Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Published 8/01/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Detta manuskript beskriver metoder för tillämpning av peptidmikroarray-teknik för specificitetsprofilering av antikroppar som känner igen histoner och deras posttranslationella modifikationer.

Cite this Article

Copy Citation

Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Post-translationella modifieringar (PTM) på histonproteiner studeras allmänt för sina roller vid reglering av kromatinstruktur och genuttryck. Massproduktionen och distributionen av antikroppar specifika för histon PTM har underlättat forskning på dessa märken. Eftersom histon-PTM-antikroppar är nyckelreagenser för många kromatinbiokemiapplikationer är rigorös analys av antikroppsspecificitet nödvändig för noggrann datatolkning och fortsatta framsteg inom området. Detta protokoll beskriver en integrerad rörledning för konstruktion, tillverkning och användning av peptidmikroarrays för profilering av specificiteten hos histonantikroppar. Design och analys aspekter av detta förfarande underlättas av ArrayNinja, ett open source och interaktivt mjukvarupaket som vi nyligen utvecklat för att effektivisera anpassningen av microarray-utskriftsformat. Denna rörledning har använts för att skärpa ett stort antal kommersiellt tillgängliga och allmänt använda histon PTM-antikropparS, och data som genereras från dessa experiment är fritt tillgängliga genom en online och expanderande Histone Antibody Specificity Database. Utöver histoner kan den allmänna metod som beskrivs häri appliceras i stor utsträckning till analysen av PTM-specifika antikroppar.

Introduction

Genomiskt DNA packas elegant inuti den eukaryota cellkärnan med histonproteiner för att bilda kromatin. Den repeterande subenheten av kromatin är nukleosomen, som består av 147 baspar av DNA lindade runt en oktamert kärna av histonproteiner - H2A, H2B, H3 och H4 1. Kromatin är brett organiserad i löst packade eukromatin och tätt packade heterochromatindomäner. Graden av kromatinkomprimering reglerar i vilken utsträckning vilka proteinmaskiner kan komma åt det underliggande DNA för att utföra grundläggande DNA-templerade processer såsom replikation, transkription och reparation.

Huvudregulatorer av genomtillgänglighet i samband med kromatin är PTM på de ostrukturerade svans- och kärndomänerna hos histonproteinerna 2 , 3 . Histon PTMs fungerar direkt genom att påverka strukturen hos kromatin 4 och indirektH rekryteringen av läseproteiner och deras associerade makromolekylära komplex som har kromatinkonstruktion, enzymatisk och ställningsaktiviteter 5 . Studier av histon PTM-funktion under de senaste två decennierna föreslår överväldigande dessa märken spelar nyckelroller för att reglera celllina, organismutveckling och sjukdomsinitiering / progression. Fueled av framsteg i masspektrometribaserad proteomteknik har mer än 20 unika histon-PTM på mer än 80 olika histonrester upptäckts 6 . I synnerhet förekommer dessa modifieringar ofta i kombinationer och i överensstämmelse med "histon-kod" -hypotesen, visar många studier att läsareproteiner är riktade mot diskreta områden av kromatin genom igenkänning av specifika kombinationer av histon PTMs 7 , 8 , 9 . En viktig utmaning framöver är att tilldela funktioner till grPå grund av en lista över histon PTM och för att bestämma hur specifika kombinationer av histon PTM orkestrerar de dynamiska funktionerna som är associerade med kromatin.

Antikroppar är lynchpinreagenserna för detektering av histon-PTM. Som sådan har mer än 1000 histon-PTM-specifika antikroppar utvecklats kommersiellt för användning vid kromatisk biokemiforskning. Med den snabba utvecklingen av DNA-sekvenseringsteknologi med hög genomströmning används dessa reagenser i stor utsträckning av enskilda utredare och storskaliga epigenomiska "roadmap" -initiativ ( t.ex. ENCODE och BLUEPRINT) i ChIP-seq (kromatinimmunutfällning kopplad till nästa generations sekvensering ) Rörledningar för att generera högupplösande rumsliga kartor över histon-PTM-fördelningsgenombrett 10 , 11 . Nya studier har dock visat att specificiteten hos histon-PTM-antikroppar kan vara mycket variabel och att dessa reagenser uppvisar oförmåga Skäliga egenskaper som off-target-epitopigenkänning, starkt positivt och negativt inflytande av närliggande PTM, och svårigheter att diskriminera modifieringsordningen på en viss rest ( t.ex. mono-, di- eller tri-metyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Därför är en stringent kvalitetskontroll av histon PTM-specifika antikroppreagens nödvändiga för att noggrant tolka data som genereras med dessa värdefulla reagens.

Microarray-teknik möjliggör samtidig utfrågning av tusentals makromolekylära interaktioner i ett genomskinligt, reproducerbart och miniatyriserat format. Av denna anledning har en mängd olika mikroarrayplattformar skapats för att analysera protein-DNA 19 ,"> 20, proteinprotein 21 och proteinpeptid-interaktioner 22. I själva verket har histonpeptidmikrorays uppstått som en informativ upptäcktsplattform för kromatinbiokemiforskning, vilket möjliggör hög genomströmningsprofilering av författarna, raderarna och läsarna av histon PTM 15 , 23, 24, och även för analys av histon antikroppsspecificitet 17, 25. Utöver deras tillämpning i kromatin och epigenetik forskning, histon peptid arrayer har potentiell användbarhet som ett diagnostiskt / prognostiskt test för systemisk lupus erythematosus och andra autoimmuna sjukdomar där anti- Kromatin-autoantikroppar genereras 26 , 27 .

Här beskriver vi en integrerad pipeline som vi har utvecklat för att designa, tillverka och queRita histonpeptidmikroarrays för att generera specificitetsprofiler för antikroppar som känner igen histoner och deras PTM. Ledningen underlättas av ArrayNinja, en öppen källkod, interaktiv programvara som vi nyligen utvecklat, vilket integrerar design och analysstadier av mikroarray-experiment 28 . ArrayNinja fungerar bäst i Google Chrome. I korthet används en robotkontakt-mikroarrayskrivare för att deponera ett bibliotek av biotinkonjugerade histonpeptider vid definierade positioner på streptavidinbelagda glasmikroskopskivor. Arrays kan sedan användas i ett kompetitivt och parallellt analysformat för att förhöra antikropp-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består av hundratals unika syntetiska peptider som innehåller PTM (lysinacetylering, lysin / argininmetylering och serin / treoninfosforylering) ensam och i relevanta kombinationer som i stor utsträckning härstammar från proteomikdataset. Metoder för peptidsyntes och validering Beskrivs annorstädes 23 . Data som genereras av våra pågående histon-PTM-antikroppsskärmningsansträngningar som utnyttjar denna arrayplattform arkiveras på en offentlig webbresurs, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). I synnerhet har histonpeptidmikroarrays tillverkad med variationer av detta protokoll också använts i stor utsträckning för att karakterisera aktiviteten hos histon-PTM-läsarens domäner 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 och mer nyligen för att profilera histon PTM-författare och suddgummi 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tecknadspåvisning av stegvis procedur för antikroppsscreening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerade histonpeptider som innehåller definierade posttranslationella modifieringar (röda och blå cirklar) trycks med biotin-fluorescein på streptavidinbelagd glas. Positiva interaktioner visualiseras som röd fluorescens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installera och köra ArrayNinja

  1. Hämta och installera Oracle Virtual Box från www.virtualbox.org.
  2. Hämta och komprimera ArrayNinja virtuella maskin (VM) från http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. Öppna Virtual Box och lägg till ArrayNinja VM genom att klicka på "Maskin", "Lägg till" och välj arrayninja.vbox från mappen där ArrayNinja VM har sparats.
  4. Starta ArrayNinja genom att välja den i Virtual Box och klicka på den gröna "start" -pilen.
  5. Virtual Box öppnar ett nytt fönster och visar ett meddelande om att VM kan nås genom att navigera webbläsaren till localhost: 2080.60; OBS! En containerformad version av ArrayNinja är också tillgänglig via hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. Utforma Array Slide och Source Plate Layout

  1. Under rubriken Planera en bilddiagram på ArrayNinja-gränssnittet, klicka på länken som motsvarar microarray-skrivaren som används.
    OBS: ArrayNinja har programmerats för att efterlikna robotrörelsen för två vanliga microarray-skrivare (se tabell1). Kompatibilitet med andra arrayer kan konfigureras på begäran.
  2. Klicka inuti dialogrutan "Belastningsplatta", skriv "tom" och klicka "enter". Se Figur 2 för en skärmdump av designmodulen ArrayNinja.
  3. Justera punktdiametern till 275 μm och spotavståndet till 375 μm. Justera de återstående inställningarna (Plate Blocks / Plate row, Totalt plåt rader, replikerar, funktioner i y, Super Arrays, SuperA fudge, se Figur 2 ) för att anpassa hur funktionerna kommer att visas på microarray-bilden.
    OBS: Spotdiametern bestäms av storleken på microarray-stiftet. Eftersom dessa inställningar justeras, uppdateras teckensnittet i realtid. Använd den här tecknen för att förhandsgranska hur varje inställning ändrar den slutliga bildlayouten.
  4. När layouten av funktioner på bilden har slutförts, musera över varje unik egenskap och ange funktionsidentifikatorn i popup-dialogrutan.
    OBS: Funktionsidentifierare kan bestå av siffror, bokstäver eller kombinationer. Detta krävs bara för unika funktioner, och en dialogruta visas inte när replikat är markerat.
  5. När alla unika funktioner har tilldelats en identifierare klickar du på "fyll i". Ange ett namn för bildlayouten och klicka på "skriv ut din platta" för att spara. En ny sida öppnas som visar antalet 384-brunnskällplattor som behövs för att tillverka den valda bilden och en tabell som kartlägger den fysiska platsen för varje funktion som ska laddas i källplattan.
    OBS! Kom ihåg det här namnet, eftersom det kommer att användas för att återkalla denna design när du analyserar mikroarraydata (se avsnitt 6.2). Genom att klicka på "skriv ut din platta" sparar du layouten inom ArrayNinja.

Figur 2
Figur 2: ArrayNinja Design Module. Ett skärmskott av ArrayNinja designmodul visas i streckad linje. Kontrollpanelen (överst) visar alla parametrar som kan ändras på microarray-skrivaren. Eftersom dessa parametrar justeras, uppdateras tecknade bilden av bildspelet (längst ner till vänster) i realtid. När layouten är inställd kan användaren musa över enskilda fläckar för att ange unika funktionsidentifierare. ArrayNinja-konstruktioner från den här användaren matar in en karta över positionen för varje funktion i källplattan (-erna) (längst ner till höger) som behövs för att tillverka en specificerad diabild-layout. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Tillverkning av mikroarrayer

  1. Förbereda källplattan
    1. Använd kartan som genererats med ArrayNinja i avsnitt 2.5 för att skapa 384-brunnskällans platta (r).
      OBS! Detaljerade beskrivningar av peptider som efterfrågas på denna plattform finns på annat hållS = "xref"> 17.
    2. Deponera 1 - 2 μl av varje funktion ( t.ex. biotinylerad histonpeptid) i den korrekta brunnen av 384-brunnskällans platta (r).
      ANMÄRKNING: Biotinylerade histonpeptider avsätts typiskt från 200 till 400 μM stamlösningar, vilket motsvarar 10 till 25 gånger molärt överskott av peptid till streptavidinbindningsställen i en enda array-plats. Detta beräknas med hjälp av ekvationen:
      Ekvation
      Där V är volymen som levereras med en stift, [ P ] är koncentrationen av funktionen tryckt, N A är Avogadros nummer och S är ytan på en punkt. C är täckningen av glidanordningen, uttryckt som antalet streptavidinmolekyler per areaarea multiplicerat med tre (det genomsnittliga antalet tillgängliga streptavidinbindningsställen). V och C erhålls av respektive tillverkares. Andra funktioner kanKräver olika koncentrationer beroende på storleken på biomolekylen där trängsel kan vara ett problem. En rad tryckkoncentrationer för varje ny typ av funktion bör testas empiriskt för att bestämma den optimala tryckkoncentrationen.
    3. Späd varje funktion 10 gånger med 1x tryckbuffert kompletterad med 1% bovint serumalbumin (BSA). Spin källplattan / -brickorna vid 500 xg i 2 minuter vid rumstemperatur.
      ANMÄRKNING: Inklusion av fluoresceinmärkt biotin (5 μg / μl) i tryckbufferten rekommenderas som spottstyrning och som visuellt hjälpmedel för att underlätta korrekt matrisinriktning under analysen (se Figur 4 ).
  2. Utskriftsprotokoll ( Figur 3A - B ).
    1. Förbered arrayen genom att tömma behållaren för avfallsuppsamling och fylla behållaren med behållare och luftfuktare i tvättlösningen med sterilt destillerat vatten.
    2. Ange parametrarna uSed för att designa objektglaset i ArrayNinja (sektion 2 och figur 2 ) i microarray skrivarens kontrollprogram.
    3. Med hjälp av microarray skrivare kontrollprogrammet ställer du in tvättproceduren för en 1 s tvätt med en nedsänkning. Ställ in eftervattensinställningarna för att återpipa tapparna 5 gånger efter varje tvätt. Ställ in fuktigheten till 60%.
      OBS! Den optimala tvättkonfigurationen kan variera beroende på vilken mikroarrayskrivare som används. Den optimala eftermonteringsstiftet kan skilja sig beroende på vilken mikroarrayskrivare som används.
    4. Sätt in funktionaliserade glidbanor ( t.ex. streptavidinbelagda glas) i substratplattorna och placera alla plåtar i plåthissen. Sätt i källplattan / -plattorna i platthållaren och sätt i källplattans hiss.
    5. Klicka på "skriv ut". Övervaka utskriftsprocessen för några omgångar av funktionen avsättning för att säkerställa att alla tvätt- och doppinställningar är korrekta. När utskriftstiden är klar, ta bortSubstratplattorna från matrisen.
      OBS! Om stora utskrifter förhindrar slutförandet av blockeringssteg inom en dag kan tryckta objektglas inkuberas i en fuktad kammare vid 4 ° C över natten. Inkubera bilderna bredvid en liten bägare vatten i en kartonglåda förseglad med plastfolie.
    6. Blockera glidbanorna med blockeringsbuffert i 30 minuter vid rumstemperatur med blandning.
    7. Tvätta bilderna 2 x 10 min vid rumstemperatur i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,6 med blandning. Torka glidarna genom att spinna i en mikroarray glidcentrifug i 30 s vid rumstemperatur.
      OBS! För att bearbeta ett stort antal bilder på en gång kan en tvättkammare med hög genomströmningsdisplay användas, vilket möjliggör 50 skivor att tvättas parallellt.
    8. För diabilder som är avsedda att delas med vax, fortsätt till avsnitt 4.1. För alla andra mönster, förvara glidbanor vid 4 ° C skyddad mot ljus och fukt.
      OBS: Tryckta biotinylerade histonpeptiderÄr stabila i minst 6 månader när de lagras på detta sätt.

4. Partitionering Microarray Slides

  1. Hydrofob vaxpenna ( figur 3C )
    1. Applicera vax runt de områden som innehåller funktioner med en vaxpenna. Låt vaxet lufttorka i 5 min innan du fortsätter till avsnitt 5.
      OBS: Efter blockeringen kan arrayfläckarna vara mycket svåra att visualisera genom ögat. Slidesignalen från ArrayNinja kan tryckas på skalan och användas som vägledning för applicering av vax.
  2. Silikonpackning ( Figur 3D )
    1. Skala bort den klara filmen på baksidan av matningspackningen och placera den vidhäftande sidan ner på microarray-bilden.
    2. Håll packningen på plats i 5 s innan du fortsätter till avsnitt 5.
  3. Wax Imprint ( Figur 3E )
    1. För diabilder som är avsedda att partitioneras av vax, skriv ut en testglas på vanligt glas med 10% BSA. Använd den här testdisplayen för att optimera wax imprinter guider eller array inställningar för att säkerställa att alla funktioner kommer att ligga inom vaxformkamrarna.
    2. Värm mikroarray vaximprinter till 85 ° C tills allt vaxet är helt smält, ca 30 min.
    3. Sätt in bilden med den tryckta sidan vänd nedåt och skjut gliden helt åt höger på microarray-imprinteren. Dra upp spaken för att bringa formen i kontakt med glidytans yta. Håll i 2 s.
      OBS: Hålltiden kan ändras för att uppnå optimal vaxgränstjocklek.
    4. Ta snabbt bort glidret och visuellt inspektera vaxgränserna för att säkerställa att alla brunnar är inneslutna och att gränserna inte är så tjocka att de inkräktar på fläckarna. Förvara glidbanorna vid 4 ° C skyddad mot fukt och ljus.
      OBS: Hålltiden kan ökas eller minskas för att få tjockare eller tunnare gränser.

"Figur Figur 3: Microarray Fabrication. (A) Histonpeptid-mikroarray-tillverkning på streptavidin-belagda mikroskopskivor med hjälp av en mikroarray-skrivare. (B) Microarrays tillverkad med 3 subarrays av ett 48 x 48 rutnät med peptidegenskaper. Separation av (C) 3-subarrays med en hydrofob vaxpenna, (D) 2-subarrays med ett kiselhäftande medel och (E) 48-subarrays med ett vaxavtryck. Alla visade mikroarrayer tillverkas med 25 x 75 mm mikroskopglas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

5. Hybridisering av en histon PTM-antikropp med en peptidmikroarray

  1. Förbered hybridiseringsbuffert (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
  2. Equilibrera bilden i hybridiseringsbuffertenMed användning av ett hybridiseringskärl. Helt täck hela hatten i hybridiseringsbufferten och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C på en orbital shaker vid låg hastighet.
  3. Bered en lösning innehållande utspädd histon-PTM-antikropp i hybridiseringsbuffert.
    OBS: I exempeldata utspäddes både histonantikropp nr 1 och antikropp nr 2 1: 1000 i hybridiseringsbuffert. Ett utspädningsområde som liknar det som används för immunoblottning rekommenderas som utgångspunkt.
  4. Inkubera matrisen med antikroppslösningen under 1 timme vid 4 ° C. Ta bort antikroppslösningen och tvätta matrisen 3 gånger i 5 minuter vid 4 ° C med kallt PBS, pH 7,6.
  5. Förbered en 1: 5000 - 1: 10 000 utspädning av fluorescerande färgämne-konjugerad sekundär antikropp i hybridiseringsbuffert.
  6. Inkubera matrisen med sekundär antikroppslösning under 30 min vid 4 ° C skyddad mot ljus. Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta mikroarrayskenan 3 gånger under 5 minuter vid 4 ° C med PBS, pH 7,6. DoppMikroarrayen i ett 50 ml koniskt rör innehållande 0,1x PBS, pH 7,6 för avlägsnande av överskott av salt vid rumstemperatur. Torka gliden i en mikroarray glidcentrifug vid rumstemperatur.
  7. Skanna objektglaset med en microarray-skanner med 25 μm upplösning eller högre, efter Microarray Scanner-tillverkarens rekommenderade scanningsprotokoll.
    OBS! Om det finns fluoresceinmärkt biotinspårare, skanna både den gröna kanalen (ex: 488 nm, em: 509 nm) och kanalen som motsvarar den fluorescerande färgämne-konjugerade sekundära antikroppen, typiskt röd (ex: 635 nm, em : 677 nm). Målet med skanning är att skaffa enstaka .tif-filer som kan slås samman i en enda .png-fil (som beskrivs i avsnitt 6.1).

6. Analys av Microarray Data med användning av ArrayNinja

  1. Förbereder en sammanslagen mikroarraybild
    OBS! Målet med det här avsnittet är att skapa en .png-bildfil som sammanfogar de två enkelsidiga .tif-filerna (erhållna i avsnitt 5). DettaÄr det enda bildformatet kompatibelt med ArrayNinja-analysmodulen. Följande anvisningar representerar ett möjligt sätt att få en sammanslagen bildfil. Dock finns andra lösningar tillgängliga ( t.ex. freeware ImageJ).
    1. Från kommandoraden i en basherminal på en dator med freeware ImageMagick installerat, navigerar du till mappen som innehåller enkelsidiga .tif-filer och kopierar / klistrar in följande steg och slår "enter" mellan varje steg (6.1.4 - 6.1 0,7).
      OBS! Filnamn med stora bokstäver ( t.ex. RED_CHANNEL) ska ersättas med filnamnet på bildruta med microarray.
    2. Om nödvändigt, invertera först bilderna med kommandot 'konvertera INPUT.tif -negate OUTPUT.tif'. Detta krävs om skannern sparar .tif-filer med signalen i vit och bakgrund i svart.
      1. Konvertera -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal GB -värdera set 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. omvErt-djup 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal RB -evaluera set 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. Konvertera -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal RG -värdera set 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. Konvertera out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine merged.png.
        OBS! En fil med namnet 'merged.png' sparas i samma mapp som de ursprungliga .tif-filerna.
  2. Kvantifiera data med hjälp av ArrayNinja
    1. Öppna ArrayNinja och klicka på lämplig microarray-skrivarlänk under "Att kvantifiera bilder som har en känd källplatta." Skriv namnet på den sparade bildkonstruktionen (steg 2.5) i dialogrutan "Lastplatta" och klicka på "enter". Se Figur 4 för en skärmdump av analysmodulen ArrayNinja.
    2. Klicka på 'Välj fil' och navigera till och välj filen 'merged.png' som skapats i avsnitt 6.1. Den sammanslagna bildenE laddas liksom ett rutnät för bildspelet.
    3. Använd reglagen längst ner på kontrollpanelen ArrayNinja för att justera kontrasten, ljusstyrkan och mittpunkten.
      OBS! Dessa justeringar är endast avsedda för visualisering och har ingen inverkan på kvantifiering.
    4. Välj "resolution" och ange det värde som matchar upplösningen för den skannade bilden. Använd "marginalsidan" och "marginal toppen" för att flytta rutnätet i linje med fläckarna i matrisen. Justera vid behov för att få nätet så nära varandra som möjligt över varje plats.
    5. Klicka på "Spot Seek" och vänta tills knappen återgår till den ursprungliga gråfärgen.
      OBS: Detta kan upprepas flera gånger för att centrera nätcirklarna på enskilda fläckar. Sökfunktionen kopplar av gallret mot varje plats för att finjustera justeringen.
    6. Ändra värdet "Super Arrays" till "1" för att arbeta upp varje delpanel individuellt (om så önskas). Om du använder en 4X 12 wax imprint slide layout ( Figur 3E ), använd "iPin" "jPin" och "subA" kontrollerna för att stänga av funktioner för att analysera önskad kombination av 4 x 12 brunnar. För att analysera de övre vänstra och övre högra brunnarna som replikat av varandra anger du "1 4" i iPin, "1 1" i jPin och "1 4" i delA. Tryck enter'.
    7. Håll musen över enskilda fläckar för att visa identiteten på den funktionen.
    8. Klicka på "Växla zoom" för att granska funktionerna noga. Välj bakgrundsreferenspunkter genom att trycka på "R" -tangenten medan musen är över en plats. Referenspunkter markeras i orange.
      OBS! I "växla zoom" -läget visas en förstoring av den funktion som musen är över, i övre högra hörnet. En detaljerad diskussion om ytterligare bakgrundskorrigeringsfunktioner i ArrayNinja diskuteras någon annanstans 28 .
    9. Byt ut fläckar (med mycket varierad punktmorfologi eller skräp som skulle påverka korrekt kvantifiering) genom att trycka på A-tangenten medan du svävar musen över de drabbade fläckarna. Inaktiverade fläckar blir vita.
    10. Klicka på "Fyll i" följt av "Skicka" för att kvantifiera fläckarna.
      OBS! En ny flik öppnas och visar ett stapeldiagram över data som normaliserats till det ljusaste spotmedlet. En tabell under stapeldiagrammet innehåller både normaliserade och råa data värden. Denna tabell kan kopieras till ett kalkylblad för arkivering och vidare analys.

Figur 4
Figur 4: Analysmodul ArrayNinja. En skärmbild av analysmodulen ArrayNinja visas. Kontrollpanelen (vänster till vänster) visar alla parametrar som kan justeras för att visualisera arrayen, hitta fläckar och justera ett rutnät överArray bild. Höger musen över en funktion visar en zoomad vy (högst upp till höger) och visar en popup som innehåller identifieringsinformationen som är associerad med den funktionen (nederst). Referenspunkter som valts för bakgrundskorrigering är orange. Funktioner som ska uteslutas från nedströmsanalys är vita. ArrayNinja innehåller en textbaserad sökfunktion som belyser matchande funktioner i gult, som visas i exemplet för H4K16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll har använts för att designa och tillverka en peptidmikroarrayplattform för analys av histon-PTM-antikroppsspecificitet. Arrayet frågar ett bibliotek med mer än 300 unika peptidfunktioner (20-40 rester i längd) som representerar många av de kända kombinationerna av PTM som finns på kärn- och varianthistonproteiner 38 . Denna rörledning har varit en arbetshorse för screening av många allmänt använda och kommersiellt tillgängliga histon-PTM-antikroppar, och fullständiga dataset är tillgängliga på Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). 17

Ryggraden i vår pipeline är ArrayNinja, en öppen källkodsprogram som vi nyligen utvecklat, vilket integrerar planerings- och analysstadiet för microarray-arbete 28 . Analysmodulen ArrayNinja gör det möjligt för användarna att interagera i informaTiva sätt med deras raw array bildfil. De utskrivna egenskapsidentiteterna integreras automatiskt med bilden, och dessa identiteter kan avslöjas genom att sväva muspekaren över en plats. Denna integration möjliggör också snabb sökning efter egenskaper av intresse med namn och uteslutande av funktioner från nedströmsanalys. ArrayNinja ger också alternativ för lokal och icke-lokal bakgrundsstorrättning samt ett korrektionsschema som anpassar sig till spotmorfologi. Fullständiga detaljer om ArrayNinja och dess förmågor finns på andra ställen 28 .

ArrayNinja beräknar signalintensiteter för varje peptidfunktion och aggregerar dessa intensiteter i medelvärden med fel baserat på funktionalitet. Råa och normaliserade signalmedel återges, där normaliseringskonstanten bestäms av det ljusaste funktionsgenomsnittet. Signalintensiteterna för varje peptid kan användas för att jämföra den relativa affiniteten Av antikroppen bland särdrag på mikroarrayen. Här visar vi representativa dataset för två antikroppar profilerade med denna rörledning, och belyser egenskaper för epitopigenkänning som bör beaktas vid tolkning av resultaten erhållna med dessa reagenser ( Figur 5 ).

Off-target -igenkänning är en angelägenhet för alla antikroppar, och gemensamheter i epitoper som omger modifierbara histonrester gör det till en särskild utmaning för histon-PTM-antikroppar. Faktum är att en antikropp som är upptagen för att känna igen trimetylerad lysin 9 på histon H3 (H3K9me3) binder peptider trimetylerade vid H3K18, H3K27 och lysin 20 på histon H4 (H4K20me3) lika bra eller bättre än H3K9me3 ( Figur 5A ). Sekvensen som omger H3K9 (ARKS) konserveras med H3K27 och korsreaktivitet av histon-PTM-antikroppar och kromatinregulatorer som binder och modifierar dessa ställen har noterats annorstädesSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . En annan observerad egenskap av obeståndsgenkänning som är vanligt för metyl-lysinantikroppar är en oförmåga att diskriminera metylbeställning. Detta exemplifieras av resultat erhållna med en H3K4me3-antikropp, som korsreagerar med H3K4me2- och H3K4me1-peptider ( Figur 5B ). Att skilja mellan metylordningen är viktigt, eftersom studier har visat att H3K4me3, H3K4me2 och H3K4me1 fördelas annorlunda över genomet och sannolikt fungerar på olika sätt 42 , 43 . Till exempel är H3K4me3 belägen vid transkriptionsstartplatserna för de mest aktivt transkriberade generna, medan aktiva förstärkare är vanligen markerade med H3K4me1 44 .

Förutom att utanför måligenkänning, positiv och negativ påverkanE av närliggande PTM är en allmänt observerad egenskap hos histonantikroppar. H3K9me3-antikroppen visad i Figur 5A påverkas positivt av acetylgrupper på närliggande lysinrester. I själva verket visar den senaste masspektrometrianalysen att acetylgrupper, i synnerhet H3K14ac, ofta förekommer med H3K9me3 38 . H3K4me3-antikroppen visad i Figur 5B påverkas negativt av närliggande fosforylering vid treonin 6 (H3T6p). H3T6p är känt för att ha både positiv och negativ inverkan på erkännandet av H3K4me3 av läsareproteiner, och detta kan fungera som en dynamisk mekanism för reglering av rekrytering av specifika kromatinfaktorer 15 , 45 .

Figur 5
Figur 5: Analys av antikroppar på peptidmikroarrays. Analys av (A) H3K9me3 (antikropp nr 1) och (B) H3K4me3 (antikropp nr 2) antikroppar på peptidmikrorayser. Gröna linjer / staplar indikerar peptiden som bara inhyser det avsedda mål-PTM. Gråa linjer / staplar indikerar peptider vars signalintensitet inte är signifikant annorlunda (p> 0,05) från den gröna linjen / stapeln, beräknad med en enkelriktad ANOVA som jämför medelrelativ intensitet för alla peptider till målpeptiden. Röda och blåa linjer / staplar indikerar signalen som är signifikant minskad eller ökad (p <0,05) från respektive gröna linje / stapel. Orange linjer / staplar indikerar off-target peptider. Data visas som (vänster) en visuell illustration av PTM-komplexitet på peptider som spänner över N-terminala regioner i H3- och H4-svansarna, där bredden av varje rad motsvarar den relativa intensiteten uppmätt för den peptidfunktionen och (höger) stapeldiagram Visar relativ signalintensitet medeltal ± SEM från 6 enskilda punktmåttPå mikroarrays. Alla peptider som ingår i denna analys är 20 aminosyror i längd som motsvarar antingen histon H3-aminosyrorna 1 - 20 eller 15 - 34. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Antikroppsäkerhet i biomedicinska forskningsapplikationer är viktigast 46 , 47 . Detta gäller speciellt vid kromatinbiokemi med antistoffpositioner som viktiga verktyg för de flesta tekniker som utvecklats för att karakterisera överflöd och fördelning av histon-PTM. Protokollet presenterade här en optimerad pipeline för konstruktion, tillverkning och användning av peptidmikroarrays för att analysera histon PTM-antikroppsspecificitet. Denna rörledning har använts för att skärma ett stort antal kommersiellt tillgängliga och allmänt använda histon-PTM-antikroppar, och data som alstras från dessa experiment är fritt tillgängliga genom en online och expanderande Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) 17 .

Tydligt från vårt och andras arbete är frekventa fall av ogynnsamt histon PTM-antikroppsbeteende som kan komplicera tolkningenJon av data som alstras med dessa reagens 12 , 15 , 17 . Striktare och omfattande kvalitetskontrollåtgärder från antikroppsföretag är därför berättigade. Experimentellister och epigenomkonsortiumledare ( t.ex. ENCODE, BLUEPRINT) måste också visa noggrannhet i sin egen utvärdering av histon-PTM-antikroppar när de väljer ett reagens för sin studie. Dessutom gör insatser för att minimera batch-to-batch-variabilitet, standardisera användningen av starkt validerade affinitetsreagenser över epigenommappningsplattformar och utveckla alternativa affinitetsverktyg är alla handlingsbara saker för att hantera detta forskningsproblem.

Mikroarrays har ett antal fördelar jämfört med mikroplatta-baserade analyser (t ex ELISA) som gör dem särskilt användbara för att karakterisera histon-PTM-antikroppsspecificitet. Microarrays möjliggör parallell och konkurrenskraftig analys av tusentals individuella peptid-Antikroppsinteraktioner med minimal materialförbrukning. I det protokoll som beskrivs här är 700 picomoler av varje peptidegenskap tillräcklig för att producera 100 mikroarray-bilder. Antikroppsanalys kan dessutom kompletteras med användning av mindre än 1 | ig antikropp, och anpassade matrisformat möjliggör att flera antikroppar och olika antikroppspädningar screenas parallellt.

Att utforma anpassade funktionslayouter på mikroarrayer kan vara en mödosam uppgift. Dessutom kräver varje ny microarray-design utbyggnad av en ny analysmall. Vi fann att detta var otillåtet för att realisera det fulla användningsområdet för microarray-tekniken. Detta motiverade vår utveckling av ArrayNinja, ett interaktivt program med öppen källkod, som integrerat design och analys av mikroarray-experiment 28 sömlöst. Designmodulen i ArrayNinja gör det möjligt för användaren att interaktivt designa en bild för att passa den layout som krävs för ett experiment. ArrayNinja respekteradeUally kartlägger robotens rörelse av skrivaren och översätter detta till källplattans layout för en given bilddesign ( figur 2 ). Att skapa anpassade arrayformat är nu en snabb och rutinmässig praxis. Ett annat viktigt inslag i ArrayNinja är sambandet mellan design och analyssteg i microarray-arbetet. Med användardefinierade inställningar från designmodulen överlappar ArrayNinja ett interaktivt rutnät på en scannad microarray-bild, så att användaren kan använda musen över vilken funktion som helst för att avslöja sin identitet eller söka efter egenskaper av intresse ( Figur 4 ).

Flera kritiska steg i denna rörledning är värda att notera. För det första bör man överväga att inkludera tillräckligt många replikpunkter för att uppnå betydelse för datainsamling vid utformningen av utskriftslayouten. För att beräkna variationen mellan stift och stift ska dessutom varje funktion deponeras av åtminstone två olika stiften. Slutligen är kanske det mest kritiska steget den fysiska generatenJon från källplattan. Framgångsrik användning av mikrodyser med hög densitet som beskrivs i detta protokoll bygger på möjligheten att kartlägga identiteten för varje funktion till sin fysiska plats på den slutliga bilden. Denna kartläggningsuppgift är inte trivial, men ArrayNinja underlättar detta steg genom att ge en platskarta. Eventuella avvikelser från denna karta när du skapar källplattorna leder till felaktiga slutsatser under analysen.

Det är viktigt att överväga begränsningarna för att använda mikroarrays för analys av antikroppsspecificitet. Även om off-target-histon-PTM-antikroppsegenskaper som fångats på matrisen har visat sig översätta till experimentella tillvägagångssätt med liknande hybridiseringsbetingelser (t ex immunoblot) 17 , 18 , i vilken utsträckning arraybaserad profilering av antikroppsspecificitet översätts till ChIP-protokoll är suggestiv 14 , 17 men waRrants mer kritisk utvärdering.

Variationer i denna rörledning har tidigare beskrivits för analys av histonläsare, författare och raderare 23 , 24 . Att modifiera denna plattform för användbarhet utöver epigenetikforskning kan lätt anpassas för alla utskrivbara bibliotek av intresse. Det är också möjligt att material som är mer komplex än peptider kan användas för att konstruera mikroarrays för kromatinbiokemiforskning. Exempelvis genereras rekombinanta nukleosomer som uppvisar olika PTM, rutinmässigt i laboratorieinställningen 48 och profilering av histon-PTM-antikroppens specificitet i samband med denna fysiologiskt relevanta kromatinunderenhet kommer att vara ett spännande område för framtida studier.

Ett allmänt använt alternativt tillvägagångssätt för protokollet som beskrivs här använder SPOT-array-teknik, där hundratals peptider syntetiseras direkt på en celluFörlora membran stöd 49 . Membranet i sig kan sedan användas för mikroarrayapplikationer 50 . SPOT-teknik är fördelaktig utifrån bibliotekets komplexitet och synteskostnad. Renheten av peptider syntetiserade med användning av SPOT-metoden har dock rapporterats variera, och kvalitetskontroll och reningsåtgärder som är gemensamma för fastfaspeptidsyntes ( t.ex. HPLC och masspektrometri) utförs inte rutinmässigt 50 , 51 . Dessutom är peptidpresentation på nitrocellulosa inte enhetlig och kan skydda epitoper. Speciellt är båda typerna av histonpeptid-arrayplattformar kommersiellt tillgängliga för användare som inte har tillgång till den specialutrustning som behövs för att syntetisera peptider och fabricera arrays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes delvis av Van Andel Research Institute och ett forskningsbidrag från National Institutes of Health (CA181343) till SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30, (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839, (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311, (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19, (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159, (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19, (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40, (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167, (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6, (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21, (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59, (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4, (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33, (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11, (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18, (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4, (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49, (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27, (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6, (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6, (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7, (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16, (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87, (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24, (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276, (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21, (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17, (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30, (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21, (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6, (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521, (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518, (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11, (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48, (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats