Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis

Developmental Biology

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Summary

L’uranium est connu pour affecter le métabolisme osseux. Nous présentons ici un protocole visant à étudier les effets de l’exposition de l’uranium naturel sur la viabilité, la différenciation et la fonction des ostéoclastes, les cellules en charge de la résorption osseuse.

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Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

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Abstract

L’uranium a été montré pour interférer avec la physiologie osseuse et il est bien établi que ce métal s’accumule dans les os. Cependant, on connaît les effets de l’uranium naturel sur le comportement des cellules osseuses. En particulier, l’impact de l’uranium sur les ostéoclastes, les cellules responsables de la résorption de la matrice osseuse, n’est pas documentée. Pour étudier cette question, nous avons créé un nouveau protocole avec l’acétate d’uranyle comme une source d’uranium naturel et de la lignée murine RAW 264.7 comme modèle des précurseurs ostéoclastiques. Ici, nous avons détaillé tous les tests requis pour tester la cytotoxicité d’uranium sur les précurseurs d’ostéoclastes et d’évaluer son impact sur l’osteoclastogenesis et la fonction de résorption des ostéoclastes matures. Les conditions que nous avons développé, en particulier pour la préparation des milieux de culture contenant de l’uranyle et l’ensemencement des RAW 264.7 cellules permettent d’obtenir des résultats fiables et hautement reproductif. En outre, nous avons optimisé l’utilisation des outils logiciels pour faciliter l’analyse de divers paramètres tels que la taille des ostéoclastes ou le pourcentage de matrice résorbé.

Introduction

L’uranium est un élément radioactif naturel présent dans les sols, air et eau ; par conséquent, animaux et les humains sont exposés à l’uranium naturel dans leur alimentation. En plus de sources naturelles, uranium provient d’origine anthropique, qui augmente son abondance dans l’environnement. L’uranium pose des risques chimiques et radiologiques. Cependant, parce que l’uranium naturel (qui est un mélange isotopique contenant 99,27 % 238U, 0,72 % 235U et 0,006 % 234U) a une faible activité spécifique (25,103 Bq.g-1), ses impacts sur la santé sont attribués à sa toxicité chimique.

Quelle que soit sa voie d’accès (inhalation, ingestion ou cutanée), la plupart d’uranium pénétrant dans l’organisme est éliminé par les fèces et seule une petite partie atteint la circulation générale. Environ 67 % de l’uranium dans le sang est ensuite filtrée par les reins et quitte le corps dans l’urine dans les 24 h1. Le reste se dépose principalement dans les reins et les os, les deux organes de cible principale de la toxicité de l’uranium pour2,3,4. Parce que le squelette a été identifié comme le principal site d’uranium à long terme conservation2,3,4,5,6, plusieurs études ont été réalisées afin d’explorer les effet de l’uranium sur OS physiologie7.

L’OS est un tissu minéralisé qui est remodelé en permanence tout au long de sa durée de vie. Remodelage osseux est un processus complexe qui dépend des types de cellules spécialisées et se compose essentiellement de deux phases : la résorption de la matrice préexistante vieux par les ostéoclastes suivie de novo construction d’os par les ostéoblastes. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléaires grands résultant de la fusion de cellules précurseurs d’origine hématopoïétique qui migrent vers des sites de résorption où qu’ils attachent à l’OS8. Leur fixation se produit simultanément avec une réorganisation à grande échelle de leur cytosquelette9. Cette réorganisation est nécessaire pour la mise en place d’un compartiment isolé entre la cellule et la surface de l’os dans lequel les ostéoclastes sécrète des protons, conduisant à la dissolution de l’hydroxyapatite et des protéases impliquées dans la dégradation de la matrice organique. Les produits de dégradation qui en résultent sont mégacaryocyte, transporté à travers la cellule à la zone de la membrane opposée à la surface osseuse et sécrétée, un processus appelé transcytose10,11.

