Metoder til at analysere virkningerne af naturligt uran på In vitro- Osteoclastogenesis

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Uran er kendt for at påvirke ben stofskifte. Vi præsenterer her, en protokol med henblik på at undersøge effekten af naturligt uran eksponering på levedygtighed, differentiering og funktionen af osteoklaster, celler ansvarlig for knogleresorption.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uran har vist sig at blande sig med knogle fysiologi og det er velkendt, at denne metal ophobes i knogler. Dog er lidt kendt om effekten af naturligt uran på opførsel af knogleceller. Især er virkningen af uran på osteoklaster, de celler, der er ansvarlig for resorption af knoglematrix, ikke dokumenteret. For at undersøge dette spørgsmål, har vi etableret en ny protokol bruger uranyl acetat som en kilde til naturligt uran og RAW 264.7 murine cellelinie som en model af osteoklast prækursorer. Heri, detaljerede vi alle assays til at teste uran cytotoksicitet på osteoklast prækursorer og til at vurdere dens indvirkning på osteoclastogenesis og den resorbing funktion af modne osteoklaster. Betingelserne, vi har udviklet, navnlig forberedelsen af uranyl-holdige dyrkningsmedier og for såning af RAW 264.7 celler tillade for at opnå pålidelig og yderst reproduktive resultater. Derudover har vi optimeret brug af softwareværktøjer til at lette analysen af forskellige parametre som størrelsen af osteoklasterne eller procentdelen af resorberet matrix.

Introduction

Uran er en naturligt forekommende radioaktivt element findes i jord, luft og vand; som sådan, er dyr og mennesker udsat for naturligt uran i deres kost. Ud over naturlige kilder stammer uran fra menneskeskabte aktiviteter, som øger sin overflod i miljøet. Uran udgør både kemiske og radiologiske farer. Men fordi naturligt uran, (som er en isotopisk blanding indeholdende 99.27% 238U, 0,72% 235U og 0,006% 234U) har en lav specifik aktivitet (25.103 Bq.g-1), dens virkninger på sundhed tilskrives dens kemiske toksicitet.

Uanset hvad dens indfaldsvej (indånding, indtagelse eller dermal eksponering), de fleste af uran ind i kroppen er elimineret med afføring og kun en lille del når systemisk cirkulationen. Ca. 67% af uran i blodet filtreres igen af nyrer og forlader kroppen i urinen inden for 24 h1. Resten er for det meste deponeres i nyrer og knogler, de to vigtigste målorganer uran toksicitet2,3,4. Fordi skelettet er blevet identificeret som den primære lokalitet af uran langsigtede fastholdelse2,3,4,5,6, flere undersøgelser er blevet gennemført for at udforske den effekt af uran på knogle fysiologi7.

Bone er en mineraliseret væv, der er løbende ombygget i hele dens levetid. Knogle remodellering er en kompleks proces, der afhænger af specialiserede celletyper og består hovedsageligt af to faser: resorption af de allerede eksisterende gamle matrix af osteoklasterne efterfulgt af de novo knogle konstruktion af osteoblaster. Osteoklaster er store multinuclear celler som følge af en sammenlægning af forløber celler hæmatopoietisk oprindelsesregler, migrere til resorption steder hvor de tillægger knogle8. Deres tilknytning opstår samtidigt med en omfattende omorganisering af deres cytoskeleton9. Denne omlægning er nødvendig for oprettelsen af en isoleret rum mellem cellen og knoglen overfladen hvor osteoklast udskiller protoner, fører til opløsning af hydroxyapatit og proteaser involveret i nedbrydningen af den organiske matrix. De resulterende nedbrydningsprodukter er endocytosed, transporteres gennem celle til området membran over knoglen overfladen og udskilles, en proces kaldet transcytosis10,11.

Resultater fra i vivo og in vitro- undersøgelser viser, at uran hæmmer knogledannelse og ændrer antallet og aktivitet af osteoblaster7,12. Derimod har effekter af uran på knogleresorption og osteoklaster været dårligt udforskede. Flere i vivo undersøgelser har rapporteret en forøgelse af knogleresorption efter administration af uranyl nitrat til mus eller rotter13,14. Derudover foreslog en epidemiologisk undersøgelse, at stigningen i uran indtag via drikkevand tendens til at være forbundet med en stigning i serum niveau af en knogle resorption markør i mænd15. Taget sammen, disse resultater førte til den konklusion, at uran, som ophobes i knogler kunne fremme knogleresorption. De cellulære mekanismer involveret i denne potentielle effekt af uran er dog stadig et åbent spørgsmål. Derfor besluttede vi at undersøge virkningen af uran på opførsel af resorbing knogleceller.

Her, vi beskrive den protokol, vi har etableret at karakterisere og kvantificere effekterne af naturligt uran på pre osteoklaster levedygtighed og osteoklaster differentiering og resorptive aktivitet. Eksperimenter beskrevet heri har gjort med den RAW 264.7 murine transformerede makrofag cellelinie, som let kan differentiere i osteoklaster når kulturperler i overværelse af cytokin RANKL for 4 eller 5 dage, og som er klassisk bruges til at undersøge osteoklast differentiering og funktion16. Udviklet fremgangsmåder er pålidelige, giver meget reproducerbare resultater og er fuldt ud gældende for primære osteoklaster. Alle disse grunde mener vi, at denne metode er nyttig for at få en bedre forståelse af de molekylære mekanismer involveret i uran toksicitet i knoglen. Vi mener desuden, at denne tilgang kunne tilpasses som en screeningsværktøj til at identificere nye uran chelatdannere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af Uranyl acetat løsning

  1. For at forberede 2 mL af en 100 mM uranyl acetat løsning, tilføje 85 mg af uranyl acetat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) fast form til et 5 mL plastikrør.
  2. Der tilsættes 2 mL destilleret vand til den plastikrør og passe det med en plastic prop.
  3. Rystes glasset kraftigt indtil den totale opløsning af fast. Lægge opløsningen i køleskab i 24 timer.
    Forsigtig: Manipulation af uranyl [U(VI)] præsenterer nogle kemiske og radiologiske farer. Alle prøver skal forberedes og karakteriseret med ad hoc-udstyr i særlige laboratorier. Alle U VI-holdige væsker bør indsamles i specifikt tildelte affaldscontainere og bortskaffes som giftig affald. Tørt affald (pipets, rør, osv.) kan vaskes med 0,1 N HNO3 løsning, som vil solubilize og fjerne U(VI).
  4. Kontrollere pH af løsningen ved hjælp af en mikroelektrode og et pH-meter.
    Bemærk: Mikroelektrode bør tidligere kalibreres ved hjælp af kommerciel buffer løsninger (pH = 4 og pH = 7).

2. RAW 264.7 cellekultur

  1. Vedligeholdelse af celler.
    1. Dyrke RAW 264.7 celler (ATCC, TIB-71) i 75 cm2 flasker i følgende vækstmediet: Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 5% føtal bovint Serum og antibiotika: 100 IE/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin. Vedligeholde celler i varmeskab ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. Ændre medium hver 2-3 dage. Når cellerne er 85-90% sammenflydende, mekanisk fjerne dem fra kultur kolben ved hjælp af en celle skraber (som anbefalet af ATCC) og opdele dem i forholdet 1:6.
      Bemærk: kun celler mellem passager 3-10 anvendes til differentiering eksperimenter.
  2. Forberedelse af celler for eksperimenter
    1. Løsne celler fra kolben substrat som beskrevet ovenfor og overføre dem til en steril 50 mL tube. Bland celler af pipettering op og ned for at bryde op klumper. Tælle dem med en hemocytometer. Forvent 35-40 millioner celler pr. 75 cm2 kolbe.
    2. Beregn volumen af celler suspension nødvendigt for hver enkelt eksperiment som følger:
      Antallet af eksperimentelle betingelser x 3 (tre) x 1 mL/brønd + 3-4 mL (pipettering tab).
      Bemærk: Såning tæthed for alle assays beskrevet i denne protokol er 5.000 celle/cm2. Derfor, for en 24-godt plade, det betyder 10.000 celler pr. brønd i 1 mL medium, og celle suspendering massefylden er således 10.000 celler/mL.
    3. Forberede nødvendige volumen af 10.000 celler/mL cellesuspension og seed cellerne i 24-godt plader. Cytotoksicitet assays, bruge normale vækstmediet. For differentiering og resorption assays, brug alpha ændret Minimum afgørende Medium (αMEM) suppleret med 2 mM L-glutamin, 5% FBS og 50 ng/mL af GST-RANKL17.
      Bemærk: GST-RANKL protein produceret internt kan erstattes af enhver kommercielt tilgængelige RANKL cytokin. Når du arbejder med et nyt RANKL parti, kan det være nyttigt at teste dens effektivitet i overtalelse osteoclastogenesis ved at udføre en dosis svar eksperiment med RANKL koncentrationen svinger fra 20 til 150 ng/mL.

3. fortynding af 100 mM Uranyl acetat løsning i dyrkningsmediet

Bemærk: Uranyl ioner [U(VI)] i dyrkningsmediet danner flere komplekser med andre mellemstore komponenter, der kan ændre dets cellulære toksicitet18,19,20,21. Derfor bør uranyl-holdige medier forberedes dyrlægeordination uden at udelade eller forkorte ækvilibrering trin.

  1. Valgte uranyl eksponering koncentrationer og beregner mængder af kultur medier kræves for eksperimentet (under hensyntagen til at hver tilstand er udført i tre eksemplarer).
  2. Startende fra sterile cellekultur testet 7,5% natriumbikarbonat vandig opløsning ([HCO3-] = 893 mM), forberede en 100 mM HCO3- opløsning i vand og afkøles det på is.
  3. Tilføje dråbe for dråbe 1 volumen af uranyl acetat 100 mM stamopløsning til 9 bind af iskold 100 mM HCO3- løsning, forsigtigt ryste blanding røret. Denne handling vil udvande uranyl acetat stamopløsning ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) til 10 mM og bringe pH til omkring 7.
  4. Tilføje 1 volumen af sterilt vand til 9 bind af iskold 100 mM HCO3- løsning at nå 90 mM HCO3- (svarende til HCO3- koncentration i opløsningen 10 mM uranyl), som vil tjene til at forberede kontrol medium.
  5. Tillad parate løsninger til at stå i 3 timer ved stuetemperatur (RT) for ækvilibrering.
  6. I mellemtiden forbereder grundlæggende eksponering medium: αMEM med 2 mM L-glutamin og 5% FBS.
    Bemærk: For differentiering og resorption assays, tilføje 50 ng/mL af GST-RANKL til grundlæggende eksponering medium.
  7. Efter 3 h, fortyndes passende beløb af 10 mM uranyl løsning dråbevis i eksponering medium for at opnå den ønskede uranyl arbejder koncentrationer. Forberede samtidig kontrol medium ved at sammenlægge mængden af bikarbonat bruges i den mest koncentrerede uranyl-behandlede betingelse, at eksponering medium.
  8. Tillad rede medierne til at stå for 3 h på RT for ækvilibrering.
  9. Fjern vækst medier fra brøndene og erstatte det med kontrollen og den uranyl-holdige medier.

4. analyse af RAW 264.7 prækursorer levedygtighed i overværelse af U(VI) (MTT cytotoksiske Assays)

Forsigtig: Både MTT og DMSO kunne forårsage hud og øjenirritation. Bære handsker og øjenværn, når du håndterer dem. Indsamle affald produkter i specifikt tildelte affaldscontainere.

  1. Opløses en passende mængde 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) pulver i PBS til at opnå en 10 x stamopløsning på 5 mg/mL. Sterilisere det ved filtrering med en 0,22 µm filter og gemme alikvoter ved-20 ° C.
  2. Plade celler på 24-godt plader (3 boringer pr. eksperimentelle betingelse pr. plade). Glem ikke at reserve 3 tomme wells pr. plade for spektrofotometrets blanks.
  3. Inkuber celler ved 37 ° C i 22-24 timer før uran eksponering at lade celler vedhæfte.
  4. Forberede uranyl-holdige medier som beskrevet i afsnit 3.
  5. Erstatte vækstmediet i celle-seedede pladerne med uranyl-holdige medier. Der inkuberes i 24 timer.
  6. Beregn den nødvendige mængde 1 x MTT løsning som følger:
    (Række forsøgsbetingelser + blank) x 3 (tre) x 0,4 mL/brønd + 10% vol. for pipettering tab.
  7. Forbered den nødvendige volumen af 1 x MTT løsning ved at fortynde 10 x MTT stamopløsning i Eagle's Minimum afgørende Medium (Maibritt VITH) uden phenol rød.
    Bemærk: For en vellykket kolorimetriske assay, MTT skal beskyttes mod lys. Det anbefales at fortynde MTT i Maibritt VITH i stedet DMEM for at begrænse baggrund signal.
  8. Fjern uranyl-holdige medier fra brøndene, vaske dem med PBS og tilføje 400 µL af MTT løsning til hver brønd (herunder 3 tomme brønde til blindprøver). Inkuber 2,5 timer ved 37 ° C i mørke. Kontroller under mikroskop, mørk lilla formazankoncentrationen krystaller har dannet inde levedygtige celler.
  9. Kassér MTT løsning og tilføje 220 µL af dimethylsulfoxid (DMSO) pr. brønd. Wrap plader i aluminiumsfolie til at beskytte dem mod lyset og forsigtigt agitere for 10 min til at opløse formazankoncentrationen krystaller.
  10. Bruge en mikrotiterplade spektrometer læseren til at bestemme det optisk densitet (OD) ved 570 nm (formazankoncentrationen specifikke) og 690 nm (baggrund). Til hver brønd, subtrahere 690 nm OD fra 570 nm OD at justere for mulige ikke-specifikke OD værdi udsving på grund af ridser eller turbiditet22.
  11. Beregne den blank-rettet OD for hver brønd ved at fratrække gennemsnitlig OD af Tom fra OD opnået i det forrige trin. Bestemme gennemsnitlige OD-værdi for hver eksperimentelle betingelse.
  12. Indstille gennemsnitlig OD af kontrol tilstand ([UO22 +] = 0 mM) til 100% levedygtighed og beregne den tilsvarende andel af cellernes levedygtighed for andre testet uranyl koncentrationer. Afbilde en dosis-respons kurve. Evaluering af cytotoksicitet indeks 50 (CI50), defineret som uranyl fusionen fører til 50% celledød efter 24 timers eksponering.

5. analyse af osteoklast differentiering i overværelse af U(VI)

  1. Differentiering af RAW 264.7 celler uranyl og TRAP (tartrat-resistente sur fosfatase) farvning.
    1. Plade RAW 264.7 celler på en 24-godt plade, 3 boringer pr. eksperimentelle tilstand. Der inkuberes ved 37 ° C i ca. 6 h, tid til at forberede og reagensglasset uranyl-holdige eksponering medier.
    2. Forberede differentiering medier med ønskede uranyl koncentrationer som beskrevet i afsnit 3 (ikke Glem at tilføje GST-RANKL til media).
    3. Forsigtigt erstatte grundlæggende medium i brønde med uranyl-holdige medium. I dag betragtes som dag 0 for osteoclastic differentiering.
    4. Ændre mediet på dag 2 eller 3 i osteoclastic differentiering ved at gentage trin 5.1.2 og 5.1.3. Multinucleated osteoklaster skal vises mellem dag 3 og 4.
    5. Udføre TRAP farvning med kommercielt tilgængelige leukocyt sur fosfatase kit efter fabrikantens anvisninger.
      Bemærk: tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) også kaldet sur fosfatase 5, tartrat resistente (ACP5) er stærkt udtrykt i modne osteoklasterne og flittigt brugt som markør for osteoklast differentiering. Derfor, FÆLDE farvning er udført for at visualisere osteoklaster. Eksperimentelle forhold og hastigheden af osteoclastogenesis, kunne det gøres på dag 4 eller dagen 5 forløb differentiering.
    6. Holde TRAP-stained brønde i PBS ved 4 ° C for yderligere analyse (de kan opretholdes i disse vilkår op til 3 eller 4 uger).
  2. Osteoklast størrelse/morfologi analyse.
    1. Tilegne sig et billede af hele overfladen af hver brønd. Opløsningen af billedet skal være tilstrækkelige til at skelne cellekerner. Overveje TRAP-positive celler med 3 eller flere kerner, som osteoklaster.
    2. Åbne et billede af en brønd i ImageJ software: "File" → "Open".
    3. Kontrollere skalaenheder i øverste venstre hjørne af billedet. For den relative kvantificering, kan enhver enhed bruges. Hvis den absolutte værdi af osteoklast størrelse er nødvendige, konvertere skalaenheder til µm: "Image" → "egenskaber". Indskrive den boks "globale" i pop-up vinduet for at få nye skalaenheder anvendes til alle billeder åbnes senere.
      Bemærk: Hvis et mikroskop blev brugt til billede erhvervelse, pixelstørrelse i µm er angivet for hvert mål i den billedbehandlingsprogrammer.
    4. Angive måling parametre skal analyseres: "Analysere" → "sæt målinger". I vinduet sæt målinger indskrive "Område" og "Visningsetiket" bokse og uncheck alle andre bokse.
    5. Åbn ROI (region af interesse) manager: "Analysere" → "funktioner" → "ROI Manager".
    6. I hovedvinduet, Vælg den rektangulære markeringsværktøj. Brug det overalt i billedet til at skitsere en sektor af omkring 1.000 x 1.000 µm. Dette valg nu definerer den første region i hvilke osteoklast størrelse vil blive analyseret.
    7. I vinduet ROI Manager skal du klikke på "Tilføj" knappen for at tilføje denne region af interesse til ROI manager og Gem det ved at klikke på "Mere" → "Gem". Den gemte ROI kan nu genindlæses til ROI manager når som helst ved at klikke på "Mere" → "Open".
    8. Gentag trin 5.2.5 - 5.2.6 at definere 4 yderligere områder for osteoklast størrelse analyse (figur 2A og 2D).
      Bemærk: De definerede regioner vil blive brugt til at analysere osteoklast størrelser i alle billederne.
    9. Oprette en kopi af en af de 5 regioner skal analyseres: valgte denne ROI i vigtigste ROI manager (de tilsvarende udvalg vises på de vigtigste billede) → Højreklik inde udvælgelse → "Duplikat". Brug denne dublet for yderligere analyse.
    10. I ROI Manager-vinduet, afkrydsningsfelterne "Vis Al" l og "Etiketter".
    11. I hovedvinduet, Vælg af polygon markeringsværktøjet manuelt skitsere en af osteoklasterne i markeringen. Tilføj denne disposition til ROI manager ved at klikke på "Tilføj" i vinduet ROI manager. Fortsæt på samme måde for alle osteoklaster, der ligger helt inde i det valgte område (figur 2B og 2E).
    12. Vælg alle konturer i vinduet ROI Manager og måle deres overflade ved at klikke på "Foranstaltning". Overføre de målinger, som er dukket op i et nyt vindue (resultater vindue, figur 2 c og 2F) til et regneark.
      Bemærk: På dette punkt, regionen i analyse med alle osteoklaster skitserer kunne gemmes som en uafhængig billede: "Fil" → "Opspare nemlig" format valg.
    13. Gentag trin 5.2.8 - 5.2.12 for de resterende områder af analyse af det aktuelle billede. Gentag derefter hele proceduren for alle de andre billeder.
  3. Osteoklast nummer analyse med ImageJ software.
    Bemærk: Som osteoklast distribution i brønden er sjældent homogen, udføre optællingen på hele godt i stedet for på få udvalgte områder. Osteoklaster er heterogene i form og størrelse, ikke automatiseret, tælle celle metode er praktisk muligt.
    1. Åbn et hele-godt billede i ImageJ software (for denne analyse, bruge billeder fra foregående underafsnit).
    2. Åbn vinduet celle counter: "Plugins" → "analysere" → "Celle Counter". Klik på afkrydsningsfeltet "Type 1" og "Initialisere" (eller hvad skrive tal du foretrækker). Kontroller, at "Vis nummer" er markeret, og afkrydsningsfeltet "Slet tilstand" ikke er markeret.
    3. På billedet, klik på en osteoklast: farvede prik og en række vises hvor klikkede. Fortsæt på samme måde for alle osteoklaster. Gem markørerne regelmæssigt ved at klikke på "Gem markører" i vinduet celle counter
      Bemærk: Hvis det sidste punkt skal fjernes fra Greven, klik på "Slet" i vinduet celle counter. Hvis der er mere end ét punkt til at fjerne, afkrydsningsfeltet "Slet tilstand" og angive alle ugyldige punkter ved at klikke på dem. Derefter markeringen "Slette tilstand" for at fortsætte optællingen.
    4. Resultatet af optællingen ved at klikke på resultater i vinduet celle counter vises. Overføre de endelige optælling resultater til et regneark.

6. analyse af osteoklast funktion i overværelse af U(VI)

  1. Pit resorption assay.
    1. Plade RAW 264.7 celler på en 24-godt osteo assay plade, som giver en syntetisk uorganiske osteomimetic overflade, der kunne blive resorberet af osteoklasterne.
      Bemærk: for at lade celler tillægger den biomimetiske overflade, er det ofte bedre at pladen dem dag før du tilføjer differentiering medium.
    2. Differentiere rå 246.7 celler i osteoklaster, som beskrevet i afsnit 5 (trin 5.1.2 - 5.1.4)
    3. På dag 5 af osteoclastogenesis, fjernelse af osteoklasterne fra knogle mimetiske overflade ved at erstatte uranyl-holdige medium med 10% blegemiddelopløsning. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Vaske wells to gange med deioniseret vand og lad dem lufttørre.
    4. Tilføje en 1% Alizarin rød S natrium saltopløsning til brønde til pletten calciumsalte i de ikke-resorberet områder. Fjerne Alizarin løsning efter 10-15 s inkubation og forsigtigt brøndene vaskes 3 - 4 gange med vand. Lad brøndene lufttørre.
      Bemærk: Farvning fremgangsmåden ovenfor er designet til at forbedre kontrasten mellem den resorbed og de ikke-resorberet områder for at fremme sammenhængende analyse. Denne procedure skal gøres omhyggeligt, fordi hvis brøndene ikke er helt tørt før farvning, dele af den resterende knogle-mimetiske overflade kunne fjernes ved et uheld. Desuden, hvis Alizarin løsning for længe i brøndene, en vedvarende uspecifik farvning vises. Det skal bemærkes, at prøven er beskrevet i dette afsnit vedrører effekten af uran på både osteoclastic differentiering og funktion. For at undersøge effekten af uran på resorption uafhængigt af osteoklast dannelse, RAW 264.7 celler kan behandles med uranyl-holdige medium for 24 timer, kun når modne osteoklaster dannes (på dag 4 eller 5 forløb differentiering) 23.
  2. Pit resorption analyse.
    1. Tilegne sig et billede af hele overfladen af hver brønd af osteo assay plade.
      Bemærk: Billedet anskaffelsesmetoder kan variere men bør være konsekvent i hele Repliker eksperimenter. De kan omfatte et billede taget med en makro formålet med et fast kamera, en høj opløsning scanning eller en mosaik billede lavet med en automatiseret høj overførselshastighed mikroskop.
    2. Begynde analyse ved at gentage trin 5.2.2 til 5.2.4 fra det foregående afsnit.
    3. Konverterer et RGB-billede til et 8-bit format, gråtoner: "Image" → "Skriv" → "8 bit".
    4. I hovedvinduet, Vælg værktøjet oval udvalg. Brug det til at tegne en cirkel, skitserer alle overfladen af brønden skal analyseres for resorption.
    5. Gem denne nye ROI som i trin 5.2.6.
    6. For at lette tærskel udvælgelse, rydde alle funktioner uden for det definerede ROI: "Rediger" → "Klart uden for".
      Bemærk: På dette punkt, er det ofte bedre at gøre et par kopier af billedet: Fravælg Investeringsafkast ved at klikke uden for den valgte zone → højre klik på billede → "Duplikat". Denne handling vil bidrage til at undgå en gentagelse af billede behandling beskrevet ovenfor, hvis den tærskel, der er valgt i det næste trin er utilfredsstillende.
    7. Vælg "Image" → "Justere" → "Threshold". I vinduet tærskel, skal du bruge skyderen til at vælge en passende tærskel. Alle resorbed områder bør være under tærsklen (hvid) og resorberet ikke, ovenfor (rød). For at afslutte tærskel udvælgelsen, klik på "Anvend" i vinduet tærskel.
    8. Gemme den endelige binært billede: "Fil" → "Gem som" → format af dit valg.
    9. Definere målinger skal tages i det pågældende område: "Analysere" → "sæt målinger". I vinduet sæt målinger, check "Område", "Område fraktion" og "Grænse tærskel" kasser og uncheck alle de andre.
    10. For at opnå brøkdel af "huller" område direkte i resultatvinduet, inverteres i binært billede ("Rediger" → "Invertere"). Sikre, at den største ROI er valgt på den endelige binært billede (ellers resorberet område vil være beregnet baseret på overfladen af vinduet hele billedet). Foranstaltning resorberet område brøkdel ved enten at klikke på "Foranstaltning" i vinduet ROI manager eller på "Analysere" → "Måle". Gemme resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tartrat-resistente sur fosfatase farvning blev brugt til at visualisere osteoklaster som store lilla celler med 3 eller flere kerner. Repræsentative billeder af osteoklasterne fremstillet af RAW 264.7 celler dyrkes i overværelse af RANKL og uranyl ioner er vist i figur 1. Ændringer i antallet og størrelsen af osteoklasterne svar på uran er synligt i sammensatte billeder af hele brønde og forstørrede billeder.

Størrelsen af osteoklasterne blev analyseret ved hjælp af ImageJ software (figur 2). Til dette formål, hele-godt billeder af TRAP farves osteoklaster blev brugt og de samme regioner blev behandlet i hvert hul i hver kultur betingelse (figur 2A og 2D). Alle osteoklaster stede i hver region blev skitseret (figur 2B og 2E) som tilladt bestemmelse af deres område (udtrykt i µm2) (figur 2 c og 2F). Eksemplerne i figur 2 illustrerer uran stærk påvirkning osteoklast størrelse.

For at undersøge virkningen af uran på osteoklast resorption aktivitet, blev RAW 264.7 celler forgyldt og differentieret på osteomimetic overflade plade. For enden af analysen blev osteoklaster fjernet. Derefter, knogle mimetiske overflade i hver godt blev behandlet af Alizarin rød S natriumsalt for at pletten ikke resorberet område og billeder af hvert hele godt blev anskaffet (figur 3A og 3D). De resulterende billeder blev behandlet med billede Jørgensen software. De blev ombygget i 8-bit gråtoner billeder (figur 3B og 3E), underkastes tærskel (figur 3 c og 3F) og det resorbed område (hvid regioner) blev automatisk beregnes.

Figure 1
Figur 1: visualisering af effekten af U(VI) på osteoklast dannelse. RAW 264.7 celler blev differentieret i nærværelse af den målte koncentration af uranyl. På dag 4, blev tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) farvning udført. Repræsentative hele-godt micrographs (øvre paneler) Vis TRAP-stained osteoklaster opnået i disse betingelser. Eksempler på multinucleated osteoklaster i boxed områder er vist på en højere forstørrelse (pile i nederste paneler). Disse billeder illustrerer dosisafhængig effekt af U(VI) på osteoklast dannelse. Sort hoved pilene angiver eksempler på osteoklast kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: analyse af effekten af U(VI) på osteoklast størrelse. (A og D): hele-godt billeder af osteoklasterne med boxed område svarer til de regioner, i hvilke osteoklast størrelse blev analyseret er vist. Røde kasser område (A og D) svarer til de viste i (B) og (E), henholdsvis. (B og E): den manuelle tegning af osteoklast kanterne i de to uranyl-koncentration betingelser er vist med blåt. (C og F): resultat windows fra ImageJ software viser målinger fra (B og E) analyse henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: analyse af effekten af U(VI) på osteoklast funktion. Billeder af Alizarin farves osteomimetic overflade efter osteoclastic resorption, der fandt sted i fravær (A) eller i nærværelse af 25 µM af uranyl (D). Billeder i (A og D) blev først omdannet i 8-bit gråtoner billeder som vist i (B og E) og efterfølgende i binære billeder (C og F) ved at anvende en passende tærskel indstilling. Disse binær billeder blev brugt til at beregne procentdelen af huller i hver tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Så vidt vi ved, er det første gang, at en detaljeret procedure med henblik på at studere effekten af naturligt uran på knogle resorbing celler er beskrevet. Denne tilgang vil være nyttigt at opnå en bedre forståelse af uran indvirkning på knogle fysiologi og kan give en interessant ny værktøj til screening af uran chelatorer. Derudover mener vi, at protokollen beskrevet her kunne anvendes til at undersøge virkningen af andre tungmetaller på osteoclatogenesis.

Det er kendt, at uranyl er kompleksbundet med uorganiske og organiske komponenter i dyrkningsmedier18,19,20,21. Disse complexations påvirker typebestemmelse af uran og på denne måde, dens cytotoksicitet. Derfor er et kritisk skridt i protokollen forberedelsen af uran-holdige medier. Vi har tidligere vist23 , tilstedeværelsen af 5% føtal bovint serum dyrkningsmedium RAW 264.7 celler havde ingen signifikant effekt på cytotoksicitet af uranyl når det bruges i koncentrationer spænder fra 0 til 400 µM. Dette er et vigtigt punkt, som tilstedeværelsen af serum i medium er forpligtet til at analysere effekten af uran eksponering under hele processen med osteoclastic differentiering. Ikke desto mindre, vi vil gerne understrege, at den langt totrinsprocedure beskrevet for udarbejdelsen af eksponering medier (6 timer) skal følges nøje. Faktisk, inkubation trin 3 timer efter hver fortynding af uranyl salte giver mulighed for stabilisering af uranyl komplekser potentielt dannet i løsning før yderligere fortynding eller celle eksponering. Dette er absolut nødvendigt at opnå pålidelige og reproducerbare resultater.

En anden vigtig parameter for reproducerbarhed af osteoklast differentiering og resorption assays er seeding massefylden af RAW 264.7 celler. Faktisk har det vist at mononukleære forløber tæthed er en kritisk faktor for osteoklast dannelse, sandsynligvis fordi celle til celle nærhed påvirker cellulære fusion begivenheder24. Derfor skal en særlig opmærksomhed betales til celle optælling, cellulære suspension forberedelse og homogenitet af såning i hver brønd, for at undgå fejlfortolkning.

Værktøjet tærskel er nyttige til at automatisere kvantificering af resorption. Det værd at påpege, at denne analyse kræver korrekt belyst billeder. Et fælles problem uanset typen af kamera og image erhvervelse metode er imidlertid ujævn belysning på kanten af billedet. I så fald kan en multi-step tærskel metode være nødvendigt.

I Resumé, har vi etableret en robust protokol giver mulighed for undersøgelse af uran indvirkning på osteoklast dannelse, levedygtighed og funktion. Denne procedure er blevet udviklet ved hjælp af RAW 264.7 cellelinie men er fuldt ud gældende for primære knoglemarv osteoklast prækursorer, som vi har vist23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Chantal Cros hjælpsom teknisk bistand.
Denne forskning blev finansieret af tilskud fra den "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energier alternativer" (URANOs - programmet tværgående de Toxicologie du CEA og CPRR CEA-AREVA), og fra ANR (toksicitet af uran: multi-level tilgang af biomineralization behandle i knoglen, ANR-16-CE34-0003). Dette arbejde blev også støttet af University of Nice Sophia-Antipolis og CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51, (6), 755-771 (1986).
  3. Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57, (1), 17-21 (1989).
  4. Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110, (4), 337-342 (2002).
  5. Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67, (6), 589-610 (1994).
  6. Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25, (6), 1161-1175 (2012).
  7. Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236, (2), 123-130 (2015).
  8. Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159, (1), 1-8 (2016).
  9. Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
  10. Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276, (5310), 266-269 (1997).
  11. Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276, (5310), 270-273 (1997).
  12. Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91, (4), 1903-1914 (2017).
  13. Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54, (1), 17-23 (1991).
  14. Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79, (8), 475-481 (2005).
  15. Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113, (1), 68-72 (2005).
  16. Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
  17. Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22, (7), 975-983 (2007).
  18. Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18, (3), 180-187 (1999).
  19. Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17, (3), 446-452 (2004).
  20. Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252, (1-3), 26-32 (2008).
  21. Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250, (1), 62-69 (2008).
  22. Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. Oxford University Press. Oxford. (1999).
  23. Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861, (4), 715-726 (2017).
  24. Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics