Rening av biotinylerade cellytaproteiner från

Published 7/23/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

En modifierad densitetscentrifugeringsgradientbaserad metod användes för att isolera epitelceller från Rhipicephalus microplus darmvävnad. Ytbundna proteiner biotinylerades och renades genom streptavidinmagnetiska pärlor för användning vid nedströmsapplikationer.

Cite this Article

Copy Citation

Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rhipicephalus microplus - boskapsskytten - är den mest betydande ektoparasiten när det gäller ekonomisk påverkan på boskap som vektor av flera patogener. Ansträngningar har ägnats åt boskapskontrollen för att minska dess skadliga effekter, med fokus på upptäckten av vaccinkandidater, såsom BM86, belägen på ytan av tarmkärlens epitelceller. Nuvarande forskning fokuserar på utnyttjandet av cDNA och genomiska bibliotek, för att screena för andra vaccinkandidater. Isoleringen av fästkärlceller utgör en viktig fördel vid undersökning av sammansättningen av ytproteiner på fästkammarmembranet. Detta papper utgör en ny och genomförbar metod för isolering av epitelceller, från fästkärmens innehåll av semi-engorged R. microplus. Detta protokoll utnyttjar TCEP och EDTA för att frigöra epitelcellerna från subepiteliala stödvävnaderna och en diskontinuerlig densitetscentrifugeringsgradieNt för att separera epithelceller från andra celltyper. Cellytaproteiner biotinylerades och isolerades från fästkärlepitelcellerna med användning av streptavidinbundna magnetiska pärlor som möjliggjorde nedströmsapplikationer i FACS eller LC-MS / MS-analys.

Introduction

Rhipicephalus microplus , nötkreatursmarken, är den mest betydande ektoparasiten när det gäller ekonomisk påverkan på boskapsindustrin i tropiska och subtropiska regioner, eftersom det vektorerar nötkreaturfekta (babesiosis), anaplasmos och equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 . Ansträngningar har ägnats åt boskapskontroll för att minska skadlig effekt, men konventionella metoder såsom användningen av kemiska akaricider har implicita nackdelar, såsom förekomsten av kemiska rester i mjölk och kött, och ökningen i förekomsten av kemiskt resistenta fästingar 5 , 6 , 7 . Följaktligen har utvecklingen av alternativa metoder för tickkontroll studerats, såsom användning av naturligt resistent boskap, biologisk kontroll (biopesticider) och vaccinInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

I strävan efter proteiner som kan användas som vaccinkandidater är den aktuella forskningen inriktad på tarmkanalen. Midgutväggen är uppbyggd av ett enda lager av epitelceller som ligger på en tunn basal lamina, med utsidan av den basala lamina som bildar ett nätverk av muskler. Ljus- och elektronmikroskopobservationer indikerar att midgutet består av tre typer av celler: reservera (odifferentierade), sekretoriska och matsmältningsämnen. Antalet celltyper varierar avsevärt beroende på den fysiologiska fasen. Sekretoriska och matsmältningsceller härrör från både reservceller 18 , 19 , 20 .

Konstruktionen av cDNA-bibliotekAtt undersöka sammansättningen av tarmkanalen har lett till identifieringen av antigena proteiner, såsom Bm86, som potentiella vaccinkandidater 2 , 3 , 4 . Glykoproteinet Bm86 lokaliseras vid ytan av fästkärlceller och inducerar ett skyddande immunsvar mot nötkreatursmarken ( R. microplus ) hos vaccinerade nötkreatur. Anti-Bm86 IgG-preparat som produceras av den immuniserade värden intas av fästet, känner igen detta antigen på ytan av fästkärlceller, och stör sedan störningar i fästkärlets vävnadsfunktion och integritet. Vacciner baserade på Bm86 antigener har visat effektiv kontroll av R. microplus och Rhipicephalus annulatus, genom att minska antal, vikt och reproduktionskapacitet hos englande kvinnor, vilket resulterar i minskad larvalinfestation i efterföljande fästgenerationer 4 . Bm86-baserade vacciner är emellertid inte effektiva mot alla fäststeg och harVisat sig otillfredsställande effekt mot vissa geografiska stammar av R. microplus , följaktligen har nötkötts- och mejeriindustrin dåligt antagit dessa vacciner 2 , 4 .

Möjligheten att isolera epitelceller från tarmkanalen är en signifikant innovation som skulle möjliggöra framsteg av forskning för att bestämma proteinmembrankompositionen inklusive morfologi och fysiologi under olika miljöförhållanden. Metoden som beskrivs här använder chelateringsmedlet etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och reduktionsmedlet tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) för att frigöra epitelet från dess subepiteliala stödvävnader 10 . Epitelet utvinns efter mekanisk störning av vävnaderna genom skakning följt av diskontinuerlig gradientcentrifugering i Percoll. I det här dokumentet beskrivs en genomförbar och ny teknik för isolering av tarmgropspiThelialceller. Biotinylerade cellytproteiner, isolerade från ytan av dessa epitelceller kan därefter analyseras i nedströmsapplikationer såsom FACS och / eller LC-MS / MS-analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dissektion av Gut Epithelium från R. microplus

  1. Samla halvfiskade fästingar från nötkreatur på experimentdagen. Dissektera fästingar inom 24 timmar efter avlägsnande från värden.
  2. Håll fast en remsa av kanaltape till botten av 92 mm x 16 mm petriskålen. Lägg till en droppe superlim till bandet. Placera fästet, ventral sidan ner på superlimet, låt det torka i 2 minuter.
  3. Häll 100 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i petriskålen, eller tills kryssningen är helt nedsänkt.
  4. Utnyttja en storlek 11 skalpell, klippa från övre delen av ögonen till bottenfesterna, på båda sidor av fästet.
  5. Använd sterila pincett, ta bort skytten och alloskärmen , för att exponera de inre organen.
  6. Ta bort de fina vita trådliknande organen (luftstrupen) och andra membran för att förhindra kontaminering.
  7. Ta av tarmen med hjälp av tång, genom att klämma på den övre regionen och dra frånkadaver. Ta bort eventuella kvarvarande tarmvävnader, se till att inga andra vävnader har blivit dissekerade.
  8. Förvara tarm i iskallt Hank Balanced Salt Solution (HBSS) utan kalciumklorid och magnesiumsulfat med proteinasinhibitor cocktail (PIC). Snap frysa tarmarna i torris och lagra vid -20 ° C.
    Obs! För att hjälpa till med darmdissektion och detaljer i fästorganens inre organ hänvisas till kapitel 3.1 av D. Sonenshine, "Biology of Ticks" 19 .

2. Epitelcellerdissociation

  1. Häll den dissekerade tarmarna på en 70 μm cellfilm i ett 50 ml rör.
  2. Spola tarmvävnaden med 50 ml iskall HBSS med PIC tills lösningen är klar och tarmarna får ett vitt / klart utseende.
  3. Re-suspendera tarmar i 30 ml iskall HBSS med PIC, blanda försiktigt och centrifugera vid 500 xg vid 4 ° C i 10 minuter för att pelleta tarmen. Ta bort supernatanten och upprepa tvättprocessen tre gånger.
  4. Filtrera suspensionen genom en 250 μm cellfilm, vortex genomströmningen och filtrera genom en 70 μm cellfilm som samlar den återstående genomströmningen.
  5. Centrifugera suspensionen vid 500 xg vid 4 ° C under 20 minuter för att pelleta de enskilda cellerna.

3. Isolering av enkla epitelceller med användning av en densitetscentrifugeringsgradient

  1. Förbered densitetscentrifugeringsgradienten ( t.ex. Percoll) genom filtrering genom ett AP15-förfilterpapper. Förbereda 40% och en 20% PercoU i mqH 2 0 (v / v) och kyl vid 4 ° C under 1 h före skiktning gradienten.
  2. Använda en peristaltikPumpen inställd till lägsta hastighet, skikt 3 ml 40% densitetscentrifugeringsgradient i ett 16 ml ultracentrifugrör, vilket gör det möjligt att sedimentera på is under 15 minuter. Pumpens hastighet ska leda till en flödeshastighet <1 ml per minut.
  3. Luta röret i en 45 ° vinkel, använd peristaltpumpen för att lagra centrifugeringsgradienten på 20% på toppen av 40% -laget. Pumpens hastighet ska leda till <1 ml per min flödeshastighet. Låt lagren ligga på is i 15 minuter.
  4. Använd peristaltikpumpen vid <1 ml per min flödeshastighet till skikt 3 ml DMEM-medium innehållande tarmkanalceller över 20-40% densitetscentrifugeringsgradienten.
  5. Programmera centrifugen för maximal acceleration och minsta retardation. Centrifugera vid 600 xg i 10 min. Samla mellanfaser mellan DMEM: Centrifugeringsgradienten 20% och centrifugeringsgradienterna med 20%: 40% för att isolera epitelceller. Förvara uppsamlade mellanfaser vid 4 ° C för efterföljande analyser.

4. Bedömning av cellisolering

  1. hemacytometer
    1. Rengör hemacytometerns glid med alkohol.
    2. .Re-suspendera cellerna genom att försiktigt pipettera cellerna upp och ner. Pipettera 100 μl av cellsuspensionen och placera i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    3. Tillsätt 400 μl 0,4% Trypan Blue. Blanda försiktigt genom att smeka röret.
    4. Pipettera 100 | il av den Trypan Blue-behandlade cellsuspensionen för att långsamt fylla båda kamrarna i hemocytometern.
    5. Placera hemocytometern under ett ljusmikroskop och fokusera på hemocytometerns nätlinjer med 10X-objektiv.
    6. Med hjälp av en handhållen tallyräknare räknas de levande ostämplade cellerna inom en uppsättning med 16 rutor. Inom samma torg räknas de blå döda cellerna. Fortsätt räkna tills fyra setor med 16 rutor räknas.
    7. Beräkna de totala cellerna per ml med hjälp av formeln:
      47eq1.jpg "/>
    8. Beräkna den procentuella cellleabiliteten med hjälp av formeln:
      Ekvation 2
  2. Cellisolera visualisering
    1. Späd 1 μl av de isolerade cellerna i 9 μl HBSS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Spola mikrocentrifugröret försiktigt för att blanda.
    2. Pipettera 5 μL isolerade celler i HBSS i mitten av en glasskiva. Applicera tre droppar monteringsmedium med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
    3. Inkubera bilden vid rumstemperatur i 5 minuter. Lägg försiktigt täckplåten över förberedelsen och undvik luftbubblor.
    4. Visualisera celler färgade med DAPI vid excitation 360 nm och emission vid 460 nm under ett fluorescerande mikroskop.

5. Cell-ytproteinbiotinylering

  1. Biotinylat 100 | j, l av epitelceller med enkelcell med användning av biotin (typ A) -konjugeringKit, i ett molförhållande av 1: 1 ytprotein till konjugat, enligt tillverkarens instruktioner
  2. För celllys, tillsätt 100 | il PBS, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 | jM oxiderad glutation och PIC till de biotinylerade cellerna. Inkubera på is i 1 timme med försiktig blandning var 10: e minut.
  3. Centrifugera de biotinylerade cellerna vid 20 000 xg vid 4 ° C i 20 min till pellet olösligt material. Samla supernatanten innehållande cytoplasmatiska och biotinylerade membranproteiner.
  4. Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-analysen.

6. Isolering av biotinylerade ytproteiner

  1. Tillsätt 50 μL magnetiska pärlor av streptavidin i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  2. Placera röret i ett magnetiskt stativ, samla pärlorna mot rörets sida. Ta bort och kassera supernatanten.
  3. Tillsätt 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20 till röret. Blanda försiktigt och samla pärlorna med magnetiska stand. Ta bort och kassera supernatanten.
  4. Kombinera 40 μg biotinylerade cellytproteiner, utspädda till 300 μl i 1x PBS med tvättade magnetiska pärlor. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur med omröring.
  5. Samla pärlorna med ett magnetiskt stativ, ta bort och kassera supernatanten.
  6. Tillsätt 300 μL TBS, 0,1% Tween-20 i röret, blanda försiktigt för att suspendera pärlorna igen. Samla pärlor, ta bort och kassera supernatanten. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
  7. Tillsätt 100 μL av 0,1 M glycin pH 2,0 till magnetiska pärlorna och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Samla kulor och avlägsna supernatant innehållande eluerade biotinylerade ytproteiner.
  8. Visualisera isolerade ytproteiner på en 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE gel.

7. Bedömning av biotinylerat ytprotein

  1. Dot Blot
    1. Klipp en 7 cm x 3 cm remsa av nitrocellulosamembran.
    2. Applicera 10 μg total tick guT-innehållet (från 1,8 ovan) och 10 | jg biotinylerat ytprotein till membranet. Låt torka i 15 minuter vid rumstemperatur.
    3. Överför till en behållare och nedsänk i 100 ml blockeringsbuffert. Inkubera vid rumstemperatur med omröring i en timme. Kassera blockeringsbuffert.
    4. Tvätta nitrocellulosamembran i 100 | il PBS, 0,05% Tween-20 i 5 min med omröring. Kassera tvättbuffert och upprepa tvätten tre gånger.
    5. Inkubera i 1/5000 Streptavidin-pepparrotperoxidas (HRP) i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 2 timmar med omröring vid rumstemperatur och kassera eventuell återstående lösning.
    6. Tvätta nitrocellulosamembran i 100 | il PBS, 0,05% Tween-20 i 5 min med omröring. Kassera tvättbuffert och upprepa tvätten tre gånger.
    7. För detektion upplös 1 tablett 4-klor-1-naftol i 10 ml iskall metanol. Tillsätt 4 ml metanollager till 20 ml TBS. Tillsätt 10 μl färsk 30% väteperoxid och immediaTely gäller för nitrocellulosamembran.
    8. Inkubera med omröring vid rumstemperatur tills substratet producerar en olöslig blå slutprodukt. Detta kan ta mellan 2-15 min.
    9. Kassera upptäckt lösning och tvätta membranet tre gånger i 100 mikroliter mqH 2 O.
  2. ELISA-analys
    1. Torka 200 ng av varje prov med 400 μl 100 mM karbonatbeläggningsbuffert och täcka 2 banor i den första raden (A #) av ELISA-plattan (platta bottenbrunnar)
    2. Tillsätt 100 μl 100 mM karbonatbeläggningsbuffert till alla andra motsvarande brunnar i rader (BH).
    3. Förbered serieutspädningar av varje prov genom att pipettera 100 μl från varje brunn i rad A och överföra till rad B. Blanda försiktigt genom pipettering och undvik att producera bubblor. Upprepa utspädningarna längs varje rad, kassera den slutliga 100 μL från varje brunn i rad H.
    4. Täck plattan med parafilm och inkubera vid 4 ° C över natten.
    5. Tvätta plattanE med 200 pl PBS, 0,05% Tween-20 per brunn tre gånger.
    6. Tillsätt 200 μL blockerande buffert till de belagda brunnarna, täck med Parafilm och inkubera vid 4 ° C över natten.
    7. Späd 1 / 15.000 Streptavidin-HRP i blockerande buffert och tillsätt 100 μL till varje brunn på plattan. Skydda med parafilm och inkubera vid 4 ° C över natten.
    8. Tvätta plattan i 200 pi PBS, 0,05% Tween-20 per brunn fem gånger.
    9. För att upptäcka tillsätt 100 μL TMB-reagens per brunn. Efter tillräcklig färgutveckling, vanligen mellan 10-15 min, tillsätt 100 μL 1 M fosforsyra för att stoppa reaktionen.
    10. Läs absorbansen hos varje brunn vid A = 450 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Epitelceller isolerades från tarmvävnaderna hos R. microplus enligt det schematiska som presenteras i figur 1 . Representativ fluorescensmikroskopi av epitelceller från fästkärl framställd med användning av detta protokoll visas i figur 2A Och 2B. Eftersom cellisoleringen utförs på semi-engorged R. microplus, framträder celler som singulär, sfärisk, jämn ytmorfologi och en konsekvent storlek i hela provet. Skillnader i storlek och typ av tarmcellpopulationer är tydligare när fästet fortsätter att bli fullvuxna vuxna.

Fluorescerande färgning av kärnan från isolerade epitelceller med DAPI hjälper till att visualisera cellerna. Dåliga isolationer visualiseras för att innehålla ofullständig dissociation av epitElialceller med varierande cellpopulationer identifierade genom de varierande cellstorlekarna och morfologierna ( Figur 2C och 2D )

Med utnyttjande av detta protokoll isolerades ungefär 1,2 x 10 ^ celler per / ml från 50 tarmdissektioner med 75-80% viabilitet framgångsrikt från R. microplus tick tarm. Kors-kontaminering från värdproteiner ( Figur 3A ) kan minimeras genom att skölja tarmar noggrant, tills de har ett vitt utseende som resulterar i en vit / klar Percoll-gradient ( Figur 3B ).

Ytbundna proteiner isolerades genom biotinylering av ytbundna proteiner, förstörelse av cellulära membran och rening av biotinylerade ytproteiner med magnetiska streptavidinpärlor. Totalt 20-24 μg renat biotinLaterade ytproteiner kan isoleras för nedströmsapplikationer från en initial dissektion av 50x fästgödsel med användning av detta protokoll. Jämförelse av proteiner med SDS-PAGE ( Figur 4A ), Silverfläck ( Figur 4B ), Dot blot ( Figur 5 ) och ELISA ( Figur 6 ) indikerar att den beskrivna metoden renade biotinylerade ytproteiner från epitelceller isolerade från R. microplus tick mage.

Figur 1
Figur 1 : Schematisk representation för att isolera biotinylerade proteiner närvarande i ytan av R-mikroplus- midgutcellerna. Vänligen clIck här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : Fluorescensmikroskop visualisering (100x) av R. microplus midgut epitelceller färgade med DAPI. Programvaran användes för att genomföra fluorescensöverlagringen. A & B) Representera epitelceller framgångsrikt isolerade från R. microplus midgut. C / D) Epitelceller isolerade från R. microplus- gut kontaminerad med större fekvävnader.

Figur 3
Figur 3 : Percollgradient innehållande DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Epitelcellslagen bildades mellan DMEM: 20% PErcoll och 20: 40% percoll. ( A ) Tick gut dissektion utan adekvat tvättsteg. ( B ) Tick gut dissektion med adekvat tvättsteg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4 : Elektroforetiska separationer av biotinylerade ytproteiner körs på 4-20% Tris-MOPS-gel, vid 140 V i 55 min med 10 | ig använd prov. (L) PageRuler förfärgade protein stege (1) Omärkt R. micro hela tarmprovet (2) Biotinylerade proteiner extraherades från R. micro hela tarmen enligt steg 6. (3) Proteiner från epitelceller extraherade från omärkt R. micro tarmen (4 ) Biotinylerade proteiner extraherade från R. microplusEpitelceller enligt steg 6. ( A ) SDS-PAGE färgad av Comassie blue ( B ) Silver stain.

Figur 5
Figur 5 : Dot blot analys. Streptavidin-HRP konjugerad utspädd 1/5000. ( A ) Totalt 10 μg råkotttjutprotein extrakt ( B ) Biotinylerade ytproteiner extraherade från renade epitelceller (10 | ig).

Figur 6
Figur 6 : Bedömning av biotinylerad ytprotein-viabilitet med användning av ELISA. ELISA av ytproteiner utvecklades av Strep-HRP konjugerad antikropp utspädd 1/15 000 mot olika koncentrationer av biotinylerad ticK-gutproteiner (från 0,7 ng till 100 ng). Omärkta fästproteiner och bovint serumalbumin (BSA) användes som negativ kontroll av ELISA. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nötkreatursinfektioner utgör ett stort problem för boskapsindustrin i tropiska och subtropiska regioner i världen, med den vanligaste kontrollmetoden som är beroende av användningen av akaricider 1 , 4 . Bm86 identifierades tidigare inom epitelytan av tarmgöt som skyddande antigen mot R. microplus infestation 10 , med begränsad framgång som en vaccinstrategi på grund av variationen Bm86 geografisk sekvens och kravet på regelbunden ökning 4 .

Tidigare publikationer med inriktning mot epithelialisoleringsmetoder var huvudsakligen inriktade på ryggradsdjur eller insekter av arten 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Till exempel försöker tidig fraktionering att isolera midgutMed användning av däggdjursmetoder, fann att samma metod inte kunde tillämpas på insekter på grund av den olika cellstrukturen och organisationerna 12 . Vidare är däggdjursmetoder beroende av användningen av antingen dipas eller kollagenas för att enzymatiskt smälta cell-cellförbindningsproteinerna 9 , 13 . Dipas och kollagenas påverkar väsentligen cell-ytbundna proteiner, och därför är tekniker som är beroende av deras användning inte lämpliga för cell-ytproteinstudier 15 . Insect midgut cell isoleringar fokuserar för närvarande på två tekniker. Den första använder mekanisk störning av midgut genom ultraljud följt av separation över en kontinuerlig linjär sackarosgradient 8 , 11 , 12 , 14 . Denna mekaniska teknik producerar ett prov som är nästan klart av föroreningar, howeVer producerar ett lågt utbyte av mikrovillarmembran 14 . Den andra tekniken bygger på Tris-störning av membran för att frigöra mikrovillar membran 8 .

Tekniken som skisseras inom detta papper möjliggör isolering av epitelceller, biotinylering av ytproteiner och deras isolering 16 , vilket möjliggör ytterligare studier genom nedströmsapplikationer såsom masspektrometri eller FACS. Metoden som beskrivs här använder chelateringsmedlet EDTA och reduktionsmedlet TCEP. EDTA-funktioner för att sekvestrera kalciumjoner, hämmande kadheriner, bryta kadherinförmedlade cell-cellförbindelser medan TCEP reducerar disulfidbindningarna som ger viskositet hos den glykanrika mucusliknande peritrofa matrisen som separerar tarmlumen från epitelet. Epitelet utvinns efter mekanisk störning av vävnaderna genom skakning följt av diskontinuerlig gradientcentrifugering i densitY centrifugeringsgradienten. Epitelceller isoleras mellan DMEM: 20% densitetscentrifugeringsgradienten och 20%: centrifugeringsgradientlager med 40% densitet.

Användning av en högre temperatur vid epitelcellerdissociation kommer att orsaka att stora vävnader dissocierar från tarmen, vilket leder till att man inte isolerar epitelceller. Att säkerställa att epitelcellerdissociation utförs omedelbart efter frikoppling; Utnyttjandet av iskalla buffertar och undvikandet av höga centrifugeringshastigheter är avgörande för att kvarhålla levande levande celler. Trots detta kan upplösningen av större celler från basallamina ge viss förorening. Vidare ändrar fettflödesepitelet av tärningen dramatiskt beroende på tiden från den sista blodmjölen 18 , 19 , 20 .

Som sådant har detta protokoll utformats och nås på R. microplus Figur 1 ) av likformig art.

Sammanfattningsvis utnyttjade de metoder som användes i denna studie framgångsrikt isolerade epitelceller från hela magen av R. microplus . Proteiner från ytan av R. microplus epitelceller erhölls för vidare analys och studier. Slutligen har det utvecklade protokollet visat det potentiella utbytet av epitelceller från tarmkanalen och effektiviteten hos biotinylerade ytproteiner i cellen. Det utvecklade protokollet kan användas i alla tikar av ekonomisk betydelse i ett försök att undersöka fält: värdinteraktioner genom att studera membranprotein comTarmens läge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australien) för tillhandahållande av Rhipicephalus microplus- ticks som används för denna studie, och Lucas Karbanowicz för hjälp med videoinspelning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
  3. García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
  4. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
  5. Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. AgNote No. K58. (2013).
  6. Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
  7. Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
  8. Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13, (18), 1804-1808 (1995).
  9. Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
  10. Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
  11. Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
  12. Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
  13. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
  14. Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
  15. Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
  18. Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. Pergamon Press. 201-205 (1982).
  19. Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
  20. Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats