Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l'homme à l'aide de Laminin 521 Matrix

Developmental Biology

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Summary

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

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Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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Abstract

Les conditions exemptes de Xeno et totalement définies sont des paramètres clés pour la génération robuste et reproductible de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPS) homogènes. La maintenance des cellules HiPS sur les cellules nourricières ou les matrices non définies sont sensibles aux variances discontinues, à la contamination pathogène et au risque d'immunogénicité. L'utilisation de la matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) définie en combinaison avec des formulations de média xénoïdes et définies réduit la variabilité et permet la génération cohérente de cellules HiPS. Le vecteur de virus Sendai (SeV) est un système à base d'ARN non intégrant, contournant ainsi les préoccupations liées à l'effet perturbateur potentiel sur les vecteurs intégrant l'intégrité du génome. En outre, ces vecteurs ont démontré une efficacité relativement élevée dans la reprogrammation des fibroblastes dermiques. En outre, le passage enzymatique à une seule cellule des cellules facilite l'entretien homogène des cellules HiPS sans une expérience préalable substantielle de la tigeLl culture. Ici, nous décrivons un protocole qui a été largement testé et développé en mettant l'accent sur la reproductibilité et la facilité d'utilisation, fournissant un moyen robuste et pratique de générer des cellules hiPS humaines définies et exemptes de xénon à partir de fibroblastes.

Introduction

Depuis la première dérivation des lignées cellulaires hiPS par Takahashi et al. 1 , 2 , les cellules HiPS ont fourni un outil utile pour la modélisation de la maladie, la découverte de médicaments et comme matériau de base pour la génération de thérapies cellulaires dans la médecine régénératrice 3 . La culture cellulaire hiPS a longtemps dépendu de la co-culture avec des cellules nourrissantes de fibroblastes 4 , 5 ou sur Matrigel 6 et avec des formulations de média contenant du sérum bovin fœtal (FBS). Les variances de lot à lot sont une conséquence courante de la nature indéfinie de ces conditions de culture, ce qui entraîne des variations imprévisibles, ce qui contribue grandement à la non fiabilité de ces protocoles 7 . Le développement de moyens définis tels que Essential 8 (E8) 8 et des matrices de culture cellulaire définies, par exemple LN-521 9 , permettentS pour l'établissement de protocoles hautement reproductibles et aide à la génération et à la maintenance robustes des cellules HiPS homogènes 7 , 8 , 9 , 10 .

Le développement de techniques de reprogrammation sans intégration a été un bond en avant. À l'origine, la reprogrammation dépendait de vecteurs rétroviraux qui s'établissaient de manière aléatoire dans le génome avec des effets perturbateurs sur l'intégrité génomique 11 . Les progrès dans les méthodologies de reprogrammation comprennent le développement de vecteurs à base d'ARN. Les vecteurs d'ARN ont un avantage par rapport à la méthode de reprogrammation basée sur l'ADN car une intégration involontaire par recombinaison génomique n'est pas possible 12 . Les vecteurs SeV fournissent une expression élevée et transitoire de facteurs exogènes par l'ARN monocaténaire sans phase d'ADN 11 . Les vecteurs de reprogrammation livrés par le SeVSont dilués tout au long de l'expansion de la cellule et finissent par se débarrasser de la culture en fournissant un mode de reprogrammation sans impression imprimée. Par la suite, le maintien de la pluripotence dépend de l'expression endogène des gènes de pluripotence 2 .

Au fur et à mesure que les thérapies basées sur les cellules hiPS avancées commencent à se lancer dans des essais cliniques, les demandes de lots, de reproductibilité et de sécurité standardisés sont des problèmes essentiels à résoudre 13 . Par conséquent, les produits d'origine animale devraient être évités. Par exemple, l'utilisation de produits xénogénétiques a été associée au risque de contamination par des agents pathogènes non humains. En outre, les cellules cultivées en présence de composants de culture dérivés d'animaux ont montré qu'ils incorporent des acides siliques non humains dans des membranes cellulaires qui menacent de rendre les cellules dérivées immunogènes 14 . Par conséquent, la nécessité d'éliminer les produits xénogénétiques est nécessaire à toute poursuite clinique future. Ce protocole s'applique xeUne culture non libre et définie dans la maintenance des cellules HiPS se déplace des cellules plus près de la conformité clinique.

Ce protocole décrit une méthode cohérente, hautement reproductible et facile à utiliser qui génère des cellules HiPS normalisées à partir de fibroblastes. Il offre également un système de culture convivial pour la maintenance de cellules hiPS établies. Ce protocole a été utilisé pour dériver plus de 300 lignées cellulaires hiPS dans l'installation suédoise nationale iPS Core chez Karolinska Institutet dont certaines lignes ont déjà été décrites 15 , 16 .

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Protocol

La collecte du matériel du patient et la dérivation des cellules HiPS sont approuvées par le Ethics Review Board, Stockholm, le 28 mars 2012, numéro d'enregistrement: 2012 / 208-31 / 3. Les étapes de culture cellulaire doivent être effectuées dans des armoires de sécurité biologique, sauf mention contraire. Toujours pratiquer des techniques de manipulation stérile lorsque vous travaillez avec des cellules. Permet aux médias, les plaques et les réactifs d'atteindre la température ambiante avant de commencer. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 à haute humidité.

1. Isolation des fibroblastes humains à partir de biopsie cutanée

  1. Préparations de milieu de culture, enzymes digestives, revêtement de vaisselle et outils de dissection.
    1. Préparer le milieu de fibroblastes: 44,5 mL du milieu Dulbecco modifié par IMDG (Isabelle), 5 mL de sérum bovin fœtal (FBS) et 500 μL de pénicilline / streptomycine (PEST) (voir tableau 1 ), conserver à 4 ° C.
    2. Préparer des enzymes digestives à une concentration de travail de 1 mg / mL: weiGh aliquotes de 4 mg de dispase et de la poudre de collagénase de type I dans des tubes séparés de 15 ml et dissolvent dans 4 mL de DMEM / F12 + 1% de PEST. Stériliser la solution enzymatique en la passant par une crépine de 0,22 μm. Préparez des solutions enzymatiques fraîches à chaque fois.
    3. Enduire un puits dans une plaque de culture de tissu de 6 puits (ou un plat de culture de tissu de 35 mm) par biopsie disséquée avec 1 ml de gélatine à 0,1% dans une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
    4. Autoclavez un ensemble de ciseaux chirurgicaux et de pinces par biopsie pour dissection.
  2. Traitement de la biopsie
    REMARQUE: organisez les biopsies le plus rapidement possible après avoir été prises. Stockez dans PBS + 1% PEST jusqu'à 48 h à 4 ° C. La biopsie doit être de 2 à 4 mm de diamètre et conformément aux permis éthiques.
    1. Transférer la biopsie dans un plat de 35 mm. Déplacez la biopsie dans un nouveau plat de 35 mm et immergez la biopsie dans 2 ml d'éthanol à 70% pendant 30 s.
    2. Déplacer la biopsie à un tiersPlateau de 35 mm et lave avec 1 ml de solution de sel équilibré Hank stérile (HBSS) additionnée de 1% de PEST.
    3. Transférer la biopsie dans un quatrième plat de 35 mm, ajouter 1 ml d'une solution préparée à 0,1%.
    4. Coupez la biopsie de la peau en 1 à 2 mm 3 dans le plat en utilisant des ciseaux chirurgicaux et des pinces, puis transférez des morceaux de biopsie, y compris la solution dispersée dans un tube de 15 ml. Ajouter 2 ml supplémentaires de dispase.
    5. Rincer le plat de 35 mm avec une solution de 1 mL et passer au tube de 15 ml.
    6. Incuber la biopsie à 4 ° C pendant la nuit.
    7. Ajouter 4 ml de 0,1% de collagénase I au tube et incuber à 37 ° C pendant 4 h.
    8. Centrifuger les cellules digérées 300 xg pendant 3 min, aspirer le surnageant et remettre à nouveau en suspension dans 2 mL de milieu fibroblaste.
    9. Retirer la solution de gélatine de la plaque de culture tissulaire à 6 puits. Transférer la suspension de la cellule, y compris les morceaux restants sur une plaque de culture tissulaire de 6 po (ou 35 mM plaque de culture de tissu) pré-revêtue avec 0,1% de gélatine dans du DPBS.
    10. Changez le moyen tous les trois jours.
  3. Expansion des fibroblastes humains
    REMARQUE: Les fibroblastes sont prêts à être passés dans un flacon de culture tissulaire T25 (25 cm 2 ) lorsque 80% confluent ( figure 2B ). Les fibroblastes atteignent généralement 80% de confluence dans les 7 jours. Cependant, le temps nécessaire peut varier considérablement mais ne doit pas dépasser 4 semaines.
    1. Aspirer le milieu et laver une fois avec 2,5 ml de DPBS.
    2. Enlever le DPBS et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (0,05%) et incuber à 37 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules présentent des bords arrondis et commencent à se détacher.
    3. Ajouter 2 ml de milieu fibroblaste, si nécessaire, rincer les cellules en assurant une désassociation appropriée des cellules. Transférer la solution cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à 300 xg pendant 3 min.
    4. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot cellulaire dans 5 mL de fibroblastes et former des fibroblastes dans unFlacon T25 de culture de tissu cellulaire sur couche. Lors de l'expansion des fibroblastes après cette étape, se dissocier comme décrit ci-dessus et semer 12 x 10 3 cellules / cm 2 .
    5. Une fois que les cellules confluentes sont prêtes à être gelées, développez ou plaque pour la reprogrammation. Congéler deux cycles de fibroblastes avant toute nouvelle reprogrammation (voir la section suivante pour la procédure de congélation). L'efficacité de la reprogrammation est généralement plus élevée pour les fibroblastes de passage inférieur, les cellules au passage 2 à 4 sont optimales. Cependant, la reprogrammation réussie des fibroblastes jusqu'au passage 10 a été effectuée en utilisant ce protocole.
  4. Congélation et décongélation des fibroblastes
    1. Préparer un milieu de congélation de fibroblastes frais: 90% de FBS + 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver à 4 ° C ( Tableau 1 ). Une fois confluent, le flacon de culture tissulaire T25 peut être congelé en trois cryovials. Préparer 500 μL de milieu de congélation par fibroblaste par flacon congelé.
    2. Pour congeler les cellules, dissociez cComme décrit à l'étape 1.3, comptent des cellules en utilisant un hémocytomètre et transfèrent des portions de 3 x 10 5 cellules à des tubes de 15 ml. Essuyer les tubes à 300 xg pendant 3 min. Aspirer le surnageant.
    3. Remettre en suspension les granulés cellulaires dans 500 μL de milieu de congélation fibroblaste à 4 ° C et transférer dans des cryogéniques. Placez les flacons dans un récipient de congélation et incube les cellules à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer à l'azote liquide pour un stockage à long terme.
    4. Pour décongeler les cellules, immerger la partie inférieure du cryovial à 37 ° C d'eau. Une fois liquéfiés, transférer la suspension cellulaire dans un tube à 15 mL et ajouter 5 mL de milieu fibroblaste. Spin cells 300 xg pendant 3 min.
    5. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu fibroblaste. Transférer des cellules dans un flacon de culture tissulaire T25 non revêtu et incuber à 37 ° C.

2. Reprogramme Vectorielle SeV des Fibroblastes

  1. Préparation d'aliquotes vectorielles ATTENTION: manipuler le SeV sous le contrôle du niveau de biosécurité 2. Reportez-vous au protocole du fabricant et aux directives locales 17 . Le titre du virus varie entre les lots.
    1. Avant de préparer des aliquotes, calculer la quantité de vecteur nécessaire pour 5 x 10 4 cellules selon le protocole du fabricant ( p . Ex . , CytoTune 2.0). Le titre du virus varie généralement de 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Décongeler et combiner les vecteurs 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 et hKlf4 = MOI 3). Portez le montant calculé pour la reprogrammation de 5 x 10 4 cellules dans des tubes de 1,5 mL autoclavés. Diluer les aliquotes de virus avec un milieu de fibroblaste jusqu'à un volume final de 250 μL pour la reprogrammation.
      NOTE: Chaque flacon est valable pour la reprogrammation d'un puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits avec 5 x 10 4 fibroblastes. Conserver les aliquotes de virus à -80 ° C.
  2. Transduction du vecteur SeV
    1. Aspirer la celluleLuring medium et laver avec 1 mL de DPBS. Aspirez le DPBS et ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA (0,05%). Incuber à 37 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules soient détachées.
    2. Ajouter 2 ml de milieu de fibroblastes et ré-endiguer les cellules et les transférer dans un tube de 15 ml. Centrifuge 300 xg pendant 3 min.
    3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 ml de milieu fibroblaste.
    4. Compter les fibroblastes en utilisant un hémocytome et semer 5 x 10 4 cellules dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Incuber les cellules à 37 ° C pendant une nuit.
    5. Aspirer le milieu de culture cellulaire, ajouter 250 μL de la solution de SeV et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
    6. Changez quotidiennement le milieu au milieu fibroblaste frais. Permettre aux cellules transduites de croître pendant 7 jours avant d'être passées dans des plaques revêtues de LN-521. Préparez les plaques LN-521 le jour avant le passage. Voir 2.3.1 pour la procédure de revêtement.
  3. Réplique des fibroblastes transduits
    1. Préparation de LN-521 vaisselle revêtue: Diluer LN-521 dans du DPBS jusqu'à une concentration finale de 0,63 μg / cm 2 . Pipettez 2 mL de la solution LN-521 pour un plat de culture tissulaire de 60 mm. Sceller le plat de culture de tissu de 60 mm en utilisant du parafilm. Incuber pendant une nuit à 4 ° C.
    2. Préparez les aliquotes moyennes Essential 8 (E8) pour une manipulation plus facile: 48,5 ml de milieu E8, 1 ml de supplément E8 et 500 μL de PEST ( tableau 1 ).
    3. 7 jours après la transduction, passage des cellules à un plat de culture de tissus 60 mm revêtu de LN-521. Ajouter 250 μL de trypsine-EDTA (0,05%) et incuber à 37 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules se soient détachées. Ajouter 2 ml de milieu fibroblaste et centrifuger des cellules pendant 3 min à 300 x g.
    4. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension les pastilles dans 2 mL de milieu fibroblaste et compter les cellules dans un hémocytomètre. Aspirer la solution LN-521 à partir de la plaque pré-revêtue et semer 4 x 10 4 cellules dans 5 ml de milieu fibroblaste dans le plat LN-521 pré-revêtu de 60 mm. Ajouter l'inhibiteur de Rho-kinase Y-27632(ROCKi) à une concentration finale de 5 μM. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
    5. Fait important, le lendemain, changez de moyenne à moyenne E8. Changer E8 moyen tous les jours. Les colonies de cellules HiPS apparaîtront dans les 2 à 3 semaines.

3. Picking of Colonies and Expansion of HiPS Cells

REMARQUE: les étapes suivantes sont effectuées en dehors du coffret de sécurité biologique sous un microscope stéréo. L'utilisation de masques de défilement et de procédure est recommandée. Travailler soigneusement pour ne pas contaminer la culture cellulaire.

  1. Préparer des plaques à 24 po de culture tissulaire recouvertes de LN-521 le jour avant la cueillette. Diluer LN-521 dans DPBS 0,63 μg / cm 2 . Pipetter 250 μL de la solution LN-521 dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Plaques d'étanchéité à l'aide de parafilm. Incuber pendant une nuit à 4 ° C.
    NOTE: Les colonies sont prêtes à être choisies lorsqu'elles atteignent une taille> 1 mm de diamètre. Les colonies devraient afficher des bords tranchants et croître en un monomètre homogèneOlayers ( figure 2D ).
  2. Aspirez la solution LN-521 et ajoutez 500 μL de E8 dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
  3. Couper les colonies en petits morceaux avec un scalpel dans une grille comme un motif sous un stéréomicroscope. Rincez mécaniquement les feuilles de cellules du plat et transférez les feuilles en utilisant une pipette de 200 μL au puits préparé ( Figure 2D -2E ). Choisissez les colonies dans des puits distincts.
  4. Permettre aux cellules de se fixer sans changer de support pendant 48 h. Ensuite, changez E8 moyennement par jour.
  5. Lorsque les colonies ont atteint une taille de> 5 mm, les cellules de passage enzymatique en tant que cellules individuelles dans un nouveau puits d'une plaque revêtue de LN-521.
  6. Aspirer le milieu de culture cellulaire des cellules et laver avec 250 μL de DPBS.
  7. Aspirez le DPBS. Ajouter 250 μL de réactif de dissociation et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
  8. Observez que les cellules ont commencé à s'arranger. DétacherCellules de la plaque en rinçant les cellules avec un réactif de dissociation à plusieurs reprises.
  9. Ajouter 500 μL de milieu E8 à un tube de 15 ml. Transférer les cellules dans le réactif de dissociation au tube et centrifuger pendant 3 min à 300 x g.
  10. Aspirer la solution LN-521 du puits pré-revêtu LN-521 et ajouter 500 μL de température ambiante E8 moyenne.
  11. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 μL de milieu E8.
  12. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et semer 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 cellules dans le puits pré-revêtu LN-521 préparé (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 cellules / cm 2 ). Le format de culture cellulaire peut facilement être amélioré en fonction du but recherché.
  13. Ajouter ROCKi à une concentration finale de 10 μM. Incuber les cellules à 37 ° C.
  14. Changer E8 moyen tous les jours. Les cellules sont habituellement prêtes à passer après 4 à 6 jours. Cellules de passage enzymatique comme cellules individuelles comme décrit ci-dessus lorsque environ 90% confluent.
    NOTE: Les vecteurs de reprogrammation sont progressivement dilués au cours de l'expansion de la cellule hiPS et ne sont pas détectables après le passage 12. Les cellules qui sont reprogrammées de manière impartiale cessent généralement de proliférer autour du passage 6-10 ou perdent leur morphologie caractéristique de la cellule souche pluripotente ( figure 3B ).
  15. Congélation et décongélation des cellules HiPS
    1. Pour congeler des cellules, dissocier enzymatiquement les cellules comme cellules simples comme décrit ci-dessus, compter les cellules dans un hémocytomètre et transférer 2,5 x 10 5 cellules dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de milieu E8. Centrifuger à 300 xg pendant 3 min. Aspirer le surnageant.
    2. Remettre en suspension la culot cellulaire dans 250 μL de cryomedium PSC à 4 ° C et transférer à un cryogène. Placer le flacon dans un récipient de congélation et incuber les cellules à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer à l'azote liquide pour un stockage à long terme.
    3. Pour décongeler les cellules, préparer un puits LN-521 pré-revêtu d'une culture tissulaire à 24 puitsPlaque en aspirant la solution LN-521 et en ajoutant 250 μL de milieu E8. Immergez la partie inférieure du cryovial à 37 ° C d'eau jusqu'à ce que seul un petit glaçon reste.
    4. Ajouter 250 μL de E8 Medium au cryovial et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et ajouter 1 ml de milieu E8. Spin cells 300 xg pendant 3 min.
    5. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 250 μL de température ambiante E8 moyenne. Transférer la suspension cellulaire dans le puits préparé et ajouter un supplément de viabilité cellulaire de 1% ou ROCKi 10 μM. Incuber la plaque de culture tissulaire à 37 ° C.

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Representative Results

De la biopsie aux cellules HiPS

L'ensemble du processus, de la biopsie aux cellules hiPS établies, sans vecteur de reprogrammation et prêt à être caractérisé, prend environ 16 semaines ( Figure 1 ). Un calendrier plus détaillé est spécifié dans la figure 2A . Il faut environ 4 semaines pour établir et développer des cultures de fibroblastes. Les premières colonies de cellules hiPS ont commencé à émerger environ trois semaines après la transduction du vecteur Sendai. Les colonies ont été choisies mécaniquement pour le premier passage, puis passées enzymatiquement sous forme de cellules individuelles.

Établissement de cultures de fibroblastes humains

Lorsque les cultures de fibroblastes humains sont devenues confluentes et ont montré une morphologie acceptée, elles ont d'abord été expansées et congelées pour deux passagEs avant d'être plaqué pour la transduction ( figure 2B ).

Reprogrammation des fibroblastes humains en utilisant des vecteurs SeV

Des niveaux accrus de décès cellulaire ont été observés dans les jours qui ont suivi la transduction du SeV et de légères modifications de la morphologie des fibroblastes. L'apparition des premières colonies hiPS a été détectée à partir du jour 12 après la transduction ( figure 2A , 2C ). Les colonies prêtes à être cueillies étaient attendues d'environ trois à quatre semaines après la transduction ( figure 2A , 2D ). L'ensemencement des cellules dans les quantités spécifiées dans ce protocole a entraîné une abondance de colonies émergentes (<20). La sélection sélective des colonies présentant une morphologie favorable est recommandée. Les caractéristiques de colonies préférées comprenaient la masse de cellules compactes aplaties, la croissance sous forme de monocouches homogènes, l'indice distinguable Cellules individuelles avec un bord tranchant vers les fibroblastes environnants ( figure 2D ). Les colonies de cellules HiPS ont été coupées dans un modèle en forme de grille en utilisant un scalpel et passaged mécaniquement ( Figure 2E ). Les clones hiPS sélectionnés ont été laissés pendant 48 heures pour adhérer à la plaque sans changement moyen. Les clones cellulaires hiPS étaient très homogènes, mais peu de fibroblastes provenant de la plaque de reprogrammation ont été tolérés pendant les deux premiers passages ( figure 2F ). La sélection des colonies avec des frontières difficiles et une grande masse cellulaire hétérogène non compacte devrait être évitée ( figure 2G ). Les lignées cellulaires HiPS obtenues sont devenues des monocouches denses, avec un large ratio noyau-cytoplasme et ont défini des frontières luminescentes. En revanche, les colonies non homogènes adhérentes qui ne satisfaisaient pas à ces critères ont été rejetées ( Figure 2H ) pour éviter les cultures de populations de cellules mixtes.

P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Validation des clones de cellules hiPS

La caractérisation par pluripotence des cellules dérivées a été effectuée après la perte du vecteur SeV et le maintien de l'état pluripotent a été conduit par l'expression de facteurs endogènes. Avant de procéder à la validation de la cellule hiPS, assurez-vous que l'expression du vecteur SeV a été perdue. Suivant ce protocole, l'ARN du vecteur SeV n'est plus détectable par le passage 12 selon notre expérience, donc un point de démarrage approprié ( figure 3A ). La coloration par immunocytochimie pour les marqueurs de pluripotence OCT4, SSEA4 et NANOG devrait donner un résultat homogène positif ( Figure 3B ). Les cultures cellulaires contenant des cellules partiellement reprogrammées qui n'ont pas exprimé de facteurs de pluripotence ont été rejetées ( figure 3C ). L'expression de l'ARNm des gènes endogènes de pluripotence est montrée en temps réel-PC R (RT-PCR) de la figure 3D .

Les cellules souches pluripotentes devraient facilement pouvoir se différencier en trois couches germinales. Le potentiel de différenciation des cellules hiPS a été évalué par la formation de corps embryoïdes (EB) 18 . Les EB flottants générés à partir des cellules HiPS sont présentés à la figure 3E et l'expression de l'ARNm des marqueurs spécifiques de la couche germinale après 21 jours de différenciation EB est représentée à la figure 3F .

Figure 1
Figure 1: Tableau de flux de la biopsie cutanée aux cellules HiPS.
Vue d'ensemble des principales étapes du protocole. L'illustration comprend la collecte de la biopsie, l'isolement des fibroblastes, la transduction du SeV, la cueillette des colonies et l'expansion clonale des cellules HiPS.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Étapes critiques dans la génération des cellules HiPS.
(A)
Chronologie mettant en évidence des points de temps importants dans le protocole, y compris le placage de fibroblastes, la transduction de SeV, les changements moyens et les revêtements. Le passage 12 des cellules hiPS est mis en évidence comme le début des expériences de caractérisation. (B) Image de champ lumineux de fibroblastes confluents en culture avec une morphologie typique. (C) Émergence de colonies de cellules HiPS à partir de fibroblastes transduits. (D) Prêt à choisir une colonie affichant des caractéristiques préférentielles, une masse cellulaire compacte aplatie, des cellules individuelles distinguables avec des bords tranchants vers les fibroblastes environnants (Passage 0). (E) hiPSLes colonies de cellules sont coupées dans un motif en forme de grille et passées mécaniquement . (F) Adhérent la colonie après quelques jours de croissance. Les cellules hiPS adhérentes sont entourées d'un nombre inhabituellement élevé de fibroblastes provenant de la plaque de reprogrammation. Les fibroblastes peuvent être raclés de la plaque et disparaîtront très probablement avec les passages de cellules individuelles ultérieurs (Passage 1). (G) Les colonies présentant une morphologie ne rappellent pas les cellules complètement reprogrammées; Frontières difficiles, grande masse cellulaire hétérogène non compacte. (H) Image de champ lumineux illustrant une ligne cellulaire hiPS complètement reprogrammée par un passage précoce, par rapport à une lignée cellulaire hautement hétérogène. Les barres d'échelle indiquent 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3 Figure 3: Caractérisation des cellules HiPS.
(A)
RT-PCR des marqueurs spécifiques du vecteur SeV. Les cellules HiPS au passage 3 sont utilisées comme contrôle positif pour les vecteurs de reprogrammation. Au passage, les 12 cellules sont négatives pour l'expression de marqueurs spécifiques au virus, le squelette spécifique de Sendai (SeV B), le KLF4 spécifique de Sendai (KLF4 SeV), le cMYC spécifique de Sendai (cMYC SeV), le contrôle PCR (GAPDH) et aucun modèle (-). (B) Exemple représentatif d'une ligne cellulaire hiPS homogène complètement reprogrammée au passage 12. L'image de champ lumineux des cellules HiPS révèle que les cellules se développent dans des monocouches étroites avec des bords luminescents tranchants et avec de gros noyaux et un petit cytoplasme. La coloration par immunocitochimie des marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG, SSEA4 et coloration nucléaire 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) démontrant une expression positive homogène. (C) Lignée cellulaire présentant une expression hétérogène pour le marqueur de pluripotence NANOG. La cultureE contient des cellules partiellement reprogrammées et doit être jeté. (D) RT-PCR de l'expression de l'ARNm des marqueurs de pluripotence NANOG, OCT4, contrôle PCR (GAPDH) et aucun modèle (-) indiquant l'expression des marqueurs de pluripotence. (E) Des corps embryoïdes flottants libres générés à partir de cellules HiPS. (F) La RT-PCR après 21 jours de différenciation du corps embryoïde montre que les cellules hiPS dérivées sont capables de différencier les trois couches germinales. Marqueurs endodermiques AFP et GATA4, marqueurs mésodermiques RUNX et HAND1, marqueurs ectodermiques NCAM et NESTIN, contrôle PCR (GAPDH) et pas de modèle (-). Les barres d'échelle indiquent 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le résultat attendu de ce protocole est la génération réussie de plusieurs lignées cellulaires hiPS dérivées de manière clonale. Il est important de noter que la méthode pour la maintenance et l'expansion des cellules hiPS établies ici décrit est fiable et peut être effectuée avec peu d'expérience préalable de la culture de cellules souches. Le transfert enzymatique d'une seule cellule avec ROCKi avec la matrice LN-521 est connu pour maintenir les cellules comme caryotypiquement normales, pluripotentes et facilement capable de se différencier tout en évitant l'hétérogénéité induite que les passages à base de colonies peuvent stimuler 10 , 19 , 20 . Les cellules HiPS cultivées sur LN-521 peuvent être passées en cellules simples sans addition de ROCKi 10 , l'ajout de ROCKi rend cependant le protocole plus facile pour les gestionnaires moins expérimentés et réduit le temps requis pour la dérivation de cellules hiPS.

L'efficacité de la reprogrammation est égaleNéralement pas un problème avec ce protocole; Les vecteurs SeV ont une efficacité de reprogrammation relativement élevée> 1% pour les fibroblastes 11 . L'émergence d'une abondance de colonies (<20) est attendue. Il est recommandé de choisir trois fois le nombre de colonies nécessaires. On a observé qu'une partie des clones sélectionnés n'observait pas après la cueillette. Des colonies supplémentaires pourraient également être nécessaires pour compenser les colonies partiellement reprogrammées. Les colonies partiellement reprogrammées sont dans certains cas capables d'adhérer et de se développer par une expression exogène de gènes de pluripotence par les vecteurs SeV. Lorsque les vecteurs SeV sont dilués, ces cellules cesseront de proliférer et se dissocieront, généralement apparentes autour du passage 6-8. L'hétérogénéité de la culture est également un signe de reprogrammation partielle et les lignes hétérogènes doivent être rejetées ( figure 2H ).

Le choix optimal des conditions de vecteur et de culture de reprogrammation dépend duObjectif des cellules générées. Cependant, pour éviter les variations de lot à lot influençant les résultats, des conditions définies sont recommandées. Le choix d'un système de vecteur non intégrant est suggéré pour conserver l'intégrité génomique des cellules reprogrammées. Les vecteurs SeV ont été choisis dans ce protocole en raison de la robustesse, de l'efficacité relativement élevée et du faible temps requis. Les vecteurs SeV sont dilués pendant les divisions cellulaires et ne sont pas détectables autour du passage 12, ce qui garantit que les données générées ne sont pas influencées par une expression exogène. En raison des exigences méticuleuses imposées aux cellules destinées à des fins cliniques, la reprogrammation de SeV peut être un obstacle à la traduction clinique, car il est difficile de prouver que l'élimination complète de tous les vecteurs est difficile. La reprogrammation médiée par l'ARNm peut être avantageuse si dérive des cellules avec l'utilisation prévue dans les thérapies cellulaires 12 . Ces méthodes sont cependant beaucoup plus exigeantes en main-d'œuvre et plus compliquées à utiliser 21 . La méthode ici estDécrit pour la culture des fibroblastes n'est pas adapté aux applications cliniques. Étant donné que le FBS et la gélatine sont xénogénétiques et non définis, envisagez de les transformer en produits sans xénon définis 22 .

Des techniques de manipulation stérile et des tests réguliers d'infection par mycoplasmes sont recommandés tout en travaillant avec n'importe quelle forme de culture cellulaire. La peau humaine contient de nombreux microorganismes qui pourraient prospérer dans les conditions où les cellules sont cultivées si elles ne sont pas correctement manipulées. Il est donc recommandé d'être plus vigilant dans la manipulation des biopsies cutanées et pendant les premiers jours de culture après le traitement de la biopsie. L'établissement de la culture des fibroblastes à partir de biopsies cutanées est, en effet, un processus long. Après le traitement de la biopsie cutanée, il y aura d'abord des signes faibles de collage de fibroblastes, attendre au moins une semaine pour trouver quelques cellules de fibroblastes présentant une morphologie attendue dans la culture. Le temps nécessaire à l'établissement de fibroblastesLes cultures in vitro à partir de biopsies dépendent d'une variété de facteurs, y compris la taille de la biopsie, l'âge du donneur et la façon dont la biopsie a été prise depuis sa prise. Il est préférable de reprogrammer les fibroblastes de passage précoce pour une efficacité de reprogrammation optimale 23 .

En résumé, nous décrivons ici une méthode solide et facile à utiliser établie pour la génération de cellules HiPS hautement homogènes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à signaler.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des agents de financement SSF (B13-0074) et VINNOVA (2016-04134).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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