Les résultats des études in vivo et in vitro indiquent que l’uranium inhibe la formation osseuse et altère le nombre et l’activité des ostéoblastes7,12. En revanche, les effets de l’uranium sur la résorption osseuse et les ostéoclastes ont été peu explorées. Plusieurs des études in vivo ont signalé une augmentation de la résorption osseuse après administration de nitrate d’uranyle de souris ou rats13,14. En outre, une enquête épidémiologique a suggéré que l’augmentation de l’apport d’uranium dans l’eau potable ont tendance à être associée à une augmentation de la concentration sérique d’un marqueur de résorption osseuse en hommes15. Pris ensemble, ces conclusions ont conduit à la conclusion que l’uranium, qui s’accumule dans les os pourrait favoriser la résorption osseuse. Toutefois, les mécanismes cellulaires impliqués dans cet effet potentiel de l’uranium restent une question ouverte. Pour cette raison, nous avons décidé d’examiner l’impact de l’uranium sur le comportement de la résorption des cellules osseuses.

Nous décrivons ici le protocole que nous avons mis en place pour caractériser et quantifier les effets de l’uranium naturel sur la viabilité des ostéoclastes avant et sur la différenciation des ostéoclastes et activité de résorption. Les expériences décrites dans les présentes ont été faites avec la lignée de cellules macrophages de souris transformées RAW 264.7, qui peut facilement se différencient en ostéoclastes lorsque cultivées en présence de la cytokine RANKL pour 4 ou 5 jours, et qui est classiquement utilisé pour étudier ostéoclastes différenciation et fonction16. Les procédures mises en place sont fiables, donnent des résultats hautement reproductibles et sont pleinement applicable aux ostéoclastes primaires. Pour toutes ces raisons, nous croyons que cette méthode est utile pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la toxicité de l’uranium dans les os. En outre, nous pensons que cette approche pourrait être adaptée comme outil de dépistage pour identifier les nouvelles d’uranium par des agents chélateurs.

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Protocol

1. préparation de la Solution d’acétate d’uranyle

  1. Pour préparer 2 mL d’une solution d’acétate d’uranyle 100 mM, ajouter 85 mg d’acétate d’uranyle (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O ; M = 424 g.mol-1) à l’état solide dans un tube en plastique de 5 mL.
  2. Ajouter 2 mL d’eau distillée dans le tube en plastique et fixez-le avec un bouchon en plastique.
  3. Agiter vigoureusement le tube jusqu'à la dissolution totale du solide. Mettre la solution dans le réfrigérateur pendant 24 h.
    ATTENTION : La manipulation d’uranyle [u] présente certains risques chimiques et radiologiques. Tous les échantillons doivent être préparés et caractérisés avec l’équipement ad hoc dans les laboratoires spécifiques. Tous les liquides contenant U VI devraient être prélevés dans des conteneurs de déchets spécifiquement attribuées et éliminé comme déchet toxique. Déchets secs (pipettes, tubes, etc.) pourraient être lavés avec 0,1 N HNO3 solution, ce qui va solubiliser et enlever u.
  4. Vérifier le pH de la solution à l’aide d’une microélectrode et un pH-mètre.
    Remarque : La microélectrode doit être préalablement étalonnée à l’aide de solutions tampons commerciaux (pH = 4 et pH = 7).

2. RAW 264.7 cellules Culture

  1. Entretien des cellules.
    1. Cultiver des 264.7 cellules crues (ATCC, TIB-71) dans des flacons de2 75 cm dans le milieu de croissance suivants : Dulbecco de l’aigle modifié (DMEM) additionné de 5 % de sérum de veau fœtal et antibiotiques : pénicilline 100 UI/mL, 100 µg/mL de streptomycine. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2.
    2. Moyen de changement tous les 2 à 3 jours. Lorsque les cellules sont 85-90 % anastomosé, mécaniquement retirer le flacon de culture à l’aide d’un grattoir de cellules (comme recommandé par l’ATCC) et divisez-les à un ratio de 1:6.
      NOTE : seules les cellules entre les passages de 3 à 10 sont utilisés pour des expériences de différenciation.
  2. Préparation des cellules pour des expériences
    1. Déloger les cellules du substrat de ballon comme décrit ci-dessus et de les transférer dans un tube stérile de 50 mL. Les cellules de la composition de pipetage de haut en bas pour briser les mottes. Dénombrer avec un hémocytomètre. S’attendre à 35 millions de cellules par flacon de 75 cm2 .
    2. Calculer le volume de suspension de cellules nécessaire pour chaque expérience comme suit :
      Nombre d’expérimentale des conditions x 3 (géométrie) x 1 mL par puits + 3-4 mL (pertes de pipetage).
      Remarque : Pour tous les essais décrits dans le présent protocole, la densité de semis sont de 5 000 cellules/cm2. Par conséquent, pour une plaque 24 puits, cela veut dire 10 000 cellules par puits dans 1 mL de milieu et densité de suspension cellulaire est donc 10 000 cellules/mL.
    3. Préparer la quantité nécessaire 10 000 cellules/mL de suspension de cellules et les cellules des graines en plaques 24 puits. Pour les analyses de cytotoxicité, utiliser le milieu de croissance normale. Différenciation et dosages de résorption, utilisation alpha modifié Minimum indispensable moyen (αMEM) additionné de 2 mM de L-Glutamine, 5 % FBS et 50 ng/mL de GST-RANKL17.
      Remarque : Le GST-RANKL protéine produite en interne peut être remplacé par n’importe quel cytokine RANKL disponible dans le commerce. Lorsque vous travaillez avec un nouveau lot RANKL, il peut être utile tester son efficacité dans l’induction d’osteoclastogenesis en effectuant une expérience de réponse dose avec concentration de RANKL allant de 20 à 150 ng/mL.

3. la dilution de la Solution d’acétate d’uranyle 100 mM dans le milieu de Culture

Remarque : Les ions uranyle [u] dans le milieu de culture forment des complexes multiples avec d’autres composants moyens qui pourraient modifier sa toxicité cellulaire18,19,20,21. Pour cette raison, uranyle contenant des médias devraient être préparés extemporanément sans omettre ou raccourcir les étapes de l’équilibration.

  1. A choisi uranyle concentrations d’exposition et de calculer les volumes des milieux de culture requis pour l’expérience (en tenant compte du fait que chaque condition est réalisée en trois exemplaires).
  2. À partir de la culture de cellules stériles testé la solution aqueuse de bicarbonate de sodium 7,5 % ([HCO3] = 893 mM), préparer une solution aqueuse 100 mM HCO3 et refroidir sur glace.
  3. Ajouter goutte à goutte 1 volume de solution mère 100 mM de l’acétate d’uranyle à 9 volumes de la glacée 100 mM HCO3 solution, secouant doucement le tube de mélange. Cette opération va diluer la solution mère d’acétate d’uranyle ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) à 10 mM et amener le pH à 7 environ.
  4. Ajouter 1 volume d’eau stérile à 9 volumes de glacé 100 mM HCO3 solution pour atteindre 90 mM HCO3 (égale à HCO3 concentration dans la solution d’uranyle de 10 mM), qui serviront à préparer le contrôle milieu.
  5. Permettre des solutions préparées au repos pendant 3 h à température ambiante (RT) pour l’équilibration.
  6. Pendant ce temps, préparer le milieu de l’exposition de base : αMEM avec 2 mM de L-Glutamine et 5 % FBS.
    Remarque : Pour la différenciation et des essais de résorption, ajouter 50 ng/mL de GST-RANKL au milieu de l’exposition de base.
  7. Après 3 h, diluer les quantités appropriées de la solution d’uranyle 10 mM goutte à goutte dans le milieu de l’exposition afin de réaliser l’uranyle souhaité travailler des concentrations. Préparer en même temps le fluide en ajoutant la quantité de bicarbonate, utilisée dans la condition plus concentrée imprégnées d’uranyle, au milieu de l’exposition.
  8. Permettre des supports préparés au repos pendant 3 h à ta pour l’équilibration.
  9. Supprimer des milieux de culture des puits et le remplacer par le contrôle et les médias d’uranyle-contenant.

4. analyse des brutes 264,7 précurseurs viabilité en présence d’u (tests cytotoxiques MTT)

ATTENTION : Les MTT et DMSO pourraient causer la peau et une irritation des yeux. Porter des gants et des lunettes de protection lors de leur manipulation. Collecter les déchets dans les conteneurs à déchets spécifiquement assignées.

  1. Dissoudre une quantité appropriée de poudre de bromure de 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) dans du PBS pour obtenir une solution à 5 mg/mL 10 x. Stériliser par filtration avec filtre 0,22 µm et stocker les aliquotes à-20 ° C.
  2. Cellules de plaque sur plaques 24 puits (3 puits par les conditions expérimentales par plaque). N’oubliez pas de réserver 3 puits vides par plaque pour les flans du spectrophotomètre.
  3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 22 à 24 heures avant l’exposition en uranium à laisser les cellules à attacher.
  4. Préparer les milieux contenant de l’uranyle tel que décrit à l’article 3.
  5. Remplacer le milieu de croissance dans les plaques de la cellule graines par uranyle contenant médias. Incuber pendant 24 h.
  6. Calculer le volume nécessaire de solution de x MTT 1 comme suit :
    (Nombre de conditions expérimentales + blanc) x 3 (géométrie) x 0,4 mL/puits + 10 % en volume pour les pertes de pipetage.
  7. Préparer le volume requis de 1 x MTT solution en diluant 10 x solution MTT mère en aigle Minimum indispensable moyen (EMEM) sans rouge de phénol.
    Remarque : pour un dosage colorimétrique réussi, MTT doit être protégé de la lumière. Il est recommandé de diluer les MTT en EMEM plutôt que DMEM afin de limiter le signal de fond.
  8. Supprimer les milieux contenant uranyle provenant des puits, lavez-les avec du PBS et ajouter 400 µL de solution de MTT dans chaque puits (y compris 3 puits vides pour les blancs). Incuber pendant 2,5 heures à 37 ° C dans l’obscurité. Sous microscope, vérifier que les cristaux de formazan violets foncés ont formé à l’intérieur de cellules viables.
  9. Jeter la solution MTT et ajouter 220 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) / puits. Envelopper les plaques en aluminium pour les protéger de la lumière et agitez doucement pendant 10 min pour dissoudre les cristaux de formazan.
  10. Utilisez un lecteur de microplaques spectromètre pour déterminer la densité optique (do) à 570 nm (formazan spécifique) et 690 nm (en arrière-plan). Pour chaque puits, soustraire 690 nm OD de 570 nm OD pour ajuster l’éventuelle fluctuation de valeur OD non-spécifique à cause des rayures ou de turbidité22.
  11. Calculez l’OD blanc-corrigé pour chaque puits en soustrayant la moyenne des do de l’ébauche de la Division d’opposition a obtenu à l’étape précédente. Déterminer la moyenne valeur OD pour chaque condition expérimentale.
  12. La valeur moyenne des do de la condition de contrôle ([UO22 +] = 0 mM) à 100 % de viabilité et de calculer le pourcentage correspondant de la viabilité cellulaire pour les autres concentrations testées d’uranyle. Tracer la courbe dose-réponse. Évaluer les 50 Index de cytotoxicité (CI50), définie comme la concentration d’uranyle conduisant à la mort cellulaire 50 % après 24 h d’exposition.

5. analyse de la différenciation des ostéoclastes en présence d’u

  1. Différenciation des RAW 264.7 cellules en présence d’uranyle et le siphon (Tartrate-résistant à l’acide Phosphatase) coloration.
    1. Plaque 264.7 cellules crues sur une plaque de 24 puits, 3 puits par condition expérimentale. Incuber à 37 ° C pendant environ 6 h, le temps de préparer et d’équilibrer les médias d’exposition contenant d’uranyle.
    2. Préparer les médias de différenciation avec des concentrations d’uranyle désiré comme décrit à la section 3 (n’oubliez pas d’y ajouter GST-RANKL media).
    3. Doucement remplacez milieu basique dans les puits contenant de l’uranyle moyen. Ce jour est considéré comme jour 0 de différenciation ostéoclastique.
    4. Changer le support au jour 2 ou 3 de différenciation ostéoclastique en répétant les étapes 5.1.2 et 5.1.3. Les ostéoclastes multinucléées devraient apparaître entre les jours 3 et 4.
    5. Effectuer la coloration du piège avec le kit de phosphatase acide leucocytes commercialement disponible suivant les instructions du fabricant.
      NOTE : Tartrate-résistante phosphatase acide (TRAP) aussi appelée phosphatase acide 5, tartrate résistante (ACP5) est fortement exprimée dans les ostéoclastes matures et largement utilisée comme marqueur de différenciation ostéoclastique. Par conséquent, piège de coloration est réalisée afin de visualiser les ostéoclastes. En fonction des conditions expérimentales et le taux d’osteoclastogenesis, il pourrait être fait sur le J4 ou J5 du processus de différenciation.
    6. Garder le puits piège tachée dans du PBS à 4 ° C pour une analyse plus approfondie (ils peuvent être maintenus dans ces conditions jusqu'à 3 ou 4 semaines).
  2. Analyse de taille/morphologie des ostéoclastes.
    1. Acquérir une image de la surface totale de chaque puits. La résolution de l’image devrait être suffisante pour distinguer des noyaux cellulaires. Considérer des cellules positives piège avec 3 ou plusieurs noyaux, comme les ostéoclastes.
    2. Ouvrir une image d’un puits dans le logiciel ImageJ : « Fichier » → « Open ».
    3. Vérifier les unités de l’échelle dans le coin supérieur gauche de l’image. Pour la quantification relative, n’importe quel appareil peut être utilisé. Si la valeur absolue de la taille de l’ostéoclaste est nécessaire, convertir les unités de l’échelle en µm : « Image » → « propriétés ». Cochez la case « globale » dans la fenêtre pop-up afin d’avoir de nouvelles unités d’échelle appliquées à toutes les images ouvertes plus tard.
      Remarque : Si un microscope a été utilisé pour l’acquisition d’images, la taille du pixel en µm est indiquée pour chacun des objectifs dans le logiciel d’imagerie.
    4. Spécifier les paramètres de mesure à analyser : « Analyze » → « définir des mesures ». Dans la fenêtre définir des mesures, « Espace » et « Affichage Label » cases à cocher et décocher toutes les autres cases.
    5. Ouvrez le gestionnaire de ROI (région d’intérêt) : « Analyser » → « outils » → « Gestionnaire de ROI ».
    6. Dans la fenêtre principale, choisissez l’outil Sélection rectangulaire. Utiliser n’importe où dans l’image pour décrire un secteur d’environ 1 000 x 1 000 µm. Cette sélection maintenant définit la première région dans les ostéoclastes taille est analysée.
    7. Dans la fenêtre Gestionnaire de ROI, cliquez sur le bouton « Ajouter » pour ajouter cette région d’intérêt au ROI manager et l’enregistrer en cliquant sur « Plus » → « Enregistrer ». Le retour sur investissement enregistré peut maintenant être rechargée au gestionnaire du ROI à tout moment en cliquant sur « Plus » → « Open ».
    8. Répétez les étapes 5.2.5 - 5.2.6 de définir 4 régions supplémentaires pour l’analyse granulométrique ostéoclastes (Figure 2 a et 2D).
      NOTE : Les régions déterminées serviront à analyser les tailles des ostéoclastes dans toutes les images.
    9. Créer une copie de l’un des 5 régions à analyser : a choisi ce ROI pour l’essentiel, le gestionnaire de ROI (la sélection correspondante s’affiche sur l’image principale) → clic droit à l’intérieur de la sélection → « Duplicata ». Utilisez ce duplicata pour une analyse ultérieure.
    10. Dans la fenêtre Gestionnaire de ROI, cases à cocher « Afficher Al » l et « Labels ».
    11. Dans la fenêtre principale, choisissez l’outil de sélection polygone de définir manuellement un des ostéoclastes dans la sélection. Ajouter cette esquisse au ROI manager en cliquant sur « Ajouter » dans la fenêtre Gestionnaire de ROI. Procéder de même pour tous les ostéoclastes qui se trouvent entièrement à l’intérieur de la région sélectionnée (Figure 2 b et 2E).
    12. Dans la fenêtre Gestionnaire de ROI, sélectionnez toutes les lignes et mesurer leur surface en cliquant sur « Mesure ». Transférer les mesures qui ont été publiés dans une nouvelle fenêtre (fenêtre de résultats, Figure 2 et 2F) dans une feuille de calcul.
      Remarque : À ce stade, la région d’analyse avec tous les contours des ostéoclastes pourrait être sauvée comme une image indépendante : « Fichier » → « Enregistrer sous » format du choix.
    13. Répétez les étapes 5.2.8 - 5.2.12 pour les autres régions de l’analyse de l’image courante. Ensuite, répétez l’ensemble de la procédure pour toutes les autres images.
  3. Ostéoclastes numéro analyse avec logiciels ImageJ.
    Remarque : Comme la distribution des ostéoclastes dans le puits est rarement homogène, effectuez le comptage dans l’ensemble bien plutôt que sur quelques zones sélectionnées. Étant donné que les ostéoclastes sont hétérogènes en forme et de taille, non automatisée cellule méthode de comptage n’est possible.
    1. Ouvrez une image d’ensemble-bien dans le logiciel ImageJ (pour cette analyse, utiliser des images de la sous-section précédente).
    2. Ouvrez la fenêtre du compteur cellulaire : « Plugins » → « analyser » → « Compteur de cellules ». Cliquez sur la case à cocher « Type 1"et de « Initialiser » (ou autre numéro vous préférez). Vérifiez que « Nombre de Show » est cochée et « Supprimer le Mode » case est décochée.
    3. Sur l’image, cliquez sur un ostéoclastes : point de couleur et un numéro seront affiche lorsque vous cliquez sur. Procéder de même pour tous les ostéoclastes. Sauvegarder les marqueurs régulièrement en cliquant sur « Enregistrer les marqueurs » dans la fenêtre du compteur cellulaire
      Remarque : Si le dernier point doit être enlevée de la comte, cliquez sur « Effacer » dans la fenêtre du compteur cellulaire. S’il y a plus d’un point à supprimer, cochez la case « Supprimer le Mode » et indiquer tous les points non valides en cliquant sur eux. Ensuite, décochez la boîte « Supprimer le Mode » pour continuer le comptage.
    4. Afficher le résultat du comptage en cliquant sur résultats dans la fenêtre du compteur cellulaire. Transférer les résultats de comptage finales dans une feuille de calcul.

6. analyse des ostéoclastes fonction en présence d’u

  1. Dosage de fosse de résorption.
    1. Plaque 264.7 cellules crues sur une plaque de test de 24 puits osteo, offrant une surface synthétique ISOÉLASTIQUE inorganiques qui pourrait être résorbée par les ostéoclastes.
      NOTE : afin de laisser les cellules à fixer sur la surface de la biomimétique, il vaut souvent mieux leur plaque le jour avant d’ajouter le support de différenciation.
    2. Différenciez les cellules de 246,7 RAW dans les ostéoclastes tel que décrit à l’article 5 (mesures 5.1.2 - 5.1.4)
    3. Jour 5 d’osteoclastogenesis, prélever les ostéoclastes à la surface mimétique d’OS en remplaçant le milieu contenant uranyle avec 10 % de Javel. Incuber 5 min à température ambiante. Laver les puits deux fois avec de l’eau désionisée et laissez-les sécher à l’air.
    4. Ajouter une solution salée de sodium 1 % rouge d’alizarine S dans les puits pour colorer les sels de calcium dans les zones non résorbé. Enlever la solution d’alizarine après 10-15 s d’incubation et laver délicatement les puits 3 - 4 fois avec de l’eau. Laissez que sécher les puits.
      Remarque : La procédure décrite ci-dessus est conçue pour renforcer le contraste entre la résorbés et les zones non résorbé afin de faciliter les analyses consécutives. Cette procédure doit être faite avec précaution, car si le puits ne sont pas complètement sèches avant la coloration, parties de la surface osseuse-mimétique restante pourraient être accidentellement supprimés. En outre, si la solution d’alizarine est laissée trop longtemps dans les puits, une coloration persistante de non-spécifiques apparaîtra. Il est à noter que l’essai décrit dans cette section se rapporte aux effets de l’uranium sur la différenciation ostéoclastique et la fonction. Afin d’étudier les effets de l’uranium sur résorption indépendamment la formation des ostéoclastes, 264.7 cellules crues peuvent être traitées avec uranyle contenant moyennes pendant 24 heures, une seule fois les ostéoclastes matures sont formés (au jour 4 ou 5 du processus de différenciation) 23.
  2. Analyse de fosse de résorption.
    1. Acquérir une image de la surface totale de chaque puits de la plaque d’essai osteo.
      Remarque : Les méthodes d’acquisition images peuvent varier mais devraient correspondre au cours des expériences répétées. Ils peuvent inclure une photo prise avec un objectif macro d’une caméra fixe, un balayage à haute résolution ou une image de mosaïque faite avec un microscope automatisée à haut débit.
    2. Commencer l’analyse en répétant les étapes 5.2.2 à 5.2.4 de la section précédente.
    3. Convertir une image RVB au format 8-bit niveaux de gris : « Image » → « Type » → « 8 bit ».
    4. Dans la fenêtre principale, sélectionnez l’outil Sélection de forme ovale. Il permet de dessiner un cercle décrivant toute la surface du puits à analyser pour la résorption.
    5. Enregistrez ce nouveau ROI comme à l’étape 5.2.6.
    6. Pour faciliter la sélection du seuil, désactivez toutes les fonctionnalités en dehors de la ROI définie : « Edit » → « Clair à l’extérieur ».
      Remarque : À ce stade, il est souvent préférable de faire quelques copies de l’image : désélectionnez le ROI en cliquant à l’extérieur de la zone sélectionnée → un clic droit sur l’image → « Duplicata ». Cette mesure permettra d’éviter la répétition du traitement image décrite ci-dessus, si le seuil choisi à l’étape suivante n’est pas satisfaisant.
    7. Sélectionnez « Image » → « Ajuster » → « seuil ». Dans la fenêtre de seuil, utilisez le curseur pour choisir un seuil approprié. Tous les domaines résorbés devraient être inférieur au seuil (blanc) et non-résorbé, ci-dessus (rouge). Pour finaliser la sélection de seuil, cliquez sur « Appliquer » dans la fenêtre de seuil.
    8. Enregistrer l’image binaire final : « Fichier » → « Enregistrer sous » → format de votre choix.
    9. Définir des mesures à prendre dans la région d’intérêt : « Analyze » → « définir des mesures ». Dans la fenêtre définir les mesures, vérifier la « Zone », « Fraction de zone » et les boîtes de « Limite de seuil » et décochez toutes les autres.
    10. Pour obtenir la fraction de la zone « résorbé » directement dans la fenêtre de résultats, il faut inverser l’image binaire (« Edit » → « Inverser »). Assurez-vous que le retour sur investissement principal est sélectionné sur la dernière image binaire (dans le cas contraire fraction résorbés zone sera calculée en fonction sur la surface de la fenêtre de l’image entière). Fraction résorbés zone mesure soit en cliquant sur « Mesure » dans la fenêtre Gestionnaire de ROI ou sur « Analyser » → « Mesurer ». Enregistrer le résultat.

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Representative Results

Phosphatases acides tartrate-résistantes de coloration a été utilisée pour visualiser les ostéoclastes comme grandes cellules violets avoir 3 ou plusieurs noyaux. Des images représentatives des ostéoclastes provenant des 264.7 cellules crues cultivées en présence de RANKL et ions uranyle sont indiquées à la Figure 1. Changements dans le nombre et la taille des ostéoclastes en réponse à l’uranium sont facilement visibles dans l’image composite de tout puits et en images élargies.

Taille des ostéoclastes a été analysée à l’aide de logiciels ImageJ (Figure 2). À cette fin, tout puits images du piège teinté d’ostéoclastes étaient utilisées et les mêmes régions ont été traitées dans chaque puits de chaque condition de culture (Figure 2 a et 2D). Tous les ostéoclastes présents dans chaque région ont été décrits (Figure 2 b et 2E) qui a permis la détermination de leur surface (exprimée en µm2) (Figure 2 et 2F). Les exemples indiqués à la Figure 2 illustrent l’effet forte d’uranium sur la taille des ostéoclastes.

Afin d’étudier l’impact de l’uranium sur l’activité de résorption osseuse ostéoclastique, 264.7 cellules crues ont été plaqués et différenciées sur la plaque de surface ISOÉLASTIQUE. À la fin du test, les ostéoclastes ont été supprimés. Puis, surface mimétique osseuse dans chacun bien a été traitée par le sel de sodium de rouge d’alizarine S afin de souiller la zone non résorbé et images de chaque ensemble ont été bien acquises (Figure 3 a et 3D). Les images qui en résultent ont été traitées avec le logiciel Image J. Ils ont été convertis en images niveaux de gris 8 bits (Figure 3 b et 3E), soumis à seuil (Figure 3 et 3F) et la zone résorbée (régions blanches) a été calculée automatiquement.

Figure 1
Figure 1 : visualisation de l’effet d’u sur la formation des ostéoclastes. 264.7 cellules sont différencient en présence de la concentration indiquée d’uranyle. Au jour 4, les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) coloration a été réalisée. Représentant ensemble puits micrographies (panneaux supérieurs) montrent les ostéoclastes piège colorés obtenus dans ces conditions. Des exemples des ostéoclastes multinucléées dans les zones en boîte sont montrés à un grossissement plus élevé (flèches en panneaux inférieurs). Ces photos illustrent l’effet de dose-dépendante de l’appliquant sur la formation des ostéoclastes. Flèches tête noires indiquent exemples des noyaux des ostéoclastes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : analyse de l’effet d’u taille d’ostéoclastes. (A et D) : images de tout puits des ostéoclastes avec zone boxed correspondant à la région dans laquelle ostéoclastes taille a été analysée sont affichées. Le rouge des boîtiers zone dans (A et D) correspondent à ceux indiqués en (B) et (E), respectivement. (B et E) : le dessin manuel des bords des ostéoclastes dans les deux conditions d’uranyle-concentration est affiché en bleu. (C et F) : entraîner windows de logiciels ImageJ montrant les mesures d’analyse (B et E) respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : analyse de l’effet d’u sur la fonction ostéoclastique. Images de la surface tachée ISOÉLASTIQUE alizarine après résorption ostéoclastique qui a eu lieu en l’absence (A) ou en présence de 25 µM d’uranyle (D). Photosdans (A et D) ont été tout d’abord convertis en images niveaux de gris 8 bits, comme indiqué (B et E) et, par la suite, dans les images binaires (C et F), en appliquant un paramètre seuil approprié. Ces images binaires ont été utilisées pour calculer le pourcentage de surface résorbé dans chaque condition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour autant que nous savons, c’est la première fois que nous décrivons une procédure détaillée visant à étudier les effets de l’uranium naturel sur OS résorption des cellules. Cette approche sera utile à une meilleure compréhension de l’impact de l’uranium sur la physiologie osseuse et peut fournir un nouvel outil intéressant pour le dépistage des chélateurs de l’uranium. En outre, nous pensons que le protocole décrit ici pourrait être appliqué pour étudier l’impact des autres métaux lourds sur osteoclatogenesis.

On sait qu’uranyle est complexé avec des composants organiques et inorganiques dans les milieux de culture18,19,20,21. Ces complexations influencent la spéciation de l’uranium et, de cette façon, la cytotoxicité. Pour cette raison, une étape cruciale dans le protocole est la préparation de milieux de culture contenant de l’uranium. Nous avons déjà montré23 que la présence de sérum de veau fœtal de 5 % dans le milieu de culture des 264.7 cellules crues a eu aucun effet significatif sur la cytotoxicité d’uranyle lorsqu’il est utilisé à des concentrations allant de 0 à 400 µM. Il s’agit d’un point important, comme l’exige la présence de sérum dans le milieu à analyser l’effet de l’exposition en uranium durant tout le processus de différenciation ostéoclastique. Néanmoins, nous tenons à souligner que la procédure de long en deux étapes décrite pour la préparation des supports d’exposition (6 heures) doit être suivie attentivement. En effet, l’étape d’incubation de 3 heures après que chaque dilution des sels d’uranyle permet la stabilisation des complexes d’uranyle potentiellement formé en solution avant dilution plus ou l’exposition de la cellule. C’est absolument nécessaire d’obtenir des résultats fiables et reproductibles.

Un autre paramètre important pour la reproductibilité des essais de la différenciation et la résorption ostéoclastique est la densité de semis de la RAW 264.7 cellules. En effet, il a été démontré que le précurseur mononucléaires densité est un facteur déterminant pour la formation des ostéoclastes, très probablement parce que la cellule-cellule proximité des influences fusion cellulaire événements24. Par conséquent, une attention particulière est versée à la cellule de comptage, la préparation de la suspension cellulaire et l’homogénéité de l’ensemencement dans chaque puits, afin d’éviter toute interprétation erronée.

L’outil de seuillage est utile pour l’automatisation de la quantification de la résorption osseuse. Est-il utile de souligner que cette analyse nécessite des images correctement éclairées. Toutefois, un problème commun quel que soit le type de méthode d’acquisition de caméra et l’image est un éclairage inégal sur les bords de l’image. Dans ce cas, une méthode de seuillage multi-étapes peut être nécessaire.

En résumé, nous avons établi un protocole robuste permettant l’étude de l’impact de l’uranium sur la formation des ostéoclastes, la viabilité et la fonction. Cette procédure a été développée à l’aide de la lignée cellulaire de RAW 264.7 mais est pleinement applicable aux précurseurs ostéoclastiques primaire la moelle osseuse, comme nous l’avons montré23.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Les auteurs tiens à remercier Chantal Cros pour assistance technique utile.
Cette recherche a été financée par des subventions de la « Commissariat à l’Energie Atomique et aux énergies Alternatives » (URANOs - Programme Transversal de Toxicologie du CEA et RERPC CEA-AREVA) et de l’ANR (toxicité de l’URanium : approche multi-niveaux de biominéralisation processus en os, ANR-16-CE34-0003). Ce travail a été également soutenu par l’Université de Nice Sophia-Antipolis et le CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

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References

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