Une méthode standardisée pour mesurer la surface interne du poumon par la pneumonie et la prothèse

Developmental Biology

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Summary

La zone de surface pulmonaire interne (ISA) est un critère critique pour évaluer la morphologie pulmonaire et la physiologie dans les maladies pulmonaires et la régénération alvéolaire induite par les blessures. Nous décrivons ici une méthode standardisée qui peut minimiser le biais de mesure pour ISA dans les modèles de la pneumonectomie pulmonaire et de la souris implantation de la prothèse.

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Liu, Z., Fu, S., Tang, N. A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation. J. Vis. Exp. (125), e56114, doi:10.3791/56114 (2017).

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Abstract

Introduction

La fonction fondamentale du poumon est l'échange d'oxygène et de dioxyde de carbone entre les vaisseaux sanguins et l'atmosphère. Les maladies pulmonaires telles que la dysplasie bronchopulmonaire (BPD), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et les infections respiratoires aiguës entraînent une diminution de l'ISA 2 . Les chercheurs qui étudient la maladie pulmonaire ont développé plusieurs méthodes quantitatives pour évaluer les changements morphologiques dans les poumons, y compris MLI, ILV, nombre d'unités d'échange de gaz, ISA et compliance tissulaire pulmonaire 2 , 3 . Études pionnières par Weibel et al. 4 et Duguid et al. 5 établissent ensemble que l'ISA peut être utilisé comme mesure directe de la capacité d'échange de gaz pulmonaire dans les poumons humains et peut être utilisé comme critère pour déterminer la gravité de l'emphysème. Un certain nombre d'études publiées au cours des cinq dernières années ont utilisé des paramètres morphologiques pulmonaires ( p. Ex. 6 et pendant la récupération de la lésion PNX 1 , 7 . ISA est calculé en utilisant l' équation 1 8 , 9 :

Équation

, Où ILV est le volume pulmonaire interne et MLI est un paramètre intermédiaire qui représente l'espace périphérique pulmonaire taille 10 .

PNX, l'ablation chirurgicale d'un ou plusieurs lobes de poumon, a été largement rapportés pour induire la régénération alvéolaire chez de nombreuses espèces, y compris les humains, les souris 11 1, 12 les chiens, les rats et les lapins 13, 14, 15. Un goujonY des poumons de souris à quatorze jours après la PNX a montré que l'expansion des alvéoles préexistants et la formation de novo des alvéoles contribuent à la restauration de l'ISA, de l'ILV et du nombre d'alvéoles dans les tissus pulmonaires restants 1 . Nous et d'autres ont montré que l'insertion de matériaux tels que l'éponge, la cire ou une prothèse sur mesure dans la cavité thoracique vide suivant la PNX ( c'est -à- dire l' implantation de la prothèse) entrave la régénération alvéolaire. Il est maintenant établi que la force mécanique fonctionne comme l'un des facteurs les plus importants pour l'initiation de la régénération alvéolaire 1 , 16 , 17 . De telles études ont mis en évidence l'efficacité de l'utilisation des valeurs ISA des poumons traités par la PNX et de la prothèse comme critère pour évaluer quantitativement la régénération alvéolaire.

Le biais d'observateur est connu pour influencer de manière significative les valeurs mesuréesLues pour les paramètres morphologiques pulmonaires ( p . Ex. , MIL et ILV). Des protocoles standardisés peuvent être utilisés pour éviter ce biais en déterminant à la fois ILV et MLI, qui sont les deux paramètres utilisés dans le calcul de l'ISA. Ici, nous fournissons des protocoles hautement détaillés et standardisés pour mesurer ces paramètres pulmonaires. Fait important, la capacité de quantifier avec précision l'ISA promet d'améliorer la fiabilité et la reproductibilité des études de la fonction pulmonaire dans les modèles de régénération alvéolaire induite par les blessures et devrait faciliter les découvertes mécanistes dans de multiples maladies pulmonaires.

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Protocol

Toutes les procédures utilisées dans ce protocole ont été effectuées conformément aux recommandations des Lignes directrices pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national des sciences biologiques de Pékin. Les souris mâles CD-1 de 8 semaines ont été logées dans une installation spécifique de pathogène (SPF) jusqu'à ce que les expériences aient été réalisées. Les chirurgies ont été effectuées en utilisant des souris complètement anesthésiées ( c. -à- d. , Sans réponses de pincement). Après la chirurgie, les souris ont été conservées dans une pièce chaude et humide avec suffisamment de nourriture et d'eau douce. Les souris ont été sacrifiées en utilisant une overdose d'anesthésie délivrée par injection intraperitoneale.

1. La chirurgie de la souris PNX

  1. Anesthésier complètement les souris avec du phénobarbital de sodium (120 mg / kg de poids corporel) et de la buprénorphine (0,1 mg / kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale (IP). Effectuer une intervention chirurgicale lorsque les souris ne réagissent plus au pincement des orteils.
  2. Retirer les cheveux sur le thorax gauche des souris avec dépôts chimiquesTraitement oral (~ 3 x 3 cm 2 ).
  3. Fixez chaque souris sur une plate-forme d'intubation avec son côté ventral face à l'opérateur ( Figure 1A ).
  4. Retirez la langue de la souris et illuminez les cordes vocales avec un petit laryngoscope contenant un entaille pour guider les cathéters 18 ( Figure 1A ).
  5. Distinguez les cordes vocales en observant les mouvements des cordes vocales pendant la respiration. Insérer doucement une canule d'intubation intraveineuse 20 G dans la trachée à un angle antérieur 19 .
  6. Placez les souris dans une position latérale droite et raccordez la canule à un ventilateur mécanique ( p. Ex., Contrôlé sous pression, voir la Table des matériaux ). Vérifiez l'insertion de la canule dans la trachée en observant les mouvements de respiration du coffre de la souris ( figure 1B ).
  7. Réglez la pression inspiratoire oF le ventilateur à 12 cm H 2 O et régler le taux respiratoire à 120 respirations par minute ( figure 1B ).
  8. Décontaminer la peau dans la zone chirurgicale avec de la betadine et 70% d'éthanol.
  9. Faire une incision thoracique post-latérale de 2 à 3 cm dans l'espace au 5 e espace intercostal, couper la peau et les muscles avec les ciseaux Noyes Spring (tranchant: 14 mm, diamètre de la pointe: 0,275 mm) ( figure 2B , C ). Les instruments chirurgicaux utilisés pour la procédure de thoracotomie sont stérilisés avant utilisation.
  10. Faire une incision de 1,5 cm au 5 ème espace intercostal pour exposer le poumon gauche ( Figure 2D , E ). Pendant l'opération, utilisez un cautériseur haute température pour arrêter le saignement.
  11. Soulevez un tiers du lobe pulmonaire gauche de la poitrine avec des pinces à pointe émoussée ( Figure 2F ), puis utilisez un coton-tige pour retirer toute la gauchePoumon ( figure 2G ).
  12. Identifiez l'artère pulmonaire et les bronches du lobe pulmonaire gauche ( Figure 2G ).
  13. Relier légèrement les bronches et les vaisseaux au hilum avec une suture chirurgicale en soie et découper le lobe du poumon gauche à 3 - 4 mm de la ligature ( Figure 2H , I ).
    REMARQUE: Veillez à ne pas couper les noyaux de suture sur le hile gauche, ce qui peut provoquer un pneumothorax ( c. -à- d. , De l'air ou du gaz dans la cavité du thorax) .
  14. Fermez le mur de la poitrine avec 1 suture, puis coupez la couche musculaire et la couche de peau séquentiellement, en utilisant 5 à 6 sutures interrompues. Laisser un intervalle de 3 à 4 mm entre chaque suture ( Figure 2M , 2N ).
    REMARQUE: retirez l'aiguille de suture chirurgicale du cœur; La perforation cardiaque par inadvertance entraînera une mort immédiate.
  15. Désinfectez la zone chirurgicale avec de la povidone-iode.
  16. AfteEn cas d'opération chirurgicale, placez la souris sur un tampon thermique de 38 ° C et connectez la souris au ventilateur jusqu'à ce que les mouvements de respiration spontanés commencent ( Figure 2O ).

2. Implantation de prothèse

  1. Effectuez les étapes 1.1 à 1.13 de la procédure PNX (c'est-à-dire jusqu'à ce que le lobe pulmonaire gauche de la souris soit supprimé).
  2. Serrer le centre de la prothèse de silicone (fabriqué par le client, 12 mm de longueur, 3 mm d'épaisseur, 7 mm de largeur, 0,2 g, forme ellipsoïde) à l'aide de pinces émoussées ( figure 2J ). Stériliser la prothèse de silicone avant l'insertion.
  3. Tenez la côte avec des pinces d'une main pour exposer la cavité thoracique, puis insérez la prothèse dans la cavité thoracique vide gauche avec une autre main.
    NOTE: L'angle d'insertion est d'environ 45 degrés entre le plan frontal de la prothèse et la surface thoracique ( Figure 2K ,L). Soyez très doux lors de l'insertion de la prothèse. Une force excessive entraînera une rupture pleurale.
  4. Ajustez l'orientation de la prothèse avec une pince serrée pour s'assurer que la prothèse occupe la cavité thoracique vide gauche.
  5. Effectuez les étapes 1.14 - 1.16 de la procédure PNX de la souris.

3. Mesure de l'ILV

  1. Préparez un périphérique personnalisé ("tube de gonflage") qui consiste en un émetteur retiré d'une pipette sérologique jetable (10 mL), d'un tube flexible de 40 cm de long avec un adaptateur à aiguille, une vanne de régulation de débit et une aiguille de 18 G. Après l'assemblage, fixez la pipette sur une carte avec du ruban adhésif ( Figure 3A ). La distance entre le haut de la pipette et le banc expérimental doit être d'au moins 30 cm.
  2. Préparer une solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde fraîche (PFA) en dissolvant 20 g de PFA dans 500 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée dans un bain d'eau à 55 ° C, en agitant manuellementTous les 10 min jusqu'à ce que la solution soit claire. Après refroidissement à température ambiante, filtrer la solution avec un filtre de 0,45 μm.
    ATTENTION: Portez un équipement de protection individuelle approprié (PPE) lors de la manipulation de PFA.
  3. Sacrifiez des souris avec une injection de surdoses d'anesthésie (0,8% de phénobarbital de sodium, 1000 U / ml d'héparine).
  4. Fixez chaque souris sur une plaque de dissection de polystyrène et vaporisez-la avec 70% d'alcool.
  5. Ouvrez soigneusement le coffre de la souris et découpez le sternum à l'aide de ciseaux pour exposer complètement les lobes pulmonaires.
  6. Retirer les tissus excessifs à l'aide de ciseaux pour exposer la trachée. Assurez-vous de séparer la trachée de l'œsophage.
  7. Couper l'aorte abdominale et insérer une aiguille de calibre 25 dans le ventricule droit du cœur; Connectez l'aiguille à une seringue de 20 mL avant cette insertion. Poussez lentement 1x PBS dans le cœur pour enlever les globules sanguins jusqu'à ce que les poumons deviennent blancs. Typiquement, 5 à 10 mL de PBS sont nécessaires pour éliminer les vaisseaux sanguins pulmonaires.
  8. Remplir leE tube de gonflage sur mesure avec 4% de PFA frais et éliminez toutes les bulles du tube de gonflage.
  9. Insérez l'aiguille de calibre 18 du tube de gonflage dans la trachée et pressez la trachée avec des clips de vaisseaux pour éviter les fuites de fluide.
  10. Gonfler les poumons avec 4% de PFA à une pression transpulmonaire constante de 25 cm / H 2 O 2 , 20 . Incuber les poumons à température ambiante pendant 2 h pour obtenir des poumons complètement expansés. Cette étape "pré-réparatrice" est essentielle pour préserver la morphologie pulmonaire.
    1. En surveillant le tube de gonflage, notez la valeur du volume initial de 4% de PFA et enregistrez le volume final. Le volume interne du poumon est égal au volume initial de 4% de PFA moins le volume final de 4% de PFA.
  11. Relier la trachée et utiliser des ciseaux, disséquer doucement les poumons (garder les poumons intacts) à partir des tissus conjonctifs environnants. Soyez très doux pour éviter d'endommager les poumons.
  12. IncuBattre les poumons dans un tube conique de 50 ml rempli de PFA à 4% pendant 12 h à 4 ° C avec un tremblement doux sur un agitateur (50 tr / min). Procédez au traitement et à la coloration des tissus (voir la section 4).

4. Implantation tissulaire, coupe et coloration de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E)

  1. Après la fixation, utilisez Noyes Spring Scissors pour couper le cœur et les tissus conjonctifs excessifs hors des poumons. Séparer doucement les lobes pulmonaires individuels en coupant la bronche qui relie les lobes pulmonaires à la trachée.
  2. Laver extensivement les lobes pulmonaires 3 à 4 fois dans 50 mL 1x PBS (30 min / laver) sur un agitateur orbital (50 tr / min).
  3. Après le lavage final, cryoprotection des lobes pulmonaires en les immergeant dans une solution de saccharose à 30% (en 1x PBS) à 4 ° C jusqu'à ce que le tissu s'enfonce au fond des tubes coniques de 50 ml (environ 12 h).
  4. Avant d'intégrer et de cryosectionner les tissus, retirer les échantillons de lobes pulmonaires des tubes avec des pinces, conserver l'accessoireLes sels de sory pour l'analyse histologique, dab la solution de saccharose restante à partir de la surface des échantillons de lobes accessoires, puis plonger complètement l'échantillon dans une boîte de Petri contenant un composé de température de coupe optimal (OCT) pendant environ 30 minutes.
  5. Geler les échantillons de lobes accessoires installés OCT dans de l'azote liquide à l'aide de cryomolds. Placez la plus grande surface du lobe parallèlement au fond du moule.
  6. Préparez un total de trois sections de 10 μm d'épaisseur pour chaque échantillon lors de la criosection pour une analyse histologique. Jeter les premiers 1 mm de tissu, collecter une section de 10 μm d'épaisseur, jeter 0,5 mm de tissu, collecter une autre section, jeter 0,5 mm de tissu et collecter la troisième (dernière) section.
  7. Séchez à l'air les sections pendant 1 h avant d'effectuer une coloration H & E.
  8. Effectuer la coloration H & E
    1. Lavez les sections en 3 à 4 changements d'eau du robinet, puis tachez les sections dans de l'hématoxyline minérale pendant 2 min.; Rincez la section sous l'eau courante du robinet; Immergez la section deux fois dans une solution à 1% de HCl à 70% d'éthanol pour éliminer l'excès d'hexatoxyline.
    2. Couper la section en éosine fraîche pendant 3 min; Déshydrater les sections avec deux lavages successifs de 30 s dans de l'éthanol à 95% et deux 30 s de lavage à 100% d'éthanol; Nettoyer les sections en xylène pendant 30 s, répéter l'étape de déblaiement une fois dans du xylene frais; Montez les diapositives avec un support en utilisant des lamelles en verre.

5. Quantification de MLI

  1. Acquérir des images numériques des sections de lobes accessoires H & E (grossissement 20X) à l'aide d'un microscope à champ brillant.
  2. Pour quantifier le MLI, sélectionnez un total de 15 vues non chevauchantes (1000 μm x 1000 μm) de manière aléatoire dans les zones appropriées (sans artères et veines, voies respiratoires majeures et conduits alvéolaires) de 3 sections.
  3. Placez une grille avec 10 lignes verticales uniformément réparties et 10 lignes horizontales également réparties de lentille définieGth (1000 μm) sur les zones de vue choisies à l'aide d'un outil de règle; Chaque ligne est ainsi espacée de 100 μm ( figure 4B ).
  4. Définissez la valeur d'une interception en tant que longueur linéaire entre deux épithélium alvéolaire adjacent. Mesurez les valeurs de tous les interceptions le long de chaque ligne de longueur de 1000 μm.
  5. Pour chaque grille, quantifier les valeurs de tous les interceptions parmi les 10 lignes horizontales de 1000 μm et les 10 lignes verticales de 1000 μm.
    NOTE: MLI est la valeur moyenne des longueurs d'intersection d'un total de 15 grilles analysées parmi les 3 sections préparées pour chacun des lobes accessoires.

6. Calcul de l'ISA

  1. Calculez l'ISA en utilisant l' équation 1 (voir Introduction ). Reportez-vous à la section 3 pour la mesure de l'ILV et se référer à la section 5 pour la quantification de MLI.

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Representative Results

Nous avons effectué ici une expérience avec un groupe traité par PNX et un groupe d'implantation de prothèse (implanté en prothèse). Ces groupements sont identiques aux groupements utilisés dans une étude publiée précédemment de notre groupe de recherche 14 .

Le PNX de la souris et les procédures d'implantation de la prothèse sont présentés à la figure 2 . Des souris mâles CD-1 de 8 semaines sont utilisées pour les chirurgies et pour la quantification. Dans le groupe traité par PNX et le groupe implanté par la prothèse, les lobes des poumons gauche ont été réséqués ( Figure 2A - 2I ). Dans le groupe implanté à la prothèse, une prothèse qui imite la taille et la forme du lobe pulmonaire gauche a été insérée dans la poitrine après la suppression du lobe pulmonaire gauche ( Figure 2J - 2L ).

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Quatorze jours après la chirurgie, un tube de gonflage sur mesure a été utilisé pour déterminer l'ILV des poumons droit restants ( Figure 3A ). L'ILV moyen du droit restant Les poumons des 5 souris traitées par PNX étaient d'environ 1,4 mL, significativement plus élevés que les valeurs d'ILV de 1,05 mL des poumons droits des 5 souris implantées dans la prothèse ( figure 3B , tableau 1 ).

Pour la mesure MLI, un total de 15 vues ont été analysées parmi les 3 sections préparées à partir de chaque souris. La figure 4A montre une image fusionnée à partir d'une section de lobe accessoire et la norme morphologique pour une zone choisie ( p. Ex. Vue 1 à 3) ou une zone non choisie ( p. Ex., Vue 4 à 5) utilisée pour la quantification de MLI. Ici, la vue 3 d'une section accessoire du lobe pulmonaire du groupe traité par PNX a été prise comme exemple pourLa mesure de MLI ( figure 4B ). Une image agrandie de la vue 3 est également affichée pour illustration ( Figure 5A ). La ligne 3 est présentée comme un exemple: la longueur d'un espace aérien alvéolaire intercepté indiqué par les lignes à flèche à double tête. Notre analyse a montré que les valeurs MLI dans les poumons droits restants des souris traitées par PNX étaient significativement supérieures à celles des poumons droits restants des souris implantées-implantées ( figure 5B , tableau 1 ). Toutes les données sont présentées comme moyenne ± SEM ( Figure 5B ).

L'ISA a été calculé en utilisant l' équation 1 . Le tableau 1 montre les valeurs de l'ILV, les valeurs MLI et l'ISA de tous les poumons. L'ISA des souris implanté à la prothèse était significativement plus petit que celui des souris traitées par PNX, démontrant que l'insertionN d'une prothèse altérée par la régénération induite par PNX.

Figure 1
Figure 1: Intubation endotrachéale de la souris et ventilation mécanique. ( A ) Intubation endotrachéale avec une canule d'intubation intraveineuse 20 G via une laryngoscopie. ( B ) Connectez la souris complètement anesthésiée à un ventilateur mécanique à pression contrôlée avant la chirurgie. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Pneumonectomie de la souris (PNX) et implantation de la prothèse. ( A - C ) Couper la peau et la couche musculaire; Arrête bHémorragie avec un cautériseur à haute température pendant l'opération chirurgicale. ( D - E ) Faire une incision de 1,5 cm au 5 ème espace intercostal. ( F - H ) Tirez le lobe pulmonaire gauche avec une pince molle et identifiez l 'artère pulmonaire et les bronches, ligatez le hilum. Les têtes de flèche représentent l'artère pulmonaire et les bronches du lobe pulmonaire gauche. ( I ) Le lobe pulmonaire gauche a été réséqué à 3 - 4 mm de la ligature. ( J - L ) Insérer une prothèse dans la cavité thoracique gauche. ( M, N ) Suture la poitrine, la couche musculaire et la couche de peau. ( O ) Surveiller les souris jusqu'à ce que les mouvements de respiration spontanés commencent. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


Figure 3: Mesure des volumes pulmonaires internes (ILV) des poumons restants. ( A ) Un dispositif personnalisé ("tube de gonflage") pour mesurer les volumes pulmonaires internes. ( B ) Les ILV (moyenne ± SEM) des poumons droit restants du groupe traité par PNX et du groupe implanté à la prothèse ont été mesurés à 14 jours après la PNX. **, p <0,01, test t de Student. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Quantification de l'interception linéaire moyenne (MLI) des logues d'accessoires dans les poumons restants. ( A ) Un fusionné imL'âge d'une section de lobe accessoire est affiché. Exemples de zones choisies ( p. Ex., Vue 1 à 3) et zones non choisies ( p. Ex., Vue 4 à 5) utilisées pour la quantification MLI. ( B ) 10 lignes verticales uniformément espacées et 10 lignes horizontales espacées de manière uniforme (1000 μm) ont été placées sur la zone choisie. Barre d'échelle = 1 mm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Quantification du MLI dans les poumons traités par PNX et les poumons implantés par la prothèse. ( A ) Une image agrandie de la vue 3 de la figure 4B est affichée. Les lignes de couleur rouge avec deux pointes de flèche représentent la longueur d'une interception linéaire. ( B ) Les valeurs MLI (moyenne ± SEM.) des lobes accessoires de souris traitées par PNX et des souris implantées par prothèse ont été mesurées à 14 jours après la PNX. *, P <0,05, t- test de Student. Barre d'échelle: 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

14 jours après la chirurgie Volume interne du poumon (ml) Interception linéaire moyenne (mm) Surface interne pulmonaire = 4ILV / MLI (cm 2 )
Traité par PNX 1.5 57,8 1038.06
1,35 49,6 1088,71
1.42 48,5 1171.13
1.4 51,5 1087,38
1.4 54.6 1025,64
Prothèses implantées 1.1 49,6 887,10
1 50,5 792,08
1.1 47.3 930.23
1,15 44,8 1026,79
0,86 46.3 742,98

Tableau 1: Calcul des valeurs ISA des souris traitées par PNX et implantées par la prothèse. Les valeurs de ILV, MLI et ISA des lobes accessoires à 14 jours post-PNX.

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Discussion

Dans ce protocole, nous fournissons des descriptions détaillées sur la mesure des paramètres pulmonaires après le PNX du poumon gauche et l'implantation de la prothèse. L'ISA est maintenant considérée comme une mesure clé pour l'évaluation de la fonction respiratoire dans de nombreuses maladies pulmonaires et dans la régénération alvéolaire induite par une blessure. Cependant, bien que la communauté de recherche pulmonaire soit d'accord sur l'utilité de l'ISA comme mesure utile, à ce jour, on a peu pris en compte la normalisation de la mesure de l'ILV et de MLI, les deux paramètres utilisés pour calculer l'ISA. Évidemment, comme pour toute mesure, il est important d'essayer d'obtenir des données impartiales. L'objectif principal de l'effort de recherche actuel est d'établir un protocole normalisé à utiliser par la communauté de recherche pulmonaire murine.

Nous avons tenté de réduire les sources de biais de mesure de plusieurs façons lorsque nous avons développé ce protocole. Nous avons constaté que la variation des mesures de l'ILV pourrait être rougeEn empêchant les fuites de fluide en assurant que la taille de l'aiguille insérée dans la trachée est adaptée de façon dimensionnelle (nous avons constaté que les aiguilles à 18 calibres étaient très proches des trachées de souris). Nous avons également constaté que la paroi thoracique de la souris doit être complètement enlevée avant l'inflation PFA, car cela minimise l'influence potentielle de la paroi thoracique sur les mesures ILV. Les valeurs MLI dépendent dans une large mesure de la morphologie alvéolaire. Par conséquent, en plus de l'importance d'utiliser des souris adaptées à l'âge et adaptées au sexe, le maintien correct de la morphologie alvéolaire lors des procédures de fixation pulmonaire est d'une importance cruciale. Nous utilisons ici une méthode de fixation largement adoptée: nous avons gonflé des poumons à une pression transpulmonaire de 25 cm H 2 O avec du PFA 4% fraîchement préparé pour dilater complètement le tissu pulmonaire. Selon notre expérience, les pressions de distension inférieures peuvent entraîner une contraction des tissus, une morphologie alvéolaire anormale et, par conséquent, aboutir à des valeurs inférieures de MLI.

Observations dansNos études précédentes ont indiqué que le lobe accessoire du poumon restant présente une expansion volumétrique maximale, par rapport aux trois autres lobes du poumon droit, après la régénération PNX; Le lobe accessoire du poumon restant présente également des augmentations maximales de la valeur des paramètres morphologiques ( p. Ex. MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Nous n'avons donc analysé que les sections des lobes accessoires pour éviter les variations de différents lobes pulmonaires. Pour aider à réduire les variations entre les différentes sections utilisées dans la quantification de MLI, nous avons contrôlé l'orientation du lobe lors de l'encastrement: nous avons placé la plus grande surface du lobe parallèlement au fond du cryomold. Nous avons également contrôlé avec soin l'épaisseur des tranches d'échantillon, la séquence d'échantillonnage de la section et la position de coupe lors de la coupe. En plus du traitement des échantillons, un autre importateurL'aspect de la normalisation est que toutes les artères et les veines, la plèvre, les voies respiratoires principales et les conduits alvéolaires doivent être exclus des zones tissulaires évaluées lors de la quantification MLI. Les artères, les veines et les conduits alvéolaires sont tous beaucoup plus grands que les alvéoles (de 4 à 10 fois), de sorte que l'exclusion de ces grandes structures est importante pour obtenir des mesures d'interception fiables. Pour chaque groupe, 5 souris sont adéquates pour la quantification. Pour chaque souris, un total de 15 vues non chevauchantes (1000 μm x 1000 μm) ont été sélectionnées de manière aléatoire dans les zones appropriées (sans artères et veines, voies respiratoires majeures et conduits alvéolaires) des 3 sections du lobe accessoire. La méthode d'incorporation de l'échantillon et la mesure MLI peuvent également être appliquées aux tissus pulmonaires traités à la paraffine.

Alors que d'autres ont défini MLI comme la longueur de ligne totale divisée par le nombre d'interceptions avec des parois alvéolaires croisées 25 , nous avons utilisé une interception linéaire comme longueur linéaireEntre deux parois épithéliales alvéolaires adjacentes dans les calculs MLI, en négligeant l'épaisseur du mésenchyme à partir des données MLI. En conséquence, nous avons calculé ISA en utilisant l'ILV mais pas le volume pulmonaire total.

Pour les procédures d'implantation PNX et prothèse, le taux de survie des souris soumises à PNX variait de 85% à 90%. Le taux de survie des souris subissant une implantation de prothèse était d'environ ~ 80%. Pendant toutes les interventions chirurgicales, plusieurs mesures devraient être prises pour améliorer la survie des souris. 1) L'insertion correcte du cathéter dans la trachée est une condition préalable à une opération PNX réussie. À la guise d'un laryngoscope, on peut facilement observer la trachée de la souris pour faciliter l'intubation endotrachéale sûre et efficace. 2) Ne pas percer les poumons ou les coeurs pendant la procédure. Assurez-vous que le thorax du cinquième espace intercostal gauche est largement ouvert et que l'hilum du lobe gauche est clairement identifié avant la lobectomie. En effectuant le lobe pulmonaire gauche re, Assurez-vous que le lobe gauche est intact par l'utilisation de pinces émoussées pour éviter une hémorragie pulmonaire et / ou une rupture de lobar. Pendant la fermeture de la plaie, retirez la pointe de l'aiguille chirurgicale du cœur et des poumons. 3) Soyez doux lors de l'insertion de la prothèse dans la cavité du thorax vide, car une force excessive peut provoquer une rupture de la plèvre. 4) Les souris devraient être placées sur un tampon thermique de 38 ° C et surveillées jusqu'à ce que leurs sens se rétablissent, car l'hypothermie postopératoire est connue pour augmenter la morbidité de la souris.

Après l'élimination du lobe du poumon gauche, les unités respiratoires pulmonaires et la zone interne d'échange de gaz pulmonaire ont été considérablement réduites. 14 jours après la chirurgie, l'ILV, le MLI et l'ISA dans le tissu pulmonaire restant étaient significativement plus importants dans le groupe de souris traité par PNX que dans le groupe implanté par la prothèse, ce qui suggère fortement que l'insertion d'une prothèse a bloqué l'alvéole induite par PNX régénération. Ainsi, les deux PNX et le mode de la prothèse-mode d'implantationIl peut être utilisé comme des outils puissants pour l'étude des événements cellulaires et moléculaires qui se produisent lors de la ré-alvéolarisation induite par force mécanique. En outre, les valeurs ISA des poumons nuls d' Yap AT2 étaient significativement plus petites que celles des poumons témoins au jour 14 1 après le PNX, ce qui indique que notre protocole est également approprié pour détecter une régénération altérée de souris mutantes génétiques. Les méthodes quantitatives rigoureuses et standardisées présentées dans cette étude peuvent être appliquées pour mesurer les paramètres pulmonaires et ISA dans les études de développement et avec des modèles animaux génétiquement modifiés de maladies multiples, y compris l'emphysème dans les maladies pulmonaires obstructives chroniques, la régénération alvéolaire suite aux lésions pulmonaires et le développement pulmonaire Défauts.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier l'Institut national des sciences biologiques de Beijing pour l'assistance. Ce travail a été soutenu par la Fondation municipale des sciences naturelles de Beijing (n ° Z17110200040000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low cost cautery kit Fine Science Tools 18010-00
Noyes scissors Fine Science Tools 15012-12
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Vessel clips Fine Science Tools 18374-44
I. V. Cannula-20 gauge Jinhuan Medical Product Co., LTD. 29P0601
Surgical suture Jinhuan Medical Product Co., LTD. F602
Mouse intubation platform Penn-Century, Inc Model MIP
Small Animal Laryngoscope Penn-Century, Inc Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator Kent Scientific RSP1006-05L
Thermal pad Stuart equipment SBH130D
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761
Heparin sodium salt Sigma H3393
Hematoxylin Solution Sigma GHS132
Eosin Y solution, alcoholic Sigma HT110116
10 mL Pipette Thermo Scientific 170356
Paraformaldehyde Sigma P6148
O.C.T Compound Tissue-Tek 4583
cryosection machine Leica CM1950
Disposable Base Molds Fisher HealthCare 22-363-553
18 gauge needle Becton Dickinson 305199
Povidone iodine Fisher Scientific 19-027132
70% ethanol Fisher Scientific BP82011
Infusion sets for single use Weigao SFDA 2012 3661704
Phosphate buffered saline Gibco 10010023
Tapes 3M Scotch 8915
Cotton pad Vinda Dr.P
Silicone prosthesis Custom made
Brightfield microscope Olympus VS120
Ruler tool Adobe Photoshop

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References

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