Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller

JoVE Journal
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En effektiv screening protokol præsenteres til identifikation af små molekyler, der fremmer astroglial differentiering i glioblastom stamceller (GSCs). Analysen er baseret på en stamcelle differentiering reporter hvorved udtryk for forbedrede normal god landbrugspraksis (eGFP) er drevet af den menneskelige GFAP promotor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56176, doi:10.3791/56176 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glioblastom (GBM) er den mest almindelige og mest dødbringende primær hjernetumor i voksne, forårsager omkring 14.000 dødsfald hvert år i USA alene. Median overlevelse efter diagnosen er mindre end 15 måneder med maksimal kirurgisk resektion, stråling og temozolomide kemoterapi. Udfordringer forbundet med at udvikle mere effektive GBM behandlinger er blevet stadig mere klart, og omfatter sin ubøjelige invasionsevne, dens modstand til standard behandlinger, dens genetiske kompleksitet og molekylære tilpasningsevne og delpopulationer af GBM celler med fænotypisk ligheder med normal stamceller, herefter omtalt som glioblastom stamceller (GSCs). Fordi GSCs er nødvendige for tumorvækst og progression, repræsenterer differentiering-baseret terapi en levedygtig behandling modalitet for disse uhelbredelig neoplasmer.

Følgende protokol beskriver en samling af procedurer til at etablere en high throughput screening platform med henblik på identifikation af små molekyler, der fremmer GSR astroglial differentiering. Kernen i systemet er en glial fibrillære sure protein (GFAP) differentiering reporter-konstruktion. Protokollen indeholder følgende generelle procedurer: (1) oprettelse af GSR differentiering reporter linjer; (2) test/validering reporter relevans for GSR self-fornyelse/clonogenic kapacitet; og (3) høj kapacitet flowcytometri baseret stof screening.

Screening platform giver en enkel og billig metode til at identificere små molekyler, der fremmer GSCs differentiering. Derudover rummer udnyttelse af biblioteker af FDA-godkendt medicin potentiale til identificering af agenser, der kan repurposed hurtigere. Også forventes terapier, der fremmer kræft stamceller differentiering at arbejde synergistisk med nuværende "standard of care" behandlingsformer, der har vist sig at målrette og fjerne primært mere differentierede kræftceller.

Introduction

Nylige undersøgelser har vist, at tumorer indeholder en lille population af celler, betegnes kræftstamceller (CSCs) eller tumor-indlede celler, som er ansvarlig for tumor progression, metastaser og modstand mod kemo - og radio-terapier 1, 2. tilstedeværelsen af kræftstamceller og deres mere differentieret descendenter inden for tumorer betragtes som en vigtig faktor at fremme intratumoral heterogenitet og udgør således en stor forhindring i behandling af kræft3. Tumor celle hierarki, leveret af kræft stamceller teori, har inspireret udviklingen af nye strategier til at behandle kræft 4. En metode for målretning af kræftstamceller er at identificere og hæmmer signaling veje, der er kendt for at være nødvendige under fosterudviklingen af det berørte organ. Faktisk, vi og andre har tidligere offentliggjort flere artikler beskriver den løbende krav om de stamcelle-relevante signaling nervebaner Sonic Hedgehog og hak i glioblastom5,6,7. Dette arbejde har hjulpet i solidifying begrundelsen for flere GBM kliniske forsøg. En anden tilgang til at målrette kræftstamceller er at fremme deres differentiering. Denne tilgang har modtaget megen støtte på grund af de gunstige resultater af prækliniske og kliniske undersøgelser i behandling af akut promyelocyt leukæmi med retinoid syre (ATRA, et vitamin-A analog). Her fandtes ATRA at fjerne modning blok og fremme kræft celle differentiering8. Mere nylig, Piccirillo og kolleger har elegant vist at BMP-4 fremmer GSR differentiering i astrocytter med betydelig anti-GBM virkninger i in vitro og i vivo9.

Begrundelsen for den nuværende undersøgelse er baseret på en "omvendt engineering" tilgang til at målrette GSCs. I betragtning af den enorme heterogenitet stede i GBM og med dårlig differentiering er et af kendetegnene ved kræft, spurgte vi hvis vi kunne fremme en mere gunstig fænotype - differentiering i en astrocyte-lignende tilstand. Vi har her, ikke forudgående kendskab til signalering veje at opretholde GSCs i en given tumor modellen men snarere har til formål at opnå en ønsket fænotype (fx GFAP positivitet).

Denne rapport beskriver de procedurer, der anvendes til at etablere GSR differentiering reporter-linjer fra transduktion af GSR-beriget kulturer til GSR klonavl. Glioblastom neurosphere linjer bruges blev etableret i laboratoriet af Professor Angelo Vescovi fra patienter med en diagnose af primær glioblastom på hospitalet San Raffaele - Milano, Italien. Disse linjer er blevet grundigt undersøgt i flere publikationer 6,10,11,12,13,14. Det anbefales, at personer, der er interesseret i at gennemføre disse teknikker i deres laboratorium afgøre relevansen af reporter at kræft stamceller selvfornyelse kapacitet i de celler, de planlægger at studere (dette er sandt for enhver journalist). En detaljeret protokol for en af de in vitro- clonogenic assays accepteret i feltet er fastsat til at udføre denne15,16. Endelig, en detaljeret protokol beskriver udnyttelse af differentiering reporter-linjer i et flowcytometri baseret stof skærmen er leveret i slutningen. Af note, ligeledes astroglial differentiering systemet beskrevet her, har vi med succes etableret og godkendt GSR reporter linjer integrere en MAP2:GFP (neuronal differentiering) reporter. Derfor, metoderne, der beskrives i dette papir kan anvendes til at studere Celledifferentiering i forskellige celle lineages.

Nogle af tallene i denne rapport kan findes i en nylig publikation: "Atracurium Besylate og andre neuromuskulære blokerende agenter fremme astroglial differentiering og nedbryder glioblastom stamceller18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Astroglial og neuronal lentivirus reporter systemer blev købt som færdigpakkede, koncentreret lentiviral præparater. Grundlæggende kendskab til flow flowcytometri teknik er påkrævet. Også, en fuld anvendelse af denne protokol brugeren vil have adgang til et flow Flowcytometret med høj kapacitet (accepterer 96-brønd plader som eksempelkilden).

1. lentiviral Transcriptional Reporter System

Bemærk: I alle flow cytometric analyser, bruge forældrekontrol, ikke-transduced, celler eller vektor-transduced (ikke-fluorescerende) celler for fastsættelse af baseline fluorescens. Også, Bemærk, at i alle trin, hvor mekanisk ændring kaldes for, være blid. Barske ændring kan dræbe et betydeligt antal af de skrøbelige GSCs og påvirke flow flowcytometri resultater.

  1. Plade 1 x 106 celler med 2 mL komplet neurale stamceller vækstmediet i en 6-flerhuls plade.
  2. Transduce celler ved at tilføje lentivirus reporter på en mangfoldighed af infektion (moi) lig med 5.
  3. Tilføj 2 µL af polybrene til en endelig koncentration på 8 µg/mL.
  4. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
  5. Den næste dag, erstatte vækstmedium for at fjerne ubundne virus. Pladen anbringes tilbage i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 og inkuberes i 24 timer.
  6. Høst 0,5 mL af den samlede mængde; spin ned celler på 360 x g i 5 min ved stuetemperatur i en 15 mL konisk slange og Fjern supernatanten ved aspiration. Tilsættes 0,5 mL frisk neurale stamceller vækstmediet til de resterende celler og returnere pladen til rugemaskine for fortsatte ekspansion.
  7. Tilføje 200 µL af dissociation reagens og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
  8. Adskille celler af pipettering forsigtigt op og ned.
    Bemærk: Barske ændring kan resultere i betydelige drab af GSCs, komplet dissociation opnås normalt efter 20 - 30 gange.
  9. For at minimere celle vedhæftet fil eller sammenlægning, tilføje 800 µL af Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) for en endelige mængden af 1 mL.
  10. Overføre 200 µL af hver cellesuspension til et godt af en 96-flerhuls plade.
  11. I denne procedure, skal du bruge en benchtop flow Flowcytometret med 96 brønde plade kapacitet udstyret med en blå laser for excitation og evnen til at opdage grøn fluorescerende proteiner. Udføre analyse af handelsstrømmen cytometric med mindst 10.000 levedygtige celler for hver anskaffelse.
  12. Bestemme procentdelen af normal god landbrugspraksis-positive celler ved flowcytometri.

2. subclone udvalg, ekspansion og validering

  1. Plade celler i 100 µL af neurale stamceller medium med en tæthed på 0,7 celler pr. brønd af en 96-flerhuls plade.
  2. Kultur kloner i 11 dage ved 37 ° C og 5% CO2. Dette trin er meget celletype afhængige og vil sandsynligvis kræve en justering, der er baseret på den cellelinje bruges. Som en generel regel er en kugle diameter ≥ 100 µm en god indikation af tilstedeværelsen af clonogenic GSCs i neurospheres.
  3. Ved hjælp af en fluorescerende mikroskop udstyret med en FITC-filteret, markere de brønde, der indeholder en enkelt neurosphere hvor ~ 1-5% af cellerne er normal god landbrugspraksis-positive.
    Bemærk: At fastlægge den nøjagtige procentsats af normal god landbrugspraksis-positive celler ikke er alt for kritiske på dette punkt. Hver af subclones vil senere blive evalueret ved flowcytometri. Dette trin er udført for at reducere samlet udifferentierede. antallet af kloner skal analyseres med fokus på neurospheres, der stammer af, GFAP-negative, GSR.
  4. Udvid valgte reporter kloner, indtil der er et tilstrækkeligt antal celler analyseres ved flowcytometri. En sub sammenflydende godt af en 6-flerhuls plade der indeholder ≤ 1.5x105 celler/mL bør give et tilstrækkeligt antal celler.
    Bemærk: En detaljeret procedure for isolation og udvidelse af GSCs er tilgængelige 17.

3. bestemmelse af GFAP:GFP udtryk ved flowcytometri

  1. Høste en alikvot af celler (0,5 mL) fra hver reporter klon og ikke transduced kontrolelementer til at bestemme den nøjagtige procentsats af normal god landbrugspraksis-positive celler. Overvejer reporter kloner, der indeholder ~ 1-5% normal god landbrugspraksis-positive celler.
  2. Spin celler på 360 x g i 5 min ved stuetemperatur og Fjern supernatanten ved aspiration.
  3. Hver pellet, tilføje 200 µL af celle dissociation reagens og inkuberes rør i vandbad indstillet på 37 ° C.
  4. Hakkede celler forsigtigt for at opnå en enkelt cellesuspension (normalt mellem 20 til 30 gange).
  5. For at minimere celle vedhæftet fil eller sammenlægning, tilføje 800 µL HBSS til en endelige mængden af 1 mL.
  6. Overføre 200 µL pr. brønd af en 96-flerhuls plade fra hver cellesuspension.
  7. I denne procedure, skal du bruge en benchtop flow forskellige med 96 brønde plade kapacitet. Udføre analyse af handelsstrømmen cytometric med mindst 10.000 levedygtige celler for hver anskaffelse.

4. ELDA selvfornyelse analyse til at vurdere Clonogenic kapacitet

Bemærk: For kontrol, både forældre, ikke-transduced, såvel som udtryk for normal god landbrugspraksis lentivirus-transduced celler, bør anvendes til at bestemme relative clonogenic potentialet for GSR differentiering reporter linjer til de oprindelige GSR kulturer, som de var afledt.

  1. Adskille differentiering-reporter subclones i én celle suspensioner, som beskrevet ovenfor.
  2. Plade celler i 96-flerhuls plader i 100 µL af komplet neurale stamceller vækst medier på celle tætheder spænder mellem 5 og 500 celler pr. brønd.
  3. Inkuber celler i 9 til 11 dage ved 37 ° C og 5% CO2.
  4. Score positivt brønde ved direkte visualisering af neurospheres under et lysmikroskop. En brønd bør betragtes som "positive", hvis den indeholder mindst en enkelt stor neurosphere.
  5. Sæt data: total wells analyseret og antallet af positive brønde ved hjælp af ELDA online interface tilgængelige på http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. medicin bibliotek fortynding forberedelse

  1. Fjerne biblioteket plader fra opbevaring ved-80 ° C, dække med alufolie (beskytte lysfølsomme forbindelser). Tø i ca 30 min til en time ved stuetemperatur.
  2. Bruge en 12-kanals mulitkanalpipette for at udvande bibliotek forbindelser til 0,2 mM i komplet neurale stamceller medium. Fortyndes DMSO til 10% i vækstmediet
    NOTE: Den endelige koncentration af DMSO bør være 0,1% når føjet til celler. En højere koncentration af DMSO i kultur kan resultere i toksicitet. Af denne grund anbefales det at teste følsomhed over for DMSO i den cellelinie, brugt, før behandling.
  3. Bruge DMSO som køretøjet kontrol til at behandle celler findes i de venstre og højre kolonner af hver tallerken (kolonne 1 og 12; Brønde A til H).
  4. Dække de fortyndede bibliotek plader med aluminiumsfolie og returnere de originale bibliotek plader til-80 ° C fryser til langtidsopbevaring.

6. stof skærmen

Bemærk: DMSO-behandlede celler skal bruges til at indstille baseline fluorescens og justere gating.

  1. Plade 5 x 103 celler i en 96-flerhuls plade i 99 µL af komplet neurale stamceller vækstmediet.
  2. Ved hjælp af en 12-kanals mulitkanalpipette, behandling af celler med fortyndet bibliotek forbindelser i en endelig koncentration på 2 µM (1 µL af 0,2 mM stof til 99 µL af cellesuspension) eller med DMSO (kontrol). Inkuber plader i 72 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Ved hjælp af en 12-kanals mulitkanalpipette Tilsæt 150 µL af celle dissociation reagens til hver brønd og Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
  4. Adskille celler af forsigtigt triturating med en 12-kanals mulitkanalpipette indtil enkelt cellesuspension er opnået (normalt mellem 20 til 30 gange). Mængden tid, der kræves for at adskille neurospheres helt vil variere mellem GSR linjer. Mens anbefalede celle dissociation reagens (Se materialer) er sikker og inkubation i op til 45 minutter havde ingen effekt på levedygtighed i flere GSR linjer testet, kontroller for hver GSR linje skal anvendes ved screening.
    NOTE: Den endelige mængden i hver godt skal være ca 250 µL (100 µL af cellesuspension + 150 µL af celle dissociation reagens).
  5. Bestemme procentdelen af celler, der udtrykker GFAP:GFP reporter ved flowcytometri. Brug standard gating strategi. Først, plot frem og side scatter-symboler for at få en generel fornemmelse af Cellestørrelse og levedygtighed. Derefter placere en port på befolkningens levedygtig én celle. Det er befolkningen, grønne fluorescens (eGFP) vil bestemmes. Alle sammensatte at resulterer i en stigning i andelen af normal god landbrugspraksis-positive celler af mere end tre standardafvigelser over kontrol (DMSO-behandlet) betragtes som en positiv "hit." Denne tærskel bør tilpasses den konkrete anvendelse og den ønskede strenghed.
    Bemærk: For den høje overførselshastighed skærmen anbefales ved hjælp af en enkelt GSR reporter subclone. Efter hit identifikation, skal hver hit valideres mod yderligere reporter subclones fra samme GSR linje. For at øge tilliden til sande hits er også anbefale afprøvning forbindelser mod reporter subclones isoleret fra forskellige GSR neurospheres linjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre uafhængige patient-afledte neurospheres linjer var transduced med lentivirus astroglial journalist kodning for et grønt-fluorescerende proteiner (NGL) smeltet i-frame med en Zeocin modstand kassette og drevet af den menneskelige GFAP promotor element ( Figur 1). Næste enkelte kloner var isoleret ved plettering 0,7 celler pr. brønd i en 96 godt plade (figur 2), dette blev efterfulgt af flow cytometric bestemmelse af procentdelen af celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis (figur 3). Neurosphere kloner, afledt af enkelt celler, der indeholder ≤5% normal god landbrugspraksis-positive celler omtales som GL (GFAP lav) mens kloner med ≥75% normal god landbrugspraksis positive celler er benævnt GH (GFAP høj) og anses for at være mere differentieret i forhold til GL subclones (figur 4).

For at identificere agenter og veje, som kan styre astroglial differentiering i GSCs, blev en små-molekyle stof skærmen ved hjælp af to NIH kliniske samling biblioteker udført. Celler blev behandlet til 72 timer med 727 bibliotek agenter fra samlingen NIH kliniske I og II, indstillet til en koncentration på 2 µM eller et lige saa stort volumen af DMSO som kontrol. Effekten af disse stoffer blev testet på cellernes levedygtighed i alle vores patient-afledte GBM neurosphere linjer ved koncentrationer spænder fra 0,2 µM til 20 µM, før narkotika-screening. Koncentration anvendt i denne protokol tillod os at identificere forbindelser, der var i stand til at fremkalde astroglial differentiering og på samme tid, det minimeret potentielt mål toksiske virkninger på grund af højere drug koncentrationer.

Efter inkubation fastsat vi procentdel af celler, der udtrykker GFAP-normal god landbrugspraksis reporter ved flowcytometri. Referencescenariet for levedygtighed og procentdel af normal god landbrugspraksis-positive celler blev bestemt i mindst tre brønde for hver bibliotek plade, og en positiv hit blev fastsat som en stigning i andelen af normal god landbrugspraksis-positive celler af tre standardafvigelser over baseline (DMSO) og en minimumstærskel på 25% normal god landbrugspraksis positive celler. Vi identificeret 12 narkotika, som inducerede tilstrækkelig stigning i befolkningens normal god landbrugspraksis-positive (tabel 1).

Figure 1
Figur 1: Astroglial differentiering Reporter System.
Skematisk diagram over pGreenZeo GFAP:GFP reporter. GSCs udtrykke ikke den passende kombination af transkriptionsfaktorer nødvendigt at aktivere glial fibrillære sure protein (GFAP) promotor og derfor giver ikke udtryk for normal god landbrugspraksis (toppanelet). Men når de passende transkriptionsfaktorer er til stede (f.eks. når celler erhverve en astroglial skæbne - differentiere) GFAP promotor bliver aktivt, og cellerne vil give udtryk for normal god landbrugspraksis reporter (nederste panel). (GSR - gliom stamceller, T2A-protein linker, Zeo-R - Zeocin resistens gen, TF - transskription faktor). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Astroglial differentiering - Subclone udvalg.
Repræsentative billeder af HSR-GBM1 GSR subclones udtryk for lavt (GL) eller høje (GH) af GFAP:GFP reporter ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (40 X forstørrelse er vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Flowcytometri til bestemmelse af grønne fluorescens.
HSR-GBM1 patient-afledte neurosphere linje blev transduced med GFAP:GFP reporter lentivirus og flere subclones blev udvalgt baseret på normal god landbrugspraksis udtryk i neurosphere indledning-cellen og bekræftet ved flowcytometri. Disse kloner var opkaldt enten GL (GFAP lav) eller GH (GFAP høj). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Funktionel karakterisering af HSR-GBM1 GFAP:GFP subclones.
GL subclones er mere clonogenic in vitro- som anført af øget GSR frekvenser, der er målt ved ekstreme begrænse fortynding analyse (ELDA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navn Fold stigning i normal god landbrugspraksis + celler Beskrivelse Blod-hjerne barrieren Drug Bank sandsynlighed
Vinorelbin 8,97 Anti-mitotiske kemoterapi - 0,88
Diphenoxylate 13.89 Antidiarrheal + 0,96
Lomerizine 10,89 Calcium kanal blokker / Cerebral vasodilatator NA NA
Phenprobamate 10,73 Angstdæmpende / muskel muskelafslappende, centralt handler NA NA
6-Azauridine 15.07 Antimetabolit / Antiviral NA NA
Irinotecan 14.14 Topisomerase jeg hæmmer + 0,63
Atracurium Besylate 8.16 Nondepolarizing skeletmuskulatur afslappende + 0,93
Glimepirid 8,75 Antidiabetic + 0,73
Hexachlorophen 9.83 Antiseptisk + 0,92
Digoxin 8.23 Cardiotonic glycosid - 0.72
Flecainid 10 Anti-arytmi agent + 0,86
Nisoldipine 5,05 Calcium kanal blokker - 0,95

Tabel 1: Små molekyler inducerende GFAP-normal god landbrugspraksis reporter udtryk i HSR-GBM1 GL-1
Tolv forbindelser blev fundet for at øge procentdelen af normal god landbrugspraksis-udtrykker celler betydeligt (fold stigning er vist) og mødte de strenge kriterier for ≥3 standardafvigelser over grundlinjen, DMSO-behandlede celler, og med ikke mindre end 25% normal god landbrugspraksis-positive celler. Evne og sandsynligheden af en given agens at krydse blod-hjerne barrieren (Drug Bank (−). Forkortelse: NA (oplysninger ikke er tilgængelige).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens de fleste af de tidligere undersøgelser af GSCs fokuseret primært på markører, der definerer dem, i denne undersøgelse besluttede vi at tage den omvendte fremgangsmåde. Vi fokuserer primært på de differentierede descendenter genereret af GSCs (fx celler udtrykker astroglial og neuronal markører). Her viser vi udnyttelse af en celle-baserede høj overførselshastighed stof screening system, der er baseret på menneskelige GFAP promotor-afhængige udtryk for normal god landbrugspraksis. Alle eksperimenterne blev udført udnytte patient-afledte neurosphere glioblastom cellelinjer. En detaljeret protokol beskriver den isolation og udvidelse af disse linjer er beskrevet i Galli al.17.

Systemet ikke kun hjulpet os i identifikation af små molekyler, som er i stand til at inducere cellulære differentiering af GSCs, men også hjulpet os med at bestemme utvetydigt, at udtryk for astroglial differentiering markør GFAP bestemmer den clonogenic kapacitet af individuelle GBM celler ved at sammenligne GSR frekvenser. ELDA analysen blev udviklet af Yifang Hu og Gordon K. Smyth. Læserne opfordres til at læse manuskriptet til en dybtgående forståelse af assay styrker og begrænsninger15. Koloni dannelsen scoring skridt er meget celletype afhængige og vil sandsynligvis kræve en justering, der er baseret på den cellelinje bruges. Desuden som hovedregel bruger vi kugle diameter ≥100 µm som en god indikation af, at neurosphere var stammer fra en clonogenic GSR.

Derudover stof screening system vi beskrive her giver mulighed for identifikation af nye veje (specielt acetylcholin og calcium transport), der kræves for at opretholde GSCs i udifferentierede staten (se tabel 1). Start drug koncentrationen kan variere baseret på linjen bibliotek og celle udnyttet. Også, skal den nødvendige tid til Celledifferentiering muligvis justering. Derudover kræver tumorfremkaldende validering af narkotika hits en i vivo tumor indledning assay 18.

Potentielt er en mindre begrænsning af denne teknik at spontane differentiering uundgåeligt opstår i en stamcelle-beriget kultur, og dette fænomen tendens til at stige med antallet af passager i kultur og varierer mellem de enkelte subclones. Ja, vi observeret spontan differentiering i vores subclones generelt efter passage 15. Derfor, vi begrænset vores differentiering analyser til kulturer på passage tal højst fem.

Derfor, måske det mest kritiske punkt i denne metode er at holde in vitro-passaging af disse GSCs til et minimum og når du arbejder i vitro, at bevare kultur tæthed under 1.5x105 celler/mL. Derudover anbefales det, at hver enkelt drug "hit" valideres mod yderligere reporter subclones fra linjen samme GSR, samt mod reporter subclones isoleret fra forskellige patient-afledte GSR neurospheres linjer. Dette vil øge den tillid, som en ægte "hit" er ved hånden.

Alsidigheden i den metode, der beskrives i denne robust protokol styrker den terapeutiske værdi af en narkotika-induceret kræft stamceller differentiering og bør hjælpe med at identificere nye stoffer som potentiel roman terapeutiske strategier for GBM og andre tumorer. Endelig kan analysen være optimeret til at bruges med ikke-neoplastiske neurale stamceller, andre kræft typer, og med forskellige differentiering journalister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet delvist understøttet af NIH R01CA187780.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESGRO Complete Accutase EMD Millipore SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Sigma Aldrich H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) SBI (System Biosciences) SR10015VA-1
50 ml sterile disposable reagent reservoirs Corning 4870
6 well plate Thermo Fisher Scientific 130184
96 well plate Falcon 353072
Biolite T25 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130189
Biolite T75 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130190
15 ml Centrifuge tubes Celltreat 229411
1.5ml Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL VistaLab Technologies 1060-0020
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL VistaLab Technologies 1060-0250
Multi 12-channel pipette tips 25 μl VistaLab Technologies 4060-1002
Multi 12-channel pipette tips 250 μl VistaLab Technologies 4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer EMD Millipore 0500-4005
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries Evotec
Name Company Catalog Number Comments
For the preparation of neural stem cell media (500 mL) Final concentration
BSA GoldBio.com A-421-250 0.20%
DMEM/F12 10X Corning 90-091-PB 1X
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3149 0.0002%
HEPES 1M Sigma Aldrich H4036 5.4 mM
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) Life Technologies 41400-045 1X
NaHCO3 Sigma Aldrich S-5761 14.5 mM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X Gibco 15140-122 1X
Progesterone Sigma Aldrich P8783 16 nM
Putrescine Sigma Aldrich P5780 4.8 µM
Basic FGF (FGF2), Human GoldBio 1140-02-50 10 ng/ml
EGF, Human GoldBio 1150-04-100 20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind Corning 431160 Use to filter sterlize media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71, (12), 4055-4060 (2011).
  3. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, (7120), 756-760 (2006).
  4. Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77, (6), 655-666 (2010).
  5. Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170, (1), 347-355 (2007).
  6. Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19, (12), 3224-3233 (2013).
  7. Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16, (24), 6060-6070 (2010).
  8. Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324, (20), 1385-1393 (1991).
  9. Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, (7120), 761-765 (2006).
  10. Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, (10), 2524-2533 (2007).
  11. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177, (3), 1491-1502 (2010).
  12. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50, (4), 357-368 (2012).
  13. Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33, (35), 4433-4441 (2014).
  14. Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25, (6), 724-732 (2014).
  15. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347, (1-2), 70-78 (2009).
  16. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), 851-856 (2015).
  17. Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, (19), 7011-7021 (2004).
  18. Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7, (1), 459-472 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics