Une méthode d’analyse cellulaire pour le Condyle mandibulaire murin et morphométriques

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Ce manuscrit présente des méthodes d’analyse morphométrique et changements cellulaires dans le condyle mandibulaire des rongeurs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dutra, E. H., O'Brien, M. H., Lima, A., Nanda, R., Yadav, S. A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle. J. Vis. Exp. (131), e55998, doi:10.3791/55998 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

L’articulation temporo-mandibulaire (ATM) a la capacité de s’adapter aux stimuli externes et chargement des changements peut affecter la position des condyles, ainsi que les composants structurels et cellulaires du cartilage condylien mandibulaire (MCC). Ce manuscrit décrit des méthodes pour l’analyse de ces changements et un procédé pour modifier le chargement de l’ATM chez la souris (c.-à-d., compression ATM statique de chargement). L’évaluation structurale illustrée ici est une approche morphométrique simple qui utilise le logiciel Digimizer et est réalisée dans les radiographies de petits os. En outre, l’analyse de systèmes cellulaires change conduisant à des altérations dans l’expression du collagène, remodelage osseux, la division cellulaire, et distribution de protéoglycanes dans le MCC est décrite. La quantification de ces changements dans les coupes histologiques - en comptant les pixels fluorescents positives à l’aide d’image logiciel et la cartographie de la distance de mesure et colorées de zone avec Digimizer - est également démontrée. Les méthodes indiquées ici ne se limitent pas à l’ATM murine, mais pourraient être utilisés sur les autres OS de petits animaux de laboratoire et dans d’autres régions de l’ossification endochondrale.

Introduction

L’ATM est une articulation portante unique située dans la région cranio-faciale et est formé de fibrocartilage. Le CMC de l’ATM est essentiel pour la fonction articulaire, y compris le mouvement de mâchoire sans entrave tout en parlant et pétrissage, mais il est souvent affecté par des maladies dégénératives, notamment l’arthrose1. L’ATM a la capacité de s’adapter aux stimuli externes et des altérations de chargement, conduisant à des changements structurels et cellulaires aux composants du MCC2,3,4,5. Les propriétés porteuse du CMC peuvent s’expliquer par les interactions entre ses composants, y compris l’eau, le réseau de collagène et dense de protéoglycanes. Le MCC a quatre zones cellulaires distinctes qui expriment les différents types de protéines de collagène et non-collagène : 1) la zone superficielle ou articulaire ; 2) la zone proliférative, composée de cellules mésenchymateuses indifférenciées et qui répond au chargement des demandes ; 3) la zone de prehypertrophic, composé des chondrocytes matures exprimant le collagène de type 2 ; et 4) subissent une calcification et de zone, la région où les chondrocytes hypertrophiques exprimant collagène type die 10 le hypertrophique. La région non minéralisée est riche en protéoglycanes qui offrent une résistance aux forces de compression6.

Il y a la minéralisation continue à la zone hypertrophique de la MCC, où se produit la transition entre chondrogenèse ostéogenèse, garantissant la robuste structure minérale de l’os sous-chondral du condyle mandibulaire7. Changements cellulaires dans les régions non-minéralisée et minéralisées aboutir à des changements morphologiques et structurelles dans le condyle mandibulaire et de la mandibule. Maintien de l’homéostasie de toutes les régions cellulaires de la MCC et la minéralisation de la portion sous-chondral sont essentiels à la santé, capacité portante et l’intégrité de l’ATM.

Le modèle de souris transgénique de collagène multiples (comme décrit par Utreja et al.) 8 est un excellent outil à utiliser pour comprendre les changements dans l’expression de collagène car tous les transgènes sont exprimés dans le tableau. Pour une évaluation histologique approfondie, taches histologiques sont utilisés pour étudier les dépôts de matrice, minéralisation, prolifération cellulaire et l’apoptose, ainsi qu’expression de la protéine au niveau des couches cellulaires de la MCC.

Dans ce manuscrit, histologique et analyses morphométriques sont utilisés pour évaluer les changements structurels et cellulaires dans l’OS MCC et sous-chondrale du condyle mandibulaire de souris. En outre, une méthode de quantification de cellules, pour analyser des images histologiques fluorescents et de mappage des lames de microscope photonique, est décrite. L’ATM public static compression chargement méthode, ce qui provoque des modifications cellulaires et morphologiques à la MCC et sous-chondral OS9, est également illustrée pour valider nos méthodes.

Les méthodes décrites ici peuvent servir pour déterminer les caractéristiques morphométriques et histologiques dans le condyle mandibulaire et maxillaire inférieur des rongeurs ou d’analyser d’autres régions d’ossification endochondrale et la morphologie des tissus minéralisés supplémentaires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le Comité de protection des animaux institutionnel de l’Université du Connecticut Health Center a approuvé toutes les procédures d’animaux.

1. compression statique TMJ chargement : Bouche ouverte de force

Remarque : Souris transgéniques de quatre semaines associées fluorescents reporters pour le collagène (Col2a1XCol10a1), aimablement fournies par m. David Rowe (Université du Connecticut), ont été utilisés pour les expériences décrites dans ce manuscrit (n = 8 ; 4 mâles et 4 femelles). Transgène Col2a1 cyan (bleu) est exprimé dans les cellules à la zone prehypertrophic de la MCC, tandis que le Col10a1 cerises globules (rouges) sont présents dans la région hypertrophique8 (Figure 1). Souris ont été répartis en deux groupes : 1) le groupe chargé, où les souris ont été soumises à compression TMJ statique chargement (décrit dans étape 2) et 2), le groupe de contrôle, où souris a reçu aucune intervention.

Figure 1
La figure 1. Représentant sagittale du condyle de souris double-collagène journaliste fluorescent (Col2a1XCol10a1). Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Fabriquer des ressorts usingbeta titane alliage arcs (0,017 x 0,025 po) (Figure 2A).
  2. Anesthésier les animaux de laboratoire par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (90 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (13 mg/kg de poids corporel).
  3. Doucement, ouvrir la bouche des souris et insérez les ressorts, engageant les boucles dans les incisives maxillaires et mandibulaires (Figure 2B et C).
  4. Induire la charge statique de TMJ compression en gardant les ressorts dans les incisives des souris anesthésiés pendant 1 h. Répétez cette procédure pour 5 jours.
  5. Injecter par voie intrapéritonéale les souris avec 5-ethnyl-2'-déoxyuridine (EdU ; 30 mg/kg de poids corporel) pour l’analyse de prolifération cellulaire 2 jours et 1 jour avant l’euthanasie.

Figure 2
La figure 2. Charge de TMJ compression statique : bouche forcée modèle ouvert. (A) ressort fabriqué de 0,017 x 0,025 bêta titane alliage arc. (B) la souris chargée avec ressort. (C) radiographie de chargé et souris témoins montrant des différences dans le positionnement de la mandibule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. fixation et Dissection de la mandibule

  1. Au point de terminaison des procédures bouche ouverte forcé, euthanasier les animaux de laboratoire par une méthode approuvée.
  2. Disséquer les mandibules en coupant l’attachement musculaire sans racler le cartilage du condyle.
  3. Placer les mandibules nettoyés dans 10 % de formol pendant 24 h pour la fixation.
    ATTENTION : Le formol est un irritant ; porter un équipement de protection individuelle approprié.

3. x-ray Imaging et mesures morphométriques

  1. Placez les mandibules dans un récipient plat (par exemple, a 55 mm x 16 mm boîte de Pétri) et de prendre des radiographies des échantillons utilisant un système de rayons x armoire à un 26 kV pendant 5 s.
    NOTE : Placer une échelle graphique avant d’enregistrer les images.
  2. Effectuer des mesures morphométriques des mandibules en utilisant un logiciel d’analyse image (voir la Table des matières).
    Remarque : Avant d’effectuer toute mesure, utilisez la barre d’échelle à la radiographie pour déterminer l’unité. Cette étape est importante pour mesurer correctement les structures anatomiques. Cliquez sur le bouton « Unit » (Figure 3A).
  3. Sélectionnez les points anatomiques en utilisant le « style de marqueur 2 » dans le logiciel d’imagerie (Figure 3B). Pour suivre la méthode décrite dans cet article, sélectionnez les points suivants (Figure 3B) :
    1. Sélectionnez le condylion (point 1), le point le plus postérieur du condyle mandibulaire ;
    2. Sélectionnez le processus incisive (point 2) ;
    3. Sélectionnez le point le plus profond à l’encoche sigmoïde (point 3) ;
    4. Sélectionnez le point le plus profond dans la concavité du ramus mandibulaire (point 4) ;
    5. Sélectionnez le point plus antérieur de la surface articulaire condylien (point 5) ; et
    6. Sélectionnez le point le plus postérieur de la surface articulaire condylien (point 6).
  4. Après avoir sélectionné les points anatomiques, effectuer des mesures morphométriques à l’aide de l’outil de « longueur », mais pour la longueur de la tête condylienne, utilisez l’outil « ligne perpendiculaire » de points (3) et (4) (Figure 3C).
    1. Mesurez la longueur mandibulaire, de la condylion (1) pour le processus de l’incisive (2).
    2. Mesurer la longueur de la tête condylienne - la distance perpendiculaire entre la condylion (1) et une ligne tracée à partir du point le plus profond à l’encoche sigmoïde (3) pour le point le plus profond dans la concavité du ramus mandibulaire (4).
    3. Mesurer la largeur de la tête condylienne - la distance entre le maximum avant le point le plus postérieur de la surface articulaire condylien (5-6).
    4. Copiez les mesures de la « liste de mesure » sur le côté droit de l’écran (Figure 3C).

Figure 3
Figure 3 . Représentation des mesures morphométriques de la mandibule. (A) utiliser la barre d’échelle de la radiographie pour déterminer l’unité (encerclé en rouge, barre d’échelle : 10 mm). (B) sélectionnez les points anatomiques en utilisant le marqueur style « 2 » (entouré en rouge). 1) Condylion ; 2) processus incisive ; 3) point plus profond à l’encoche sigmoïde ; 4) point plus profond dans la concavité du ramus mandibulaire ; 5) la plupart point antérieur de la surface articulaire condylienne ; 6) point plus de postérieur de la surface articulaire condylien. Barre d’échelle : 10 mm.(C) effectuer des mesures avec la « longueur » et « perpendiculaires » outils (entourés en rouge). Mesures du point 1 ou 2 : longueur mandibulaire ; à partir de 5 à 6 point : largeur du condyle ; perpendiculaire du point 1 à 4 - 3 : longueur de la tête condylienne. Enregistrer des mesures de la liste « mesure ». Echelle = 10 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. condyle incorporation

Remarque : Après avoir pris les images radiographiques, les mandibules peuvent être incorporés et sectionnés pour une analyse histologique.

  1. Placer des mandibules enrobement (qui ont été résolues à l’étape 2.3) dans 30 % de saccharose dans du PBS pendant la nuit avant l’intégration.
  2. Disséquer tout excès de tissu mou et découpez soigneusement le condyle mandibulaire.
  3. Verser quelques résine encastrement (assez pour couvrir l’échantillon) dans des moules en plastique jetables et placer la surface médiale du condyle contre la base du moule, positionner l’échantillon parallèle au fond du moule.
  4. Difficulté du spécimen au bon endroit avec un morceau de glace sèche.
  5. Remplissez le moule avec enrobage résine et placez le moule avec échantillon fixe froid 2-méthyl-butane, qui peut être préalablement réfrigérées dans un congélateur à-20 ° C ou à-80 ° C ou à la glace sèche.
  6. Stocker les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C jusqu'à ce que la section.

5. condyle coupes sagittales et préparation

  1. Créez des coupes sagittales congelées des condyles (5-7 µm) et transférer les échantillons à la diapositive à l’aide du ruban transfert méthode10,11.
  2. Respecter les coupes histologiques, transférés à la bande à l’aide de la méthode UV polymérisable10.

6. histologiques de coloration et d’imagerie microscopique

Remarque : La plupart de la coloration histologique est effectué comme décrit dans la section histologique du papier par Dyment et coll.10.

  1. Pour la numérisation de base, la première étape consiste à l’image de Col2a1 et Col10a1 transgènes, tel que décrit par Dyment et al.10 .
    1. Placer les lamelles sur le dessus de la glisse dans 30 % de glycérol et PBS. Effectuer la référence d’imagerie ofthesectionswitha microscope à fluorescence et les filtres appropriés.
  2. Effectuer une coloration fluorescente phosphatase acide tartrate-résistantes (piège).
    NOTE : Piège est exprimée par les cellules hématopoïétiques, y compris l’OS résorption des cellules, les ostéoclastes,12. Le but de cette tache est d’analyser le MCC et le remodelage des os sous-chondral.
    1. Retirer la lamelle couvre-objet des diapositives en les trempant dans du PBS. Laver les diapositives dans du PBS trois fois pendant 5 min chacun.
    2. Préparer le tampon de piège 1 en dissolvant l’acétate de sodium anhydre (9,2 g) et de L-tartrate sodium dibasique dihydrate (11,4 g) dans 1 L d’eau distillée. Ajuster le pH à 4.2 avec l’acide acétique et de stocker le tampon piège 1 à 4 ° C.
    3. Préparer le tampon de piège 2 en dissolvant fraîchement nitrite de sodium (40 mg) dans 1 mL d’eau distillée.
    4. Préparer le tampon de substrat de piège (juste avant la coloration) en mélangeant 7,5 mL de tampon 1 et 150 µL de tampon de 2. Appliquer cette solution (200 µL) à chaque diapositive pendant 10 min à température ambiante.
    5. Préparer le tampon de réaction piège en mélangeant 1,840 mL de tampon de substrat et 23 µL de substrat fluorescent (voir la Table des matières).
      Remarque : Le substrategeneratesayellowfluorescentsignal fluorescent pour activité de piège.
    6. Enlever l’excès piège substrat tampon de pipetage doucement la solution.
    7. Incuber les lames avec 200 µL de tampon de réaction piège pendant 5 min sous une lumière UV source ampoule noire.
    8. Laver les diapositives dans du PBS trois fois pendant 5 min chacun.
    9. Positionnez les lamelles sur les diapositives de 30 % de glycérol dans du PBS et effectuez d’imagerie microscopique10.
  3. Effectuer la coloration de la prolifération de cellules.
    Remarque : Dans cet essai, la thymidine mis à jour l’analogiques 5-éthynyl-2'-déoxyuridine (EdU) est incorporée dans l’ADN nouvellement synthétisé : Division des cellules sont marquées avec un colorant fluorescent.
    1. Après imagerie pour piège, retirer le couvre-objet et laver les diapositives dans du PBS trois fois de 5 min chacun. Suivez les étapes de la trousse de prolifération cellulaire 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour colorer les coupes histologiques.
    2. Préparer une réaction cocktail en ajoutant 430 µL de 1 X tampon de réaction, 20 µL de CuSO4, 1,2 µL de colorant fluorescent et 50 µL de 1 X tampon additif (un volume total de 500 µL est suffisant pour une diapositive).
      Remarque : Le fabricant recommande d’ajouter les ingrédients dans l’ordre décrit ici.
    3. Incuber les lames avec les cocktails préparés pendant 30 min à température ambiante, abrie de la lumière.
    4. Laver les diapositives dans du PBS trois fois pendant 5 min chacun.
    5. Placer les lamelles sur le dessus de la glisse dans 30 % de glycérol dans du PBS avec 1 : 1 000 DAPI.
      NOTE : DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) est un bleuissement nucléaire fluorescente qui se lie aux régions riches en AT dans l’ADN.
  4. Effectuer une coloration bleu de Toluidine (TB).
    NOTE : TB coloration révèle la distribution de protéoglycanes au CMC.
    1. Rincer l’indistilledwater de diapositives pour enlever le couvre-objet.
    2. Après avoir retiré les lamelles, laver les lames dans l’eau distillée trois fois pendant 5 min chacun à supprimer complètement les sels de la PBS.
    3. Préparer le tampon de travail TB en faisant solution un (dissoudre 28,4 g de phosphate de sodium dibasique dans 1 L d’eau distillée) et B (dissoudre 27,6 g de phosphate de sodium monobasique dans 1 L d’eau distillée). Mix 94,7 mL de solution A 5,3 ml de solution B. Diluer cette solution 1:1 dans l’eau distillée pour faire 200 mL de 0,1 M de tampon de travail. Corriger le pH 8.0 par l’ajout d’hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH est fixé.
    4. Préparation 1 % stock TB : dissoudre 1 g de la tuberculose dans 100 mL d’eau distillée.
    5. Préparer la solution de travail TB en mélangeant 40 mL de tampon de travail 0,1 M dans 3 mL de 1 % stock TB.
    6. Incuber les lames dans la solution de travail TB pour les 14-17 s.
      Remarque : Cette tache est temps très sensible ; le temps d’incubation peut devoir être ajustée pour éviter overstaining.
    7. Laver les lames dans l’eau distillée trois fois pendant 5 min chacun.
    8. Placer les lamelles sur le dessus de la glisse en glycérol à 30 % dans l’eau distillée. Effectuer au microscope photonique, imagerie10.
      Remarque : Ne pas lamelle les lames colorées pour la tuberculose en glycérol + PBS. PBS délave ce type de tache.

7. fluorescente histologique Quantification

  1. Effectuer la quantification histologique d’images fluorescentes en utilisant un logiciel d’analyse image (voir la Table des matières).
    Remarque : Le principe de base de quantification histologique dans cette méthode consiste à diviser le nombre de pixels fluorescents d’intérêt par le nombre total de pixels de la zone d’intérêt et de multiplier le nombre obtenu par 100, résultant en un pourcentage de pixels positifs dans cette région.
  2. Effectuer la quantification de l’expression Col10a1 dans le MCC de coupes sagittales des condyles.
    1. Lors de la quantification de tous les types de cellules et les taches à l’aide de cette méthode, sélectionnez la zone à être quantifié. Ouvrez les images histologiques dans le logiciel d’analyse de l’image et sélectionnez la zone en utilisant le « Lasso Tool (L) » (Figure 4A). Pour l’analyse décrite ici, sélectionner la région MCC seulement ; Après avoir sélectionné la zone, le nombre total de pixels s’affichera dans la boîte « Histogramme » sur l’écran du logiciel (Figure 4A). Enregistrez le nombre de pixels dans la zone d’intérêt.
    2. Sélectionnez les pixels de Col10a1 rouge à l’aide de l’outil d’échantillonnage. Cliquez sur « Select » sur le panneau supérieur, puis « Plage de couleurs. » Cliquez sur l’outil « pipette, » sélectionnez l’échantillon de couleur pour le pixel d’intérêt dans l’image, puis cliquez sur « OK ». Toutes les zones positives pour la couleur du pixel choisie sera sélectionnée (Figure 4B). Copier le nombre de pixels fluorescents (indiqué dans la case « Histogramme » de l’écran) et les coller dans un tableur ou un logiciel de statistique pour l’analyse.
    3. Divisez le nombre de pixels fluorescents sur le nombre de pixels de la zone d’intérêt et de multiplier ce nombre par 100 : fluorescentes pixels / pixels dans la zone d’intérêt * 100.
      Remarque : Autre type de cellules, telles que Col2a1 bleu, peut être quantifiée avec cette même méthode, mais les pixels bleus doivent être sélectionnés au lieu des pixels de Col10a1 rouge.

Figure 4
Figure 4 . Représentation du transgène Col10a1 quantification. (A) sélectionner la zone d’intérêt avec l’outil « Lasso » (L). Pour les cellules positives à le Col10a1, sélectionnez le cartilage ensemble mandibulaire. Enregistrer le nombre de pixels dans la zone « histogramme ». (B) sélectionnez le pixel d’intérêt, dans ce cas, les pixels de Col10a1 fluorescents rouges. Notez que seuls les pixels rouges dans la zone d’intérêt seront sélectionnés. Enregistrer le nombre de pixels rouges dans la zone « histogramme ». Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Effectuer la quantification de l’activité de piège dans l’os de la MCC et sous-chondral.
    1. Suivez la procédure décrite à l’étape 8.2, mais au lieu de seulement sélectionner la zone MCC, sélectionner les régions d’os sous-chondral et de cartilage (Figure 5A).
    2. Pour l’analyse de l’activité de piège, sélectionnez les pixels jaunes générés par le substrat ELF97, comme indiqué au point 8.2.2 (Figure 5B) ; copie le nombre de pixels positifs ; et les coller dans un tableur ou un logiciel de statistique pour l’analyse.
    3. Obtenir le pourcentage de séropositifs au piège pixels en divisant le nombre de pixels jaunes par le nombre total de pixels dans la région d’os sous-chondral et en multipliant par 100.

Figure 5
Figure 5 . Représentation sous forme de quantification de piège fluorescente. (A) sélectionner la zone d’intérêt (os sous-chondral et de cartilage mandibulaire) et enregistrer le nombre de pixels de cette région. (B) sélectionnez les pixels fluorescents jaunes, qui représente l’activité piège. Notez qu’uniquement les pixels piège positif sera sélectionner. Enregistrer le nombre de pixels sélectionnés. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Effectuer la quantification des cellules positives EdU.
    1. EdU-lames sont Eosine au DAPI, choisissez donc au lieu de compter le nombre total de pixels dans la zone concernée, les pixels DAPI-positif pour calculer le pourcentage de pixels de l’EdU-positif. Sélectionnez la zone d’intérêt, comme indiqué au point 8.2, mais ne pas enregistrer le nombre total de pixels. Sélectionnez le pixel DAPI bleu comme la couleur échantillonnée, comme indiqué au point 8.2.2 ; copier le nombre de séropositifs au DAPI pixels (Figure 6A) ; et les coller dans un tableur ou un logiciel de statistique pour l’analyse.
    2. Ensuite, sélectionnez les pixels de l’EdU-positive (jaunes fluorescents pixels) et enregistrer le nombre de pixels dans la zone « histogramme » (Figure 6B).
    3. Calculer le pourcentage de pixels de l’EdU en divisant le nombre de pixels EdU-positifs par le nombre de séropositifs au DAPI pixels et en multipliant le nombre obtenu par 100.

Figure 6
Figure 6 . Représentation sous forme de quantification de l’EdU. (A) sélectionner la région proliférative de la MCC (la couche externe du cartilage). Sélectionnez pixels DAPI-positif et enregistrer le nombre de pixels. (B) sélectionnez pixels EdU-positive (jaune fluorescent) et enregistrer le nombre de pixels. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

8. quantification de l’épaisseur du Cartilage et de la Distribution de protéoglycanes

  1. Analyser l’épaisseur du cartilage (cartographie de distance) et la zone de teinté bleu de toluidine en utilisant le logiciel Digimizer Image.
    Remarque : Utiliser la barre d’échelle dans l’image histologique pour déterminer l’unité (Figure 7A).
  2. Effectuer une mesure de la cartographie de distance.
    Remarque : La distance mesurée de cartographie fournira l’épaisseur du cartilage à du condyle mandibulaire. Dans la méthode décrite ici, cinq régions du CMC sont sélectionnées, ce qui donne une moyenne de l’épaisseur totale de la MCC. Le chercheur peut choisir de mesurer trois régions différentes, ou même d’une région unique au milieu du tableau.
    1. À l’aide de l’outil « longueur », mesurer la longueur du cartilage de la surface à la fin de la toluidine teinté bleu zone (Figure 7B) dans cinq régions, ou dans des endroits autant au choix.
    2. Copiez les mesures de longueur de la liste « mesure ».
      Remarque : Le logiciel offre également une moyenne des mesures (Figure 7B).
  3. Mesurer l’aire de teinté bleu de toluidine.
    Remarque : Dans la mesure de la zone de coloration bleu de toluidine, la zone de protéoglycanes dans le MCC sera obtenue.
    1. Sélectionnez l’outil « zone » et contour de la zone de coloration bleu de toluidine (Figure 7C).
    2. Copier les dimensions de la superficie de la liste « mesure ».

Figure 7
Figure 7 : Représentation des protéoglycanes quantification de distribution. (A) utiliser la barre d’échelle de l’image histologique pour déterminer l’unité en cliquant sur le bouton « unit » (entouré en rouge, unité sélectionnée : 500 µm). (B) mesurer l’épaisseur du cartilage dans différents endroits à l’aide de l’outil de « longueur » (entouré en rouge). Enregistrer les mesures de la liste « mesure » dans le panneau supérieur droit. Le logiciel fournit également des « statistiques » dans le panneau droit inférieur, alors que la moyenne et l’écart-type de mesures peuvent être obtenu directement. (C) Mesurez la zone teinté bleu de toluidine en utilisant l’outil « zone » (entouré en rouge). Entourez la zone d’intérêt et enregistrer la mesure de la liste « mesure ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistiques descriptives ont été effectuées pour examiner la distribution des mesures morphométriques (longueur mandibulaire, longueur condylienne, largeur condylienne) et des analyses histologiques. Résultats ont été comparés entre le groupe chargé (c.-à-d., souris soumises à une charge de compression avec le ressort en titane bêta) et le groupe témoin (c.-à-d., correspondant à des souris témoins n’ayant pas reçu de toute procédure). Des différences statistiquement significatives entre les moyennes ont été déterminées par les célibataires t-essai et la p-valeur < 0,05 a été jugée statistiquement significative.

Mesures morphométriques, tel que décrit à l’étape 4 et Figure 3, on a effectué les mandibules de la charge et les groupes témoins. Le groupe chargé présenté avec la longueur de la mandibule une augmentation significative (chargé : 16,62 ± 0,23 mm / contrôle : 16.21 ± 0,2 mm ; p < 0,05) et la longueur de la tête condylienne (chargé : 4,6 mm, SD 0,08 mm / contrôle : 4,4 mm ; SD 0,06 ; p < 0,05) comparativement au groupe témoin. Néanmoins, il n’y avait aucune différence significative entre les groupes largeur de condyle (chargé : 3,06 ± 0,12 mm / contrôle : 2,9 ± 0,11 ; p = 0,09).

Quantification de la distribution de collagène à l’aide de la méthode décrite à l’étape 8 a révélé significativement a augmenté l’expression de Col10a1 dans le tableau des condyles du groupe chargé par rapport à la commande (chargé : 21 ± 4,46 % par opposition à contrôle : 7,50 % ± 2.03 % ; p < 0,005 ; Figure 8 A et D). En revanche, il n’y avait pas statistiquement différence d’expression Col2a1 entre la charge et le groupe témoin (chargé : 4,85 % ± 1,95 % par opposition à contrôle : 2,92 % ± 1,89 % ; p = 0,13 ; Figure 8 B et E). En outre, l’analyse de l’activité de piège a montré accrue des régions séropositifs au piège dans la région sous-chondrale des condyles de souris chargés (chargé : 5,28 % ± 1,45 % versus contrôle : 2,41 ± 1,39 % ; p < 0,05 ; Figure 8 C et F). De même, nous avons observé la prolifération cellulaire accrue, comme l’attestent des cellules positives EdU accrues dans le CMC du groupe chargé par rapport aux souris témoins (chargé : 6,23 % ± 1,89 % par opposition à contrôle : 1.90 % ± 1,03 % ; p < 0,05 ; Figure 9 A et C).

Distribution de protéoglycanes dans le MCC de chargés et les souris témoins a été quantifiée en évaluant la zone teinté bleu de toluidine et le plan de la distance, tel que décrit à l’étape 9 et Figure 7. Nous avons trouvé cartographie distance considérablement accrue dans le CMC des condyles du groupe chargé par le rapport de contrôle (chargé : 210.22 µm ± 4.11 µm / contrôle : 187.36 µm ± 8,64 µm ; p < 0,005 ; Figure 9 B et D). Toutefois, la zone tachée protéoglycane n’était pas statistiquement différente entre le chargement et le groupe témoin (chargé : 203,897.93 µm2 ± 10,171.00 µm2 / contrôle : 202,875.09 µm2 ± 33,419.09 µm2; p = 0,94 ; Figure 9 B et E)

Figure 8
Figure 8 : Résultats représentatifs : (A) des cellules Col10a1 positives dans les coupes sagittales de la MCC des condyles de souris chargés et de contrôle. Il y a une augmentation du nombre des cellules positives Col10a1 dans le groupe chargé (D). (B) les cellules de Col2a1 positives en contrôle et chargé de souris. Il n’y a aucune différence dans des cellules positives Col2a1 entre groupes (E). (C) retiennent la coloration chez les condyles de contrôle et de la souris chargés. Augmentation de l’activité TRAP dans le groupe chargé par rapport à la commande (F). Les histogrammes (D-F) représentent le moyen ± SD pour n = 4 par groupe. ** Différence significative entre les témoins et les groupes chargés (p < 0,005). Echelle = 200µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9:résultats représentatifs : (A) EdU coloration chez condyles de contrôle et de la souris chargés. La prolifération cellulaire accrue dans le groupe chargé, représentée par EdU-positive accrue cellules (C). (B) le bleu de Toluidine coloration chez les condyles souris chargés du contrôle. A augmenté d’épaisseur de cartilage chez les souris chargés, comme en témoigne la cartographie distance accrue dans le groupe expérimental (D). Aucune différence dans la zone tachée protéoglycane entre les témoins et les groupes de chargé (E). Histogrammes (C-E) représentent le moyen ± SD pour n = 4 par groupe. ** Différence significative entre les témoins et les groupes chargés (p < 0,005). Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce manuscrit décrit les méthodes de mesure morphométriques et analyse cellulaire des condyles mandibulaires murins et mandibules. Les mesures radiographiques morphométriques permet également d’analyser d’autres ossements de petits animaux de laboratoire. En outre, l’analyse cellulaire (quantification de la cellule et la cartographie de distance du cartilage) ne se limitent pas à du condyle mandibulaire rongeur, mais peut être utilisé pour quantifier les coupes histologiques de nombreux tissus.

Des modèles de souris transgéniques exprimant des reporters fluorescents sont d’excellents outils à comprendre visuellement les changements dans l’expression des gènes. Le modèle de souris double-collagène journaliste fluorescent (Col2a1XCol10a1) utilisé dans le présent rapport a été particulièrement adapté pour l’étude de la MCC, puisque les transgènes sont exprimés dans la région prehypertrophic et hypertrophique de la MCC ainsi que distribution de collagène pu être évaluée. Si le chercheur n’a pas accès à un modèle de souris transgénique exprimant reporters fluorescents, les autres méthodes d’analyse de l’expression protéique histologiques, tels que l’immunofluorescence, utilisable.

Pour les mesures morphométriques, l’étape essentielle avant de prendre des images de radiographie du cabinet est d’enlever tous les tissus mous de la mandibule ou des os à analyser. Musculaire excessive ou des tissus mous attachés aux os pourraient masquer les mesures réelles des structures. Il est important d’être conscient des limitations du système de radiographie du cabinet. Comme chaque rayon x, c’est une représentation de dimension 2 d’une structure en 3 dimensions et chevauchement des structures et des objets doit être interprétée avec soin. En outre, le positionnement des os dans le cabinet radiographique doit être cohérent.

La quantification cellulaire au moyen de compter le nombre de pixels positifs est une méthode efficace pour la quantification histologique dans une région riche en cellules tels que le MCC, mais la limitation de cette approche est qu’elle ne fournit pas le nombre exact de cellules. En outre, puisqu’il quantifie uniquement les pixels sélectionnés, il est recommandé de chiffrer toutes les images d’intérêt en utilisant le même pixel « échantillonnés » pour éviter la quantification des pixels des intensités différentes lors de l’analyse des images différentes.

Un Conseil lors de la quantification des coupes histologiques générales est d’analyser plusieurs coupes sériées de chaque échantillon (dans ce manuscrit, trois coupes sériées ont été analysés pour chaque condyle), étant donné que les variations au sein de chaque échantillon sont généralement observées.

La méthodologie mentionnée dans nos expériences est simple, facile à utiliser et peut être utilisée dans toute étude de tissus minéralisés dans lequel reporter souris sont utilisés. Avec la méthodologie existante, il est possible de visualiser les cellules qui sont colorées pour piège (Col2a1 ou Col10a1) ou EdU (Col1a1 ou Col2a1) en visualisant la co-localisation des cellules.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier m. David Rowe pour aimablement les souris transgéniques et Li Chen pour l’assistance histologique.

La recherche rapportée dans cette publication a été financée par le National Institute of Dental & Craniofacial Research de la National Institutes of Health, sous attribution numéro K08DE025914 et par l’Association américaine de Foundation orthodontique à Sumit Yadav.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MX20 Radiography System Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer Image software  MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Manual microscope Axio Imager Z1 Carl Zeiss 208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP Chroma Technology Corp 49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP Chroma Technology Corp 49001
red fluoresecent protein filter - Cy5 Chroma Technology Corp 49009
sodium acetate anhydrous Sigma-Aldrich S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 228729
sodium nitrite  Sigma-Aldrich 237213
ELF97 substrate Thermo Fisher Scientific E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit Life Technologies C10339  includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Scientific D1306
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich 71505
Toluidine Blue O  Sigma-Aldrich T3260
Adobe Photoshop  Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Research Products International P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8, (3), 291-305 (1997).
  2. Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17, (3), 354-361 (2009).
  3. Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26, (1), 1-5 (2004).
  4. Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15, (57), (2014).
  5. Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11, (10), 0164599 (2016).
  6. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
  7. Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84, (8), 691-699 (2005).
  8. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  9. Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11, (7), 0160121 (2016).
  10. Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. e54468 (2016).
  11. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).
  12. Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41, (3), 218-223 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics