Author Produced

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ragauskas, S., Kielczewski, E., Vance, J., Kaja, S., Kalesnykas, G. In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model. J. Vis. Exp. (131), e56173, doi:10.3791/56173 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Laser-geïnduceerde choroidal neovascularization (CNV) is een reeds lang gevestigde model na te bootsen de natte vorm van leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD). In dit protocol willen we de lezer niet alleen door de technische overwegingen voor het genereren van laser-geïnduceerde laesies om te activeren neovascular processen, maar eerder de nadruk op de krachtige informatie die kan worden verkregen vanuit de multimodale longitudinale gids in vivo imaging in de follow-up periode.

De laser-geïnduceerde muis CNV model werd gegenereerd door een diode laser rechtsbedeling. Multimodale in vivo imaging technieken werden gebruikt voor het controleren van CNV inductie, progressie en regressie. Eerste, spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) werd uitgevoerd onmiddellijk na het laseren om te controleren of een onderbreking van de Bruch membraan. Latere in vivo imaging met fluoresceïne-angiografie (FA) bevestigd succesvolle schade van Bruch de membraan van seriële beelden verworven op choroidal niveau. Longitudinale follow-up van CNV proliferatie en regressie op dagen 5, 10 en 14 na het laseren werd uitgevoerd met behulp van zowel de SD-OCT en de FA. Eenvoudige en betrouwbare sortering van lekkende CNV leasions van FA beelden wordt gepresenteerd. Automatische segmentatie voor meting van de totale dikte van het netvlies, gecombineerd met handmatige kaliber toepassing voor meting dikte van de retinale bij CNV sites, toestaan onbevooroordeelde evaluatie van de aanwezigheid van oedeem. Ten slotte is de histologische verificatie van CNV uitgevoerd met behulp van isolectin GS-IB4 kleuring op choroidal flatmounts. De kleuring is thresholded, en het gebied isolectin-positief wordt berekend met ImageJ.

Dit protocol is vooral handig in therapeutics studies vereisen hoge-doorvoer-achtige screening van CNV pathologie aangezien het toestaat snel, multimodale en betrouwbare classificatie van CNV pathologie en retinale oedeem. Bovendien, kan hoge resolutie SD-OCT de opname van andere pathologische kenmerken, zoals de vochtophoping subretinal of intraretinal. Deze methode biedt echter geen mogelijkheid voor het automatiseren van CNV volume analyse van SD-OCT beelden, die moet handmatig worden uitgevoerd.

Introduction

De eerste succesvolle poging om na te bootsen de pathologie van menselijke CNV bij knaagdieren werd bijna drie decennia geleden aangetoond met een laser krypton in Long-Evans ratten1. Daarna werd een krypton laser gebruikt om breken Bruch de membraan in de meest populaire muis spanning, C57BL/6J2,3,4. Het slagingspercentage van CNV inductie werd gecontroleerd met FA en histologische vlekken. Een snelle ontwikkeling van noninvasive beeldvormende modaliteiten, zoals okt, bevorderd de groei van het gebied van knaagdier preklinische modellen. De mogelijkheid om te controleren van morfologische veranderingen in het netvlies op meerdere tijdstippen in de dezelfde ogen aanzienlijk bijdraagt aan de vermindering van dierlijke gebruik en verhoogt de efficiëntie in experimentele studies. Histologische evaluatie van CNV laesies is eerder ongecompliceerd, en vereist labeling van abnormale vasculaire groei rond de site van laser administratie en beeldacquisitie gebied/volume schatting met behulp van de software van de analyse van een afbeelding. In vivo imaging modaliteiten introduceren daarentegen meer complexe analyses van CNV pathologie en de interpretatie ervan.

Hier presenteren we een eenvoudige en relatief snelle methode om de rang inductie, progressie en regressie van CNV met behulp van FA, SD-OCT, en de automatische segmentatie methode in de muis laser-geïnduceerde CNV model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren waren behandeld in overeenstemming met de verklaring van ARVO voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en onderzoek van de visie en de EG-richtlijn 86/609/EEG voor dierproeven, met behulp van protocollen goedgekeurd en gecontroleerd door het dier Experiment Board van Finland.

1. laser-geïnduceerde muis CNV model 5

  1. Inspecteer de ogen van het dier macroscopisch voor eventuele afwijkingen.
  2. Weeg de muis.
  3. Berekenen en bereiden een passend bedrag van verdoving te gebruiken, gebaseerd op het gewicht van het dier, bijvoorbeeld een mengsel van medetomidine (1 mg/kg), ketamine (75 mg/kg) en gedestilleerd water (0,9% NaCl-oplossing) in een verhouding van 1:1.5:2.5 of ketamine (40-75 mg/kg), xylazine (5 mg/kg), en gedestilleerd water (0,9% NaCl-oplossing) in een verhouding van 1:2. 5:1; injecteren voor een muis-20 g, 0,1 mL van het mengsel.
  4. Injecteren verdoving intraperitoneally.
  5. Plaats de muis terug in de kooi en wacht totdat het dier wordt verdoofd. Bevestig dat de muis is goed verdoofd door gebrek aan een pedaal reflex.
  6. Zorgen voor het gebruik van laser veiligheid persoonlijke beschermingsmiddelen.
  7. Zet een spleetlamp en een 532 nm diodelaser.
  8. Verwijder de muis uit de kooi en de plaats op de verwarming pad.
  9. Een druppel Tropicamide voor bestaat dilatatie van toepassing. 3-5 min wachten voor full (3 mm) bestaat dilatatie.
  10. Plaats de muis op het podium van de spleetlamp.
  11. Plaats één druppel van oogheelkundig vloeibare gel op een dekglaasje aan aan zaden het hoornvlies.
  12. Het oog van de muis met het hoofd van de oogzenuw in het midden te oriënteren.
  13. Stel de macht van de laser om 100 mW, de duur aan 100 ms en de spot vergroot tot 50 µm.
  14. Richten de laserstraal op de retinale pigment epitheel (RPE).
  15. Maak drie schoten van de laser in één oog door het vermijden van retinale bloedvaten ideaal op de 4, 8, en 12 uur posities rond de oogzenuw, respectievelijk. Inspecteer de fundus van het oog na graveer-schoten voor de afwezigheid van retinale bloedingen. Het contralaterale oog dient als een besturingselement niet-lasered.
  16. Gooi de dekglaasje aan en plaats de muis weer op de verwarming pad.
  17. Breng een druppel van PEG gel druppels op beide ogen.

2. SD-OCT 6,7

  1. Plaatst u de muisaanwijzer in het werkgebied knaagdier uitlijning en immobiliseren van het hoofd.
  2. Hiermee lijnt u de lens van de SD-OCT-systeem (bijvoorbeeld, Bioptigen/Leica Envisu R2200) aan het gezicht van het oog voor in vivo imaging met behulp van de X - en Y-fase controllers.
  3. SD-OCT scans om te controleren of de einden van de Bruch membraan uitvoeren: zodra de SD-OCT het hele oog scant, handmatig verplaatsen de referentielijn op de lasered sites. Einden van de Bruch membraan moet duidelijk zichtbaar zijn in lasered gebieden (Zie Figuur 1).

3. fluoresceïne-angiografie 7,8,9

  1. Muis verwijderen met de houder, en plaats deze op de VA-systeem (bijvoorbeeldHeidelberg Spectralis HRA2).
  2. Focus op laser branden gebieden van de fundus van het oog met behulp van Infrarood reflectie modus met het hoofd van de oogzenuw in het midden van het weergavevenster.
  3. 0,1 mL 5% fluoresceïne natriumzout voor een muis 20 g injecteren subcutaan of intraperitoneally.
  4. Focus op het choroidal niveau.
  5. Neem een beeld van het niveau van de choroidal focus.
  6. Heroriënteren op het netvlies niveau en een foto.
  7. Wacht 30 s en herhaal stappen 3.4-3.6.
  8. Verwijder de muis uit de houder en plaats deze op de verwarming pad.
  9. Omgekeerde verdoving door alpha2-antagonist voor medetomidine, atipamezole (0,5 mg/kg, i.p.) of wachten op dierlijke herstel van anesthesie.
  10. Herhaal in vivo SD-OCT en FA imaging in narcose dieren op de follow-up dagen 5, 10 en 14.

4. CNV sortering

  1. Rang de schade van de Bruch membraan van OCT beelden en choroidal FA beelden genomen onmiddellijk na het laseren op dag 0 als volgt:
    0 - Bruch van membraan werd niet beschadigd.
    1 - succesvolle schade van Bruch van membraan
  2. Rang de aanwezigheid van CNV van lasered plekken die had lekkage zoals waargenomen door het vergelijken van de dynamiek van fluoresceïne signaal in een reeks van retinale FA afbeeldingen als volgt:
    0 - normale weergave van het netvlies
    0,5 - flauw kleuring van lekkage
    1.0 - lekkende CNV gebieden
    Opmerking: Gebruik de OCT beeldvorming voor extra bevestiging van CNV of in twijfelachtig FA waar de aanwezigheid van intraretinal vloeistof in OCT beelden stel CNV sortering.

5. retinale diktemetingen

  1. Gebruik een software van automatische segmentatie voor retinale diktemetingen. Zorgen dat de totale dikte van het netvlies wordt beschouwd, als de dikte van alle lagen van de zenuw vezel laag RPE (gezonde meting sites), of een denkbeeldige lijn aansluiten RPE rond de site van schade (lasered plaatsen) (Zie ook Figuur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een zeepbel of subretinal bloeden onmiddellijk na het laseren is niet altijd zichtbaar. SD-OCT is daarom bijzonder belangrijk om te controleren of de schade van de Bruch membraan. Figuur 1 toont een voorbeeld van OCT imaging op verschillende tijdstippen na toediening van de laser.

Figure 1
Figuur 1 : OCT nl gezicht weergave van oog fundus (VIP afbeelding) ziet u drie lasered gebieden die worden beschreven in de witte, groene en rode cirkels. OCT B-scan beelden werden genomen voorafgaande het laseren (basislijn), onmiddellijk na het laseren om te controleren of een onderbreking van de Bruch membraan (0 dagen, pijlen wijzen naar de site van schade), en 5, 10 en 14 dagen na toediening van de laser. Zoals kan worden afgeleid uit het gebied geschetst in wit (eerste rij van de beelden), CNV deed niet ontwikkelen op latere tijdstippen. Het gebied geschetst in groen en rood ontwikkeld CNV, die is aangetroffen op de terugkomdag 5. Echter, bij de 10 en 14 dag timepoints, deze letsels CNV achteruitgegaan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuren 2 en 3 tonen seriële geschikt zijn met behulp van FA, die bevestigd succesvolle schade van Bruch de membraan in alle drie plekken op dag 0 in een mannelijke 10-week-oude C57BL/6jRj muis.

Figure 2
Figuur 2 : Seriële FA imaging genomen elke 20 s (foto's 1 t/m 18) op choroidal niveau onmiddellijk na toediening van de laser. Witte pijlen in afbeelding 1 punt naar lasered sites, waaruit fluoresceïne lekkage op latere timepoints (witte pijlen in beeld 18). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Seriële FA imaging genomen elke 20 s (foto's 1 t/m 18) op het netvlies niveau onmiddellijk na toediening van de laser. CNV-gebied met fluoresceïne lekkage en een sortering van 1 (lekkende CNV) is gewezen door de witte pijl in beeld 18. Opmerking een toenemende intensiteit, evenals fluoresceïne positieve gebied, tijdens de timecourse van FA imaging (witte pijl in afbeeldingen 8 en 11). Twee gebieden die worden beschreven in wit in de afbeelding 18 werden ingedeeld als zijnde een zwakke FA signaal (sortering 0,5). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Naast de sortering van CNV pathologie, is SD-OCT ook nuttig om extra informatie in de laesie site, bijvoorbeeld, aanwezigheid van subretinal vloeistof, oedeem en CNV regressie openbaren. Figuur 4 toont de belangrijkste pathologische kenmerken van laser-geïnduceerde CNV in muizen.

Figure 4
Figuur 4 : Spectrale domein optische coherentie tomografie Imaging van CNV pathologie. SD-OCT biedt een gedetailleerde CNV pathologie binnen retinale weefsel, zoals kan worden gezien van deze representatieve beelden op littekens weefsel, vorming van de CNV en vloeibare accumulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Macula oedeem is een van de voornaamste pathologische kenmerken van natte vorm AMD bij de mens. In de laser-geïnduceerde CNV model, kan retinale dikte worden geëvalueerd met behulp van geautomatiseerde segmentatie. Handmatige meting van geselecteerde lasered sites is vereist voor het meten van de dikte van de retinale op de site van CNV. Figuur 5 ziet u een voorbeeld van een rapport gegenereerd na automatische segmentatie.

Figure 5
Figuur 5 : Kwantificering van retinale dikte. Netvlies dikte zoals gemeten door de segmentering van de geautomatiseerde Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Het gebruik van automatische segmentatie is een snelle manier om een overzicht van retinale dikte (tabel 1). Cijfers 6A en 6B Toon representatieve voorbeelden van automatische segmentatie van een gezonde retinale gebied en vanuit het netvlies gebied met CNV pathologie, respectievelijk. De software herkent ondanks kleine onnauwkeurigheden gevonden in afzonderlijke retinale lagen, over het algemeen onderscheid te maken op een betrouwbare manier de totale dikte van het netvlies in gepigmenteerde muizen.

Figure 6
Figuur 6 : Automatische segmentatie van retinale lagen. Automatische segmentatie van gezonde retinale gebied (A) en netvlies gebied met CNV (sterretje in afbeelding B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Om te evalueren van de retinale dikte op lasered gebieden, was elke lasered zone handmatig als volgt gemeten: de totale dikte van de retinale werd beschouwd als de dikte van alle lagen van de zenuw vezel laag aan de denkbeeldige lijn aansluiten RPE rond de site van schade (Figuur 7 en tabel 1).

Gebied Dag 5 Dag 10 Dag 14
Totale retinale dikte, μm 218±7.8 220±7.2 221±9.8
Lasered gebied 1 200 204 214
Lasered gebied 2 226 217 220
Lasered gebied 3 222 223 227
Gegevens worden gepresenteerd als mean±SD

Tabel 1. Totale dikte van het netvlies en netvlies dikte bij CNV plaatsen tijdens een follow-up van de 14-daagse zoals bepaald door automatische segmentatie, met behulp van inVivoDiver software (v. 3.0.8).

Figure 7
Figuur 7 : Handmatige meting dikte van de retinale bij lasered gebied met CNV pathologie. Gele lijn geeft de totale retinale dikte van zenuw vezel laag aan een denkbeeldige RPE laag (zwarte lijn) op de site van laser administratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Histologisch, werden de CNV laesies bevestigd met behulp van isolectin GS-IB4 labeling (figuur 8A). Afbeelding analysesoftware afbeelding J werd gebruikt voor het berekenen van de oppervlakte van CNV laesie (Figuur 8).

Figure 8
Figuur 8 : Histologische analyse. Histologische vlek van CNV laesie van choroidal flatmount (in het groen, A) kan worden gekwantificeerd aan de hand van drempelmethode in beeld J (B). De bar van de schaal voor A is 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Multimodale imaging biedt waardevolle hulpmiddelen voor CNV pathologie evaluatie. Hier presenteerden we een imaging protocol bestaande uit FA, SD-OCT, en automatische segmentatie voor de snelle, reproduceerbare en betrouwbare evaluatie van CNV pathologie. Een onderbreking van de Bruch membraan na laser regering werd bevestigd. Bovendien mag het gebruik van SD-OCT in dit stadium ook directe visualisatie van mogelijke intraretinal en subretinal bloeduitstortingen, die de interpretatie van resultaten verwarren kunnen. Netvlies lekken waren ingedeeld op basis van het fluoresceïne-signaal van FA beelden. Het gebruik van SD-LGO verstrekt een meer gedetailleerde beschrijving van CNV pathologie. Bovendien, longitudinale SD-OCT-analyse op verschillende tijdstippen gedurende de follow-up gemarkeerd temporele verschillen in de pathologie die ongrijpbaar als FA alleen afhankelijk zou blijven.

Totale dikte van de retinale werd gemeten met behulp van geautomatiseerde segmentatie. Netvlies dikte op sites die CNV was geïnduceerde werd handmatig gemeten. De histologische evaluatie van choroidal flatmount wordt gecontroleerd en het gebied van neovascularization wordt gemeten met behulp van software van de analyse van de afbeelding afbeelding J.

De goede doorzichtigheid van de visuele as is van cruciaal belang voor de succesvolle uitvoering van het voorgestelde protocol. Droogheid van het hoornvlies en de vorming van staar zijn de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij het oplossen van problemen. Daarom, zodra de muis wordt verdoofd, de ogen moeten worden voortdurend gehydrateerd met kunstmatige tranen of gel te handhaven goede hydratatie van het hoornvlies. Het voorgestelde protocol moet worden uitgevoerd bij voorkeur binnen 10 min van de inductie van de anesthesie. Uitgebreide verdoving tijd kan leiden tot de vorming van staar en voorkomen in vivo imaging.

Het beschreven protocol is beperkt tot observationele sortering van CNV progressie op basis van vasculaire lekken op het niveau van het netvlies. Kwantitatieve beoordeling van retinale lekkage kan worden toegevoegd met behulp van Heidelberg Spectralis software, waardoor de afbakening van de ruimte van het lek, en levert kwantitatieve gegevens op het gebied van belang. Daarnaast voorgesteld Sulaiman en collega's (2015) onlangs een berekening van CNV volume van in vivo verworven OCT beelden met behulp van de ellipsoïde methode10. De ellipsoïde model introduceert waarschijnlijk vooroordeel naar overschatting van de omvang van de letsels zoals CNV in de meeste gevallen een onregelmatige vorm heeft. Echter levert hoge correlatie tussen volume metingen uit confocal analyse van histologische monsters en voorgestelde ellipsoïde kwantificering van OCT beelden het bewijs dat de methode een waardevol instrument voor de kwantitatieve evaluatie van CNV volume10 is .

Tot slot, dat wij geloven de gepresenteerde combinatie van verschillende in vivo imaging modaliteiten, samen met automatische segmentatie en histologische analyse, biedt reproduceerbaar zijn en betrouwbare evaluatie van CNV pathologie in preklinische studies. De methode zou bijzonder nuttig zijn voor het bewijs van therapeutische interventiestudies concept.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur Symantas Ragauskas, Ph.D. is een werknemer (onderzoeker) en aandeelhouder van Experimentica Ltd. dat aanbiedingen contract onderzoeksservices dienst de preklinische CNV model gebruikt in dit artikel.

De auteur Eva Kielczewski is een werknemer (onderzoek toepassingen ingenieur, OCT) van Leica Microsystems dat SD-OCT-systemen die worden gebruikt in dit artikel produceert.

De auteur Joseph Vance is een werknemer (nb OCT Sales Director) van Leica Microsystems dat SD-OCT-systemen die worden gebruikt in dit artikel produceert. Joseph Vance is ook voorzitter en managing director van Spective, LLC.

De auteur Simon Kaja, Ph.D. is consultant Chief Scientific Officer en aandeelhouder van Experimentica Ltd., een preklinische contract onderzoek organisatie die aanbiedingen contract onderzoeksservices, incl. de preklinische CNV-model in dit artikel gebruikt. Simon Kaja, Ph.D. is ook CEO van K & P wetenschappelijke, LLC, een adviesbureau, biowetenschappen en fungeert als Dr. John P. en Therese E. Mulcahy begiftigd hoogleraar oogheelkunde aan Loyola Universiteit Chicago, Stritch School of Medicine. De bepalingen van deze overeenkomst zijn herzien en goedgekeurd door de Loyola Universiteit Chicago overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling.

De auteur Giedrius Kalesnykas, Ph.D. is een werknemer (CEO) en aandeelhouder van Experimentica Ltd. dat aanbiedingen contract onderzoeksservices dienst de preklinische CNV model gebruikt in dit artikel.

Acknowledgments

De auteurs bedank Yuliya Naumchuk (Loyola Universiteit Chicago) en Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) voor uitstekende technische en videografische steun. Dr. Kaja het onderzoeksprogramma wordt ondersteund door de Dr. John P. en Therese E. Mulcahy begiftigd hoogleraarschap in oogheelkunde aan de Loyola Universiteit van Chicago.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medetomidine (commercial name Domitor) Orion Vnr 01 56 02 Anesthesia
Ketamine Intervet Vnr 51 14 85 Anesthesia
0,9% NaCl B Braun 357 0340 Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet) Bayer vnr 14 89 99 Anesthesia
Tropicamide Santen Vnr 04 12 36 Mydriatic agent
Viscotears Alcon Vnr 44 54 81 Lubricant
Systane Alcon  - Lubricant
5% Fluorescein sodium salt Sigma Aldrich F6377-100G Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan) Orion Vnr 47 19 53 Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
  2. Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
  3. Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
  4. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
  5. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
  6. Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
  7. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
  8. Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
  9. Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
  10. Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics