3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석

Biology

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Summary

여기, 우리는 miRNA의 갭 접합 종속 셔틀 (gap junction-dependent shuttling) 분석을위한 광 표백 (photobleaching) 후 3 차원 형광 복구 (3D-FRAP)의 응용을 기술한다. 일반적으로 적용되는 방법과는 달리, 3D-FRAP은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 작은 RNA의 세포 간 전달을 정량화합니다.

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Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

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Abstract

miRNA 및 siRNA와 같은 작은 안티센스 RNA는 세포 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을하며, 또한 여러 질병의 치료에서 치료제로 사용될 수 있습니다. miRNA / siRNA 치료를위한 새롭고 혁신적인 전략의 개발은 근본적인 메커니즘에 대한 광범위한 지식을 기반으로합니다. 최근의 데이터는 작은 RNA가 갭 접합부 (gap junction-dependent) 방식으로 세포들 사이에서 교환 됨으로써 수용 세포에서 유전자 조절 효과를 유도 함을 시사한다. 분자 생물학적 기법과 유동 세포 계측 분석은 일반적으로 miRNA의 세포 간 교환을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 높은 시간 해상도를 제공하지 못하며, 이것은 분자의 갭 접합 플럭스를 연구 할 때 필요하다. 따라서 miRNA / siRNA가 세포 간 신호 전달 분자로서의 영향을 조사하기 위해서는 이러한 작은 RNA를 세포 수준에서 분석 할 수있는 새로운 도구가 필요합니다. 현재의 프로토콜은 ap(3 차원 - FRAP) 현미경 검사 후 3 차원 형광 복구의 plication은 심장 세포 사이의 갭 접합 - 의존적 인 miRNA 분자의 교환을 해명합니다. 중요한 것은,이 간단하고 비 침습적 인 라이브 셀 이미징 접근 방식은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 형광 표지 된 작은 RNA의 갭 접합 셔틀 링의 시각화 및 정량화를 허용합니다. 3D-FRAP에서 얻은 데이터는 작은 RNA가 세포 간 네트워크 내에서 신호 분자로 작용하는 세포 간 유전자 조절의 새로운 경로를 확인합니다.

Introduction

작은 noncoding RNA는 세포 유전자 조절에서 중요한 역할을합니다. 이 분자는 특정 표적 mRNA에 결합하는 20-25 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 번역의 막힘 또는 mRNA 분해 1 또는 2를 유도합니다. miRNA와 siRNA와 같은 작은 RNA에 의해 수행되는 유전자 조절 과정은 많은 다른 종에서 발견 된 매우 보전 된 메커니즘입니다 3 . 특히, miRNA 분자는 증식, 분화 및 재생을 포함한 다양한 생리적 과정에 매우 중요합니다. 또한, miRNA 발현의 조절 장애는 많은 병리학 적 장애로 인한 것입니다. 그에 상응하여, miRNA는 진단을위한 바이오 마커 및 유전자 요법을위한 치료제로서 적합하다는 것이 입증되었습니다 6 , 7

GJ는 분자량이 1kD 인 분자를 확산 교환 할 수있는 인접한 두 세포의 원형질막에 특화된 단백질 구조입니다. 그들은 조직 발달, 분화, 세포 사멸, 암이나 심혈관 질환과 같은 병리학 적 장애에 중요한 것으로 밝혀졌습니다 8 , 9 , 10 . 여러 분자가 이온, 대사 산물 및 뉴클레오타이드를 포함하여 GJ 채널을 통과 할 수 있다고 기술되어 왔습니다. 흥미롭게도 GJ는 작은 RNA 11,12 의 세포 간 이동을위한 경로를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, miRNAs는 생산 된 세포 내에서뿐만 아니라 수용 세포 내에서 작용할 수 있습니다. 이것은 세포 간 신호 전달 시스템에서 miRNA의 역할을 강조합니다. 동시에, 데이터는그 gap junctional intercellular communication은 miRNA 기능과 밀접하게 연관되어있다. 조직 항상성, 병리학 및 진단에 대한 miRNA 및 GJ의 중요한 영향으로 인해 GJ의 기능과 miRNA의 관련 세포 간 역학에 대한 포괄적 인 이해는 miRNA 기반 질병의 메커니즘을 명확히하고 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. miRNA 치료법.

gap junctional coupling의 정도에 따라 세포 간 miRNA 분자의 이동은 매우 신속한 과정이 될 수 있습니다. 따라서, 이들 조절 신호 분자의 빠른 세포 간 이동의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 방법론이 요구된다. 일반적으로 작은 RNA 11 , 12 , 13 , 14 의 왕복을 입증하기 위해 유동 세포 계측법과 분자 생물학적 기술이 적용되었습니다. 그러나 FRAP 마이크로와는 달리이러한 접근법은 GJ를 통한 miRNA 교환을 분석 할 때 높은 시간 해상도가 필요하지 않습니다. 더욱이 FRAP 현미경 검사법은 덜 침습적이므로 여러 세포 유형에서 GJ에 의존하는 분자의 교환을 평가하는 강력하고 새로운 생체 ​​영상 기술입니다 15 , 16 , 17 .

여기, 우리는 cardiomyocytes 사이에 miRNA 셔틀을 평가하는 3D - FRAP의 응용 프로그램을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 목적을 위해, 형광성으로 표지 된 miRNA로 심근 세포를 형질 감염시켰다. 이 miRNA로 표시된 세포는 광 표백되었고, 인접한 세포로부터 다시 유입되는 gap junctional miRNA는 시간 의존적으로 기록되었다. FRAP 실험의 높은 시간 해상도는 살아있는 세포 사이의 miRNA 및 siRNA의 세포 간 전달을 정확하게 평가하기위한 운동 연구를 수행 할 수있는 가능성을 제공합니다. 모레 오ver., 작은 RNA는 매우 다른 동력학을 가진 다른 메커니즘을 통해 교환 될 수 있기 때문에, FRAP 현미경 검사는 GJ가 각각의 왕복 운동 과정에 얼마나 관여 하는지를 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 3D-FRAP은 GJ 투과성의 생리 학적 및 병리학 적 변화와 작은 RNA 전이에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 15 , 19 .

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Protocol

신생아 생쥐가 관련된이 프로토콜의 모든 단계는 Rostock University Medical Center의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 세포 배양 용 접시의 준비 및 심근 세포 배양 용 배지

  1. PBS에서 0.1 % 젤라틴으로 세포 배양 플레이트를 코팅하고 37 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오. 젤라틴을 제거하고 멸균 층류 공기 흐름 하에서 건조 시키십시오.
  2. 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)가 보충 된 DMEM 50 ML로 구성된 세포 배양 배지를 준비합니다. 37 ° C로 예열하십시오.

2. 신생아 심근 세포의 분리

  1. 멸균 가위로 목을 베고 신생아 생쥐 (1 ~ 2 일 된)를 희생시키고 흉골을 따라 가슴을 엽니 다. 포어를 사용하여 가슴을 약간 제거하면서 가슴을 제거하고 심장을 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 24-well plate에 옮긴다.(Ca 2+ 및 Mg 2+ 없이).
  2. 살균 포셉을 사용하여 비 심장 조직 및 큰 혈관을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 1.5 ML 튜브로 청소 마음을 전송하십시오. 효소 소화에는 튜브 당 최대 5 개의 하트를 사용하십시오.
  3. 작은 가위로 가슴을 0.5-1mm³ 이하로 말하십시오.
  4. 다량의 심장을 HBSS로 2 회 씻어 낸다. 1 mL microliter 피펫을 사용하여 HBSS를 흡입 / 첨가한다. 효소를 첨가하기 전에 HBSS를 완전히 제거하십시오.
  5. 신생아 심장의 효소 소화를 위해서는 시중에서 구입할 수있는 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜 ( Table of Materials 참조)을 따르십시오. 35 분 동안 37 ° C에서 효소와 함께 잠복하면서 매 5 분마다 다진 하트가 담긴 튜브를 흔든다.
  6. 비 - cardiomyocyte 분수의 준수를 허용 1.5-2 시간 세포 배양 배지를 포함하는 비 코팅 세포 배양 접시에 종자 세포를 중단. 높은 순도라면이 단계를 반복하십시오.의 심근 세포가 필요합니다. 원하는 경우, 비 - cardiomyocyte 분수를 추가로 배양하십시오.
    참고 : 15 하트의 세포 현탁액의 경우, 75 cm² 세포 배양 플라스크에서 사전 도금 단계를 수행 할 수 있습니다. 일반적으로 한 신생아 심장에서 ~ 5 x 10 5 세포를 얻습니다.
  7. 300 x g에서 10 분간 15 mL 원추형 튜브와 원심 분리기에서 뜨는 물을 수집합니다. 세포 배양 매체 1 ML에 세포를 Resuspend.
  8. Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오.
  9. 플레이트는 3 x 10 5 cells / cm²의 밀도를 지닌 6- 웰 플레이트상의 분리 된 심근 세포를 분리 하였다. 37 밤새 세포를 품어 ° C 5 % CO 2 .
    참고 : 선택적으로이 시점에서 세포를 트랜 스펙 션 할 수도 있습니다. 그러나 일주일 동안 배양 한 후 일렉트로 포 레이션 (electroporation)을 실시 할 때 증가 된 생존력이 관찰되었다.

3. Fluorescently Labeled miRNA를 사용한 형질 감염

  1. 사전 -따뜻한 세포 배양 배지 (단계 1.2 참조)를 수 욕조 또는 이와 동등한 장치에서 37 ° C로 가열합니다.
  2. RNase가없는 멸균 수에서 형광성 miRNA의 20 μM 축적 용액을 준비하십시오.
  3. 90 MM Na 2 HPO 4 , 90 MM NaH 2 PO 4 , 5 MM KCl, 10 MM MgCl 2 및 10 MM sodium succinate가 들어있는 일렉트로 포 레이션 버퍼를 준비하고 7.2로 pH를 조절하십시오. electroporation 버퍼는 -20 ° C에서 몇 개월 동안 저장할 수 있습니다.
  4. 5 분 0.05 % 트립신을 사용하여 문화 요리에서 세포를 분리하십시오. 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화시킨다.
  5. Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오. 10 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
  6. 100 μL 당 4 X 10 5 세포의 농도를 얻기 위해 일렉트로 포 레이션 버퍼에 세포를 Resuspend.
  7. 튜브에 형광 miRNA (최종 농도 : 0.25 μm의)와 세포 현탁액의 100 μL를 혼합하고혼합물을 전기 천공 큐벳에 넣는다.
    1. 세포 유형에 따라 적절한 양의 miRNA를 경험적으로 결정하십시오.
  8. "G - 009"프로그램을 사용하여 일렉트로 포 레이션 장치 (물질 참조)를 사용하여 일렉트로 포 레이션을 수행하십시오.
  9. 사전 예열 세포 배양 매체 500 μL를 추가하고 4 - 웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 우물에 전체 세포 현탁액 (4 X 10 5 세포)을 전송합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하루 동안 세포를 배양하십시오.
    참고 : FRAP 분석의 경우 ~ 80 %의 셀 밀도가 최적입니다. 분류 된 miRNA의 transfection은 electroporation을 사용하여 독점적으로 수행해야합니다. 분류 된 miRNA 분자의 균질 한 분포가 FRAP 측정에 유리하므로, 시약 기반 형질 감염은 권장하지 않습니다.

4. 3D-FRAP 현미경 검사 (3 일) 적용

  1. 현미경 배양기를 37 °로 예열하십시오.C와 열 평형을 확립하고 표류의 가능성을 줄이기 위해 FRAP 측정 전에 적어도 2 시간 공 촛점 현미경 시스템을 전환합니다. 가능하면 5 % CO2 대기를 유지하십시오.
  2. 스테이지 슬라이드 홀더에 챔버 슬라이드를 삽입합니다.
  3. 1.4 NA 오일 대물 렌즈 (400 배율)와 낮은 레이저 출력에서 ​​561 nm의 레이저 여기 광을 사용하여 570-680 nm의 검출 범위로 트랜 스펙 션 된 심근 세포의 클러스터를 찾으십시오.
    참고 : FRAP 설정, 이미지 획득 및 분석의 정의는 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다 ( 재료 표 참조).
  4. "Setup Manager"에서 "z-Stack", "Time Series", "Bleaching"및 "Regions"버튼을 활성화하십시오.
  5. FRAP 매개 변수를 정의하십시오.
    1. "획득 모드"메뉴에서 "프레임 크기"를 설정하여 이미지 획득 설정을 정의하십시오4; 512 x 512, "라인 단계"를 1로, "스캔 시간"을 1 초 미만으로 설정하십시오.
    2. "Channels"메뉴에서 레이저 파워, 오프셋 및 게인 설정을 조정하여 최소 레이저 여기에서 최대 형광을 얻습니다 ( 예 : 레이저 출력 : 1-5 %). 강도 채도를 피하기 위해 조정하십시오. "핀홀 크기"를 2 μm로 설정하십시오.
    3. 다음으로 "Regions"메뉴에서 "ROI drawing tool"을 선택하고 커서를 사용하여 대상 셀, 참조 셀 및 배경 영역을 표시합니다. 필요한 경우, 표백을 위해 여러 표적 세포를 선택하십시오.
    4. "표백"메뉴 ( 예 : 반복 : 9-14, 광 표백을위한 레이저 출력 : 100 %, 이미지 획득 간격 : 60 초,주기 : 15)에서 표백 설정을 조정하십시오. 3 회 초기 스캔 후 표백 시작을 정의하십시오.
    5. "z-Stack"메뉴에서 셀의 두께에 따라 Z- 스택 획득을위한 한계를 정의하십시오. "숫자 o 조정f z-layers "를 12 - 15로 설정합니다.
    6. FRAP 실험을 시작하고 형광 복구를 기록합니다.
      참고 : FRAP 실험의 설정은 세포 유형, 형광 염료 및 현미경 시스템에 따라 다르므로 파일럿 실험을 수행하여 FRAP에 대한 최적 매개 변수를 결정하는 것이 가장 좋습니다. 표백은 초기 형광 강도를 50 % 이상 줄이는 데 충분해야합니다. 일반적으로 형광 복구는 고원 단계에 도달 할 때까지 30-60 초마다 기록해야합니다.

5. 데이터 분석

  1. 획득 한 z- 스택의 최대 투사를 생성하고 표백 된 표적 세포, 참조 세포 및 배경의 형광 강도 값을 얻습니다. 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 "Processing"→ "Maximum intensity projection"→ 파일 선택 → "Apply"를 클릭하십시오.
    1. 또는, 동급 이미지 분석 도구 (
  2. 대상 세포, 배경 및 참조 세포의 모든 시점에서 형광 강도 데이터를 스프레드 시트에 복사합니다.
    1. 획득 과정에서 발생한 photobleaching을 수정하기 위해 대상 세포의 강도 값에서 참조 셀의 배경 강도와 강도를 뺍니다. 각 시점에 대한 배경 및 기준 셀 보정을 수행하십시오.
    2. 표백 전 초기 형광 강도로 각 값을 나눔으로써 보정 된 FRAP 데이터를 초기 형광 강도로 표준화하십시오.
    3. FRAP 곡선을 얻으려면 각 시점의 강도 값에서 빼서 표백 직후의 형광 강도로 기준선을 설정하십시오.

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Representative Results

여기, 신생아 cardiomyocytes 이내 형광 miRNA의 간격 junctional 셔틀을 연구 비 침습적 인 기술로 3D - FRAP 현미경을 제시합니다. 분리 된 심근 세포는 전형적으로 흘린 α- 액티 닌 패턴을 나타내었고, 세포 간 경계 ( 그림 1A , 흰 화살촉)를 따라 Cx43의 큰 플라크를 포함하여 분자간의 높은 세포 간 플럭스를 허용했다. 단리 된 심근 세포의 순도는 α-actinin 양성 세포의 현미경 적 정량으로 평가 하였다. 일부 비 - 심근 세포 (α- 악티닌 - 음성 세포)가 배양 물에 존재 하였지만, 신생아의 심근 세포는 분리 후 주요 세포 유형을 나타내었다 (79.62 ± 3.68 %, 도 1B ).

miRNA의 gap junctional exchange를 조사하기 위해 세포를 형광 표지 된 miRNA로 형질 감염시켰다. 엘ctroporation은 높은 형질 감염 효율과 transfection 된 화합물의 균질 한 분포를 보장하기 때문에 세포에 miRNA 분자를 전달하기위한 선택 방법이며, 이는 FRAP 분석에 필수적입니다. 우리 실험 설정에서, 우리는 유동 세포 계측법 ( 그림 2A )에 의해 결정, ~ 45 %의 transfection 효율을 달성했습니다. FRAP에 대한 cardiomyocytes의 준비는 문화 플레이트에서 분리, electroporation, 그리고 챔버 슬라이드에 다시 첨부가 포함됩니다. Flow cytometric live / dead assay는 대다수의 세포가 높은 생존력을 나타냄을 보여 주었으며, gap junctional communication ( 그림 2B )을 분석 할 때 중요합니다. 또한, 세포 밀도는 FRAP 결과에 영향을 미치는 중요한 매개 변수입니다. 최적의 FRAP 측정을 위해서는 세포 클러스터의 형성과 세포 간의 기능적 갭 접합부의 형성을 고려하여 ~80 %의 밀도로 세포를 파종해야합니다 ( 그림2C).

FRAP 분석을 위해 표적 세포는 세포 클러스터 내에서 선택되고 100 % 레이저 출력으로 광표백되어 선택된 세포에서 감소 된 miRNA 형광을 유도합니다 ( 그림 3A , 표백제). 결과적으로, 형광 복구는 표백 된 영역에 인접한 세포에서 miRNA의 전송을 시각화하기 위해 기록됩니다. 형광 회복의 고원 단계가 13 분 후에 도달했기 때문에,이 시간 범위는 FRAP 실험에서 이미지 획득에 사용되었다. 수집 된 데이터의 정량 분석 ​​및 표준화는 평균 20 %의 회복을 나타냅니다. 이 데이터는 또한 FRAP 현미경 검사로 높은 시간 해상도로 miRNA 셔틀을 신속하게 기록 할 수 있음을 입증했습니다. 염료 특성에 따라 획득 매개 변수를 변경하여 시간 해상도를 추가로 높일 수 있습니다.

3D-FRAP을 사용하면다른 조건 하에서의 miRNA에 대한 GJ 투과성의 비교. 이를 증명하기 위해 Cx43의 siRNA 매개 knockdown을 유도하여 단백질 발현을 감소시키고 ( 그림 3C ) gap junctional communication의 억제를 유도했습니다. 결과적으로 형광 회수율이 50 % 이상 감소하여 miRNA 전이 효율이 세포 간 갭 접합 결합 정도에 크게 의존한다는 것을 나타냅니다 ( 그림 3B , Cx43 knockdown). 형광 복구가 분리 Dy547 - 태그 대신에 형광으로 표지 된 miRNA의 통과를 반영하는지 확인하기 위해, 우리는 또한 calcein 염료에 대한 FRAP 데이터를 획득했습니다 ( 그림 3D ). Calcein은 Dy547에 필적하는 분자량을 가지며 따라서 유사한 전달 역학을 보유합니다. Dy547- 표지 된 miRNA의 형광 회수와 대조적으로, 칼 세인은 증가 된 갭 접합 교환을 나타내며, 이는 Dy547 태그 imiRNA 분자로부터 분리되지 않았습니다 ( 그림 3D ).

안정된 초점 조건은 특히 장기 측정을 수행 할 때 FRAP 실험 전반에 걸쳐 필수적입니다. 2D 애플리케이션에 비해 3D-FRAP은 잠재적 인 포커스 드리프트를 보완 할 수 있습니다. 그림 4 에서 볼 수 있듯이 약간의 초점 변경만으로도 단일 2D 레이어가 FRAP 실험에 사용되는 경우 miRNA의 형광 신호 감지에 영향을 미칩니다 ( 그림 4B ). 대조적으로, 3D-FRAP의 경우, 표적 세포의 전체 z- 스택이 기록되고 최대 투사가 데이터 분석을 받게됩니다 ( 그림 4A ). 포커스 드리프트가 표준화 된 형광 - 세기 곡선에 미치는 영향은 도 4c 에 묘사된다. 형광 복구가 3D-FRAP에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하는 반면, 2D-FRAP 획득은 감소 함 of 형광 신호.

초점 변화에 대한 보상과 더불어 3D-FRAP은 또한 miRNA의 gap junctional exchange의 공간 데이터를 제공합니다. 그림 5 는 FRAP 실험의 3D 표면 렌더링을 보여줍니다. 최대 투영과 비교하여, z- 스택의 획득은 세포 내 miRNA의 위치 및 이동성을 조사하기 위해 3D 재구성을 생성하는 데 사용될 수 있습니다 ( 그림 5 ). 세포 기관과 공동 표지하면 miRNA 전달에서 다른 세포 구성 요소의 관련성을 조사 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : 고립 된 신생아 Cardiomyocytes의 대표 현미경 이미지. ( A ) 구조 조명 현미경 검사는 Cx43의 높은 발현을 보여 주며, 이것은 큰 p세포 - 세포 경계 (화살촉)에 laques. 인접한 세포와의 GJ 형성의 발음은 miRNA를 포함한 작은 분자의 광범위한 교환을 가능하게합니다. 스케일 바 = 20 μm ( B ) 분리 된 심근 세포의 순도. α-actinin 표지는 격리 후 주요 세포 유형을 나타내는 것으로 나타났습니다. 스케일 바 = 50 μm. 세포를 항 Cx43 (녹색) 및 항 -α- 액티 닌 항체 (적색)로 염색 하였다. 핵은 DAPI (파란색)를 사용하여 가시화되었습니다. 구조 조명 현미경 및 면역 학적 표지에 대한 설명은 이전의 간행물 20 에서 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도표 2 : Transfection 효율성, 생존 능력 , 신생아 심근 세포 배양의 세포 밀도. ( A ) 유동 세포 계측법은 miR547 일렉트로 포 레이션이 ~ 45 %의 형질 감염 효율을 나타냄을 보였다. ( B ) FRAP에 사용되는 cardiomyocytes의 세포 생존 능력. 분리, 전기 천공 및 재 부착 후, 심근 세포는 살아있는 세포 및 죽은 세포의 염색을 실시하여 높은 세포 생존력을 보였다. FRAM 현미경 검사를 위해 준비된 mir547 - transfected cardiomyocytes의 현미경 이미지 ( C ). 80-90 %의 세포 밀도는 갭 접합 세포 - 세포 접촉의 현저한 형성을 보장한다. 스케일 바 = 50 μm. 트랜 스펙 션 효율 및 생존력 염색의 유동 세포 계측 분석 방법은 이전의 공보 20 , 21 에 언급되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 : 신생아 심근 세포에서 miRNA의 GJ 의존적 교환. ( A ) FRAP 실험의 대표 이미지. 표지 된 miRNA로 형질 감염시킨 후 세포 클러스터 내의 표적 세포를 강한 레이저 펄스 (표백제 대 표백제)로 표백합니다. 간격 결합 결합의 정도에 따라, 인접한 세포로부터 miRNA의 갭 접합 유입은 표백 된 표적 세포 (표백제 t = 3, 6, 9 및 13 분)에서 증가 된 형광 강도를 초래한다. Scale bar = 20 μm ( B ) 획득 된 FRAP 데이터의 정량 분석은 13 분 후에 20 %의 형광 회복을 보여줍니다. miRNA의 세포 내 전달에 관여 GJ를 확인하기 위해 cx43 knockdown이 수행되어 형광 복구 (50 %)가 크게 감소했습니다. ( C ) 항 -Cx43을 이용한 면역 염색항체 및 후속 공 촛점 현미경 검사는 단백질 수준에서 Cx43 넉다운 효율을 입증합니다. 스케일 바 = 50 μm. ( D ) miR547 및 calcein 염료의 FRAP 데이터의 비교는 다른 전달 역학을 보여줍니다. calcein의 분자량이 작을수록 dy547- 표지 된 miRNA 분자에 비해 형광 회수가 증가했습니다. FRAP 곡선은 평균 ± SEM으로 나타낸 n≥56 세포의 데이터를 요약합니다. 통계 분석은 양방향 ANOVA와 Bonferroni post-hoc test (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001)를 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 3D-FRAP 현미경을 이용한 초점 표류 보정. ( B ) photobleached 세포 (빨간색 선)의 대표 이미지는 3D 및 2D - FRAP 실험 중 형광 강도에 초점 표류의 영향을 보여줍니다. ( A ) 3D-FRAP에서 z-stack은 각 시점에 대해 기록되고 최대 투영은 데이터 드리프트에 사용되며 포커스 드리프트를 수정합니다. 스케일 바 = 20 μm. ( B ) 반대로 2D-FRAP의 경우 단 하나의 2D 레이어 만 데이터 분석을 받게됩니다. 따라서 전체 형광 강도는 초점 변화에 의해 크게 감소합니다. 스케일 바 = 20 μm. ( C ) 3D 및 2D-FRAP 실험의 대표 표준화 형광 강도 곡선은 초점 회복의 형광 이동에 대한 강한 영향을 나타내며 세포 간 miRNA 왕복 운동을 연구 할 때 3D 획득의 이점을 보여줍니다. th의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.숫자입니다.

그림 5
그림 5 : 3D-FRAP 실험의 3D 표면 렌더링. (왼쪽) FRAP 측정의 최대 투영입니다. photobleached 세포 (빨간색 프레임)는 인접 세포에서 miRNA 전송으로 인해 형광 강도의 증가를 보여줍니다. (오른쪽) 같은 photobleached 세포 (빨간색)의 인수 z - 스택은 miRNA의 공간적 분포를 시각화하기 위해 3D 표면 렌더링을 받았다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

miRNA는 세포 생리학에서 중요한 역할을 담당하며, 다른 것들 중에서도 GJ를 세포 간 교환을위한 경로 11 , 12 , 22 로 사용함으로써 신호 분자로 작용하는 것으로 나타났습니다. 현재 프로토콜 세포 클러스터 내에서 형광 miRNAs를 사용 하여이 GJ 의존 shuttling을 특성화 하는 체외 라이브 셀 이미징 기술을 제공합니다.

프로토콜은 세포 모델 시스템으로 cardiomyocytes에 개발되었습니다. 그러나, electroporation이 miRNA transfection에 적합한 방법이라면이 접근법은 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 세포 간 교환 외에도 제시된 기술은 miRNA 분자의 세포 내 이동성을 조사하는데도 적합합니다 ( 예 : 세포 내에서 가능한 전달 메커니즘의 확인을 위해) 23 , 24 .

FRAP 현미경에 의한 miRNA 전달에 대한 연구는 형광 태그가 붙은 miRNA 분자가 필요합니다 ( 그림 2 ). 특정 세포 miRNA의 라벨링이 가능하지 않기 때문에 외래성의 도입 된 miRNA만을 3D-FRAP에 사용하여 세포 간 이동성을 분석 할 수 있습니다 우리의 실험에서 세포는 250 nM miRNA로 형질 감염되었으며이 농도는 세포 당 miRNA 수준이 10에서 50,000 분자 인 생리적 조건에 비해 훨씬 높았다 27,28. 이러한 저농도는 FRAP 실험에는 사용할 수 없다. 특정 수준의 형광성 miRNA 분자는 충분한 형광 신호를 얻고 배경 형광과 형광 표지 된 miRNA 사이의 적절한 식별을 보장하기 위해 필요합니다. 그러나 공 촛점 이미징 시스템과 염료 특성에 따라 낮은 miRNA 농도 사용 FRAP 분석을 위해서는 -nM 범위가 가능해야합니다. </ p>

유동 세포 계측법, PCR 및 루시퍼 라제 기자 분석을 포함한 세포 간 miRNA 전달을 연구하기 위해 서로 다른 기술이 일반적으로 적용됩니다 12 , 13 . 이러한 방법은 낮은 시간 해상도 ( 즉, 수 시간에서 수일)로 miRNA 셔틀 링을 감지합니다. 반대로, 3D-FRAP 현미경은 실시간으로 miRNA 전달 및 이동성의 시각화 및 정량화를 가능하게합니다. gap junctional 세포 - 세포 접촉에 더하여, miRNA의 세포 간 왕복 운동은 엑소 좀 18 , 29 , 30 과 같은 다른 메커니즘에 의해 매개된다. 3D-FRAP만이 exosomal과 gap junctional transfer를 구별하기에 충분히 높은 시간 해상도를 제공한다. 따라서, 그것은 다른 병리학 적 또는 생리 학적 조건 하에서의 miRNA 시그널링에 대한 GJ 투과성의 직접 효과에 대한 구체적인 조사를 허용한다 ( Figu2).

기존 2D-FRAP보다 우수한 3D-FRAP을 사용하는 것이 좋습니다. GJ 종속 miRNA 전송에 대한보다 정확한 데이터를 제공하기 때문입니다. 3D-FRAP 측정에는 전체 셀 볼륨이 포함되며, 이는 대형 벌크 셀 유형을 사용할 때 중요합니다. 또한, 2D-FRAP에서 형광 복구를 현저하게 저해하는 것으로 밝혀진 초점 변경 또는 세포 이동을 보정 할 수 있습니다 ( 그림 3 ). 마지막으로, 3D-FRAP 실험에서 z- 스택의 기록은 공간 정보를 얻을 수있는 가능성을 제공하는데, 단 하나의 2D 레이어가 형광 강도 분석에 사용되는 경우에는 가능하지 않습니다 ( 그림 3B ).

형광 복구는 인접한 세포로부터의 miRNA의 유입에 의존하기 때문에 표백 된 세포에 연결된 세포의 수는 중요하며 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해서는 여러 측정에서 유사해야합니다. 따라서 높은 셀 밀도가 필요합니다.FRAP 분석에 가장 적합한 세포 성 클러스터의 형성을 보장한다. 또한 높은 레이저 강도로 인한 광독성 효과를 피하기 위해 가벼운 표백 조건 ( 예 : 레이저 출력, 표백 시간 및 스캔 설정)을 선택하기위한 사전 실험을 수행해야합니다 25 , 26 . 이것은 또한 획득 과정에서 발생하는 photobleaching을 줄이는 데 도움이됩니다.

한계에도 불구하고, 우리의 데이터는 3D-FRAP이 세포 네트워크 내에서 신호 분자로 miRNA의 역할을 평가하는 강력한 도구라는 것을 보여줍니다. 특정 miRNA에 대한 miRNA shuttling 또는 GJs의 선택적 투과성에 대한 connexin 조성의 영향은 운송 효율의 직접적인 정량화를 통해 해결할 수 있습니다. 3D-FRAP은 배포를 용이하게하는 적절한 조건을 정의하는 등 miRNA 및 siRNA를 특징으로하는 새로운 치료법 개발을 향상시키는 데 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다GJ 네트워크 를 통해 작은 RNAs n 개 31 , 32 .

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Disclosures

저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 연구는 연방 교육 연구부 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), 유럽 연합 구조 기금 (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 및 ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) 및 독일 심장 재단 (F / 01 / 12). 또한 RD는 Rostock University Medical Center (889001)의 FORUN 프로그램, DAMP Foundation 및 BMBF (VIP + 00240)의 지원을받습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

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