포 배양를 사용 하 여 glycoengineering를 수행 하 고 두 번째, 분석 설계 성공적인 glycoengineering를 증명 하기 위해 glycans. 메서드는 매우 강력 하 고 지금까지, 아니 함정 보고; 대조적으로, 메서드가 셀13에 클릭-화학 수행을 화학 활성 그룹 소개 하 확장 되었습니다.

여기에 우리가 현재 두 ManNAc 아날로그 지방 족 N-적은 장비와 화학 합성에 경험 적은 실험실에 의해 합성, comparably 간단 acyl 사이드 체인 수정도. 유기 화학을 더 잘 알고 있는 수 있는 더 복잡 한 구조와 다른 ManNAc 아날로그 합성 그룹과 MGE, 이용 될 수 있다, 예를 들어 sialylated를 시각화 하는 소위 'bioorthogonal' 아날로그를 포함 하 여에 대 한 이러한 사용 하 여 glycoconjugates입니다. N의 개요를 제공 하는 검토 기사는-아 세 틸-13,34까지 합성 mannosamine 파생 상품. N-azidoacetyl mannosamine (ManNAz), sialylated glycans, 시각화 하기 위해 자주 사용 되는 물질은 상업적으로 사용할 수 있습니다. ManNAc 아날로그의 낮은 막 침투성 때문에이 설탕의 파생 상품을 사용 하 여 보호 된 수 산 기 그룹, 예를 들어, peracetylated ManNAc 아날로그와 유리한 수 있습니다. 세포질을 입력 한 후 보호 그룹은 죽 습 세포질 esterases에 의해 그로 인하여 활성 단35,,3637을 출시. 그러나, peracetylated ManNAc 아날로그 해당 보호 되지 않은 파생 상품에 비해 높은 세포 독성을 노출 합니다.

이 원고에서 우리 MGE 우리의 실험에 대 한 불멸 하 게 신경 세포를 선택 했다. 일반적으로, (특히 ManNProp와 ManNBut)와 MGE 다양 한 세포 선 불멸 하 게 셀 라인 (Wratil 외. 참조를 포함 하 여 적용할 수 있습니다. 예 13 ) 및 1 차 셀38,39. MGE는 sialylation에서 vivo에서 선 충 C.40, zebrafish17,41, 마우스19,,2042, 그리고 쥐에 변경 성공적으로 이용 되었다 또한, 43 , 44.이 방법의 대사 효율에 영향을 미칠는 다양 한 수 치료 시간과 MGE 실험에서 ManNAc 아날로그의 농도. 우리의 경험에서 더 이상 치료 및 높은 농도 glycoconjugates 수정된 Neu5R에 의해 자연스럽 게 발생 sialic acid 종의 더 나은 대체 대응. ManNAc 파생 상품의 매우 높은 농도 사용할 수 있다면, 치료의 세포 독성을 평가 한다, 예를 들어, MTT 분석 결과 또는 resazurin 감소 분석 결과.

이 원고에서 울트라 쥡니다 셀 균질에 대 한 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 세포 세포의 용 해 방법 얼음 (약 250 선)에 douncing를 포함 하 여 우리의 실험실에서 테스트 하 고 샘플에서 발견 sialic acid의 금액에 대 한 비교 결과 보도 중단 (4 구절, 10000 psi), 프랑스. 초음파 균질의 장점은 그것은 약간 시간이 필요 하 고 세포의 용 해 이전 샘플 DNAase의 추가 요구 하지 않는다.

우리는 sialylation에서 막의 변경 바인딩 glycoconjugates 싶 었 때문에 우리 세포 lysates의 막 분수에 우리의 분석을 집중 했다. Sialic acid 유도체 및 그들의 농도 또한 측정할 수 있습니다 셀, cytosol에서 막 분수 위에서 설명한 동일한 메서드를 사용 하 여 고속 원심 분리 하 여 분리 되었습니다. 그러나,는 cytosol에 sialic acid의 농도 세포 막7에 sialic 산 식에 비해 최대 100 배 더 낮은. 따라서, 더 많은 양의 셀 신뢰할 수 있는 결과 생성 하기 위해 필요 합니다. Cytosolic, 활성화 된 CMP sialic acid의 수영장은 가수분해7,45전에 나트륨 borohydride와 세포 lysates의 cytosolic 분수를 사전 처리 하 여 직접 측정할 수 있습니다. glycoconjugates에 sialic 산 및 수 산 기 수정 sialic acid, 위해 셀 1 m TFA incubated 했다. 가수분해, 뿐만 아니라, 예를 들어, 2 M 프로 산, 2m 초 산, 또는 1 M HCl에 대 한 다른 산 성 솔루션을 사용할 수 있습니다.

HPLC 분석 중 가능한 발생된 문제는 관심의 정의 되지 않은 봉우리와 중복 됩니다. 샘플에 sialic acid의 양을 특정 피크의 곡선 아래 면적으로 계산 해야 하는 때 이것은 특히 문제. 정의 되지 않은 피크에서 관심의 피크를 분리, HPLC 용 매에 이기 농도 조정 될 수 있습니다 (± 3%). 좋습니다 HPLC 분석을 위한 꾸준한 용 매 농도 사용 하 여 크로마토그래피 전에 용 매 혼합물을 준비 하는의 이점을 주는. 따라서, 우리의 방법 하나만 HPLC 펌프를 필요로 하 고 다른 HPLC 시스템의 광범위 한 가능한. 개 이상의 펌프를 HPLC 시스템에서 사용할 수 있는 이기의 농도 증가 함께 isocratic 그라디언트를 적용할 수 있습니다, 예를 들어, 4-9 %35 분45. 이 기법을 사용 하 여 특정 HPLC 봉우리의 보존 기간 상당히 변경 될 것입니다. 이 전략 겹치는 봉우리의 더 나은 별거를 달성 하기 위해 또한 도울 수 있다. 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 질량 분석기 (MALDI MS) 성공적으로의 식을 확인 여기에 제시 된 ESI MS 메서드에 상응 셀 표면45, 그리고 이렇게 역할에 sialic acid 종 수정 설립 .

ManNAc 아날로그의 화란과이 파생 된46의 통풍 관에 대 한 특정 전송기의 부족, 높은 농도 이러한 화합물과 MGE 실험에 필요 하다. 따라서, 최대 축척 실험 그리고, 특히 실험 vivo에서 , 각각 ManNAc 아날로그 대용량이 기술의 가능한 한계를 보여주는 필요 하다. 다른 한편으로, 셀 라인 사용에 따라 특정 최소한 치료 세포의 HPLC 분석에서 신뢰할 수 있는 결과 얻을 필요가 있다. 우리의 경험에서 최소 약 100000 부착 세포 또는 150000 현 탁 액 셀 (confluent 셀 96 잘 접시의 우물 1-2)은 충분 합니다. 분석 수 축소, 예에 접근을 차단 하는 경우이 병목을 될 수 있습니다.

이 원고에 제시 하는 방법으로 세포 lysates에 sialic 산 및 그 유도체를 감지할 수 있습니다. 그러나, 구조와 셀 ManNAc 파생 상품 취급에 glycoconjugates의 구성 여기 설명 기술 평가 수 수 없습니다. 해결 glycoconjugates, e.g.,N-및 O-glycans의 구조는 일반적으로 큰 경험 및 당쇄체학 시설47을 요구 한다. 우리의 지식을 하려면, 지금까지 데이터가 없습니다 glycoconjugates ManNAc 아날로그로 처리 하는 셀에서의 독특한 구조에 사용할 수 있습니다.

Polysialic 산의 서쪽 오 점 분석은 매우 신속 하 고 쉬운 방법. 그러나, 탐지 항 체와 화학을 사용 하 여 때문에이 메서드에서 얻은 데이터 양적, 되지 않습니다. 따라서, HPLC 방법의 사용은 서쪽에 게 더 럽 히기에 이점이 다. 그럼에도 불구 하 고, 이후 적용 하기 쉽고 매우 안정적으로 작동 하도록 알려진 immunoblotting 메서드를 사용 하 여 하는 것이 좋습니다.

세포 표면에 sialic acid의 식이 MGE 이외의 방법으로도 변경할 수 있습니다. 위에서 설명한 대로 sialidase, 상대적으로 불특정 방식에서 sialic acid 잔류물 glycoconjugates에서 고대의 효소와 세포를 치료 수 있습니다. Sialidase 치료는 결과적으로 치료 셀에 hyposialylation를 유도합니다. 불행히도, sialidase 치료는 제한 된 기술, 그것은 세포 독성, 오래 시간 치료를 위해 가능 하지 그리고 vivo에서 실험에 적용 되지 않습니다. Sialic 산 생 합성의 억제제를 사용 하 여 셀에 hyposialylation를 유도 하기 위해 다른 기술이 이다. 다양 한 억제제는 하나 sialic 산 생 합성, UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase의 주요 효소를 대상 사용할 수 /N-acetylmannosamine-키 (GNE/MNK), 또는 sialyltransferases6,의 그룹 7,,848. 이러한 화합물, 아날로그, C3-불 sialic acid 중 표시 했다 생활에 sialic acid의 식이 낮은 마우스49. 그러나 동물 취급이 물질,, 간 장애, 돌이킬 수 없는 신장 부전, 그리고49번 창 하는 실패. 이 결과 간 및 신장 기능에 Neu5Ac의 중요 한 역할을 확인 하 고 추가 vivo에서 실험에 대 한 sialylation 억제제의 한계를 나타냅니다. 셀 변경 된 셀 표면 sialylation 생성 하는 세 번째 방법을 sialic 산 생 합성에 대 한 중요 한 효소의 표현을 방해 하는 것입니다. GNE/MNK 불멸 하 게 셀에서의 노크 다운 예를 들어 이러한 셀 hyposialylated 9렌더링 표시 했다. 비교적 쉽게 노크-및-표면 세포에 유전자와 vivo에서 를 사용 하 여 소설과 잘 인식된 CRISPR Cas9 기술 sialic 산 생 합성에 대 한 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다 및 셀 가능성 sialylation입니다.

여기서, 설명에 비해 MGE의 장점은 그것이 적용 하기 쉽고 적응력이 다른 실험의 무수 한 세포 기반된 분석 및 vivo에서 실험을 생체 외에서 시험에서. 펄스 전기 화학 탐지50-고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC) 식 셀 샘플에서 다른 sialic acid의 농도 측정 하는 대체 방법이입니다. 이 방법, sialic acid의 식이 직접 측정 하는 사용 하 고 하지 후 형광 염료와 라벨. 이 방법의 장점은 그것 단 sialic acid 및 그 파생 셀 및 단백질 샘플 분석에 활용할 수 있는. 불행 하 게도, HPAEC의 감도 낮은 DMB sialic acid의 fluorometric 검출 비교 합니다. 따라서, HPAEC는 큰 샘플 금액51의 가용성과 함께 실험에 제한 됩니다.

여기에서 설명한 메서드 glycoconjugates의 알 수 없는 특성을 사용할 수 있습니다. MGE 이미 sialic acid 종속 상호 작용을 조사 하기의 사용에 대 한 예의 다 수는13, 다양 한 실험 설정의 맥락에서이 기법의 타당성을 보여주는 존재 합니다.

요즘, N-acetylmannosamines와 MGE는 glycobiology의 분야에서 연구자에 의해 주로 사용 된다. 우리는이 기술을 인식 됩니다 광범위 한 청중에 의해 다양 한 도구로 glycoconjugates 수정 바랍니다. 다른 분야, 면역학, 바이러스학, 신경과, 또는 종양을 포함 하 여 그들의 자신의 목적을 위해이 기법을 적응 하 여 도움이 됩니다. 이러한 크로스 오버 연구 아직 미지의 영역의 발견을 가능 하 게 되 고 따라서 건강 및 질병의 더 나은 이해를 줄. 초기 연구에서 예를 들어이 기술은 vivo에서 예방 접종에 대 한 나중 수정된 glycosylation와 glycoproteins를 생산 하 사용 되었다. 경우에 따라 같은 glycoengineered 백신과 치료 고급 갈망과 각각 대상52,53독성 항 체의 생산으로 이어질. 다른 사람 성공적으로 사용 MGE 쥐54타겟된 종양 치료에 대 한 모델을 개발. 또 다른 연구 결과 ManNProp의 주입 체계 vivo에서 신경 재생55승진 했다. PolySia의 경우는 방사선 또는 항 암 약물56치료가 종양 세포의 감도 증가이 원고에 제시 하는 방법으로 점감 하는 신경 세포에서이 epitope의 식을 보였다.

샘플 내에서 측정 sialic 산 양의 치료 세포를 분리 하는 데 사용 하는 방법에 따라 달라질 수 있습니다. 이 원고에 트립 신 가진 외피 세포를 분리 하 사용 되었다. 다른 기술은 사용 되 고, 셀 또는 PBS + EDTA, 장기간 치료를 근 근이 같은 경우 샘플 측정 sialic acid의 금액 달라질 수 있습니다. 트립 신 보육 시간을 적응도 나중에 측정 sialic 산 농도에 영향을 가질 수 있습니다. 우리의 경험에서 측정 sialic acid의 금액에 세포 분리 방법의 영향 15% 미만 이지만 결과 정상화 하 고 비교 하는 경우이 중요 한 병목 현상이 될 수도 있습니다. 또한, 세포 세포의 용 해에 대 한 메서드는 HPLC 분석의 결과 발생할 수 있습니다. 따라서, 세포 분리 및 세포 그들의 실험에서 표준화 하는 독자를 좋습니다.

세포 lysates의 막 분수의 분리를 달성 하기 위해 우리는 20000 x g에서 2 시간 및 4 ° C (섹션 5.1)에 대 한 원심 분리를 사용. 다른 원심 프로토콜 분리 및 따라서 sialic acid 샘플에서 발견의 금액에 영향을 수 있습니다. 이 프로토콜 내에서 중요 한 화합물 때문에 DMB, 빛에 아주 과민 하 고 시간이 지남에 저하 됩니다. 여기 aliquot 작은 부분의 DMB 솔루션 및 그것으로 주식에서-20 ° C, 빛 (단원 1.6.1) 으로부터 보호 하는 게 좋습니다. 몇 주 동안이 방법은 DMB 솔루션을 저장할 수 있습니다. DMB-HPLC 분석에서 결과 sialic acid 종족에 대 한 신호를 감소 또는 증가 HPLC 측정의 첫 번째 6 분 내 신호 표시, 대표 하는 DMB와 반응 제품, 새로운 DMB 솔루션 준비 되어야 한다. 하지 다시 동결 하 고 그것을 녹고 후 DMB 솔루션을 사용 하 여 다시. DMB 라벨, 후 모든 샘플은 즉시 분석 되어야 합니다. 더 많은 수의 샘플 (> 10) 분석할 수 있다면, 이러한 샘플은 작은 배지를 나누어와 점차적으로 DMB와 함께 표시 있어야 합니다. 두 라벨 반응 시간 뿐만 아니라 DMB 표시 된 프로브에 빛 으로부터 보호 되어야 한다. 차입, 후 DMB 라는 sialic acid 종 분석 해야 합니다 즉시 ESI 양 직접 커플링 (LC-ESI-MS 설치)에 ESI MS 시스템과 HPLC의 필요, 하지만 질량 분석의 높은 품질을 달성 하기 위해 유리할 수 있다 하 여 분석입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 감사 합니다 L. D. 구 엔 원고를 교정에 대 한 유익한 토론. 또한, 우리 감사 제이 Dernedde와 H. G. 구 엔 비디오 촬영을 준비 하는 데 도움. 비디오의 대부분 장면 R. 타우버의 실험실에서 촬영 했다. 우리는 또한 콜 로이드 및 인터페이스, 그리고 우리에 게 그들의 질량 분석 시설을 무료로 이용할에 대 한 최대 플랑크 연구소 감사 합니다. RH는 DFG (ProMoAge)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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