Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Neuroscience

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Summary

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

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Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

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Abstract

Formação de ramificação e sinapse do axônio são processos cruciais para o estabelecimento de circuitos neuronais precisos. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais thalamocortical (TC) formam ramos e sinapses em camadas específicas do córtex cerebral. Apesar da óbvia correlação espacial entre formação de ramificação e sinapse do axônio, a relação causal entre eles é mal compreendida. Para resolver esse problema, recentemente desenvolvemos um método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e sinapse formação de axônios individuais de TC em organotypic cocultures.

Este protocolo descreve um método que consiste em uma combinação de um organotypic coculture e eletroporação. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral facilitam a observação dos processos axonal, preservando estruturas características tais como a configuração laminar e manipulação genética. Dois plasmídeos distintos codificação DsRed e Sinaptofisina com tag EGFP (SYP-EGFP) foram co transfectados em um pequeno número de neurônios talâmicos técnica de eletroporação. Este método permitiu-nos Visualizar morfologias axonal individuais dos neurônios de TC e seus sites pré-sináptica simultaneamente. O método permitiu também a observação a longo prazo, que revelou a relação causal entre formação de ramificação e sinapse do axônio.

Introduction

A projeção thalamocortical (TC) do cérebro de mamíferos é um sistema adequado para investigar a orientação do axônio e mecanismos de direcionamento. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais do TC crescem na placa cortical e ramos de formulário e sinapses preferencialmente em camada IV das áreas sensoriais primárias no córtex cerebral1,2. Mesmo após o estabelecimento de conexões fundamentais, mandris axonal e terminais sinápticos são remodelados dependendo de mudanças ambientais3,4. No entanto, como morfologia do axônio TC é alterada dinamicamente é mal compreendida. Uma das principais razões é a falta de uma técnica adequada para observar mudanças estruturais a nível uma única célula. Embora os desenvolvimentos recentes na microscopia, tais como a microscopia de dois fotões, permitiram a observação directa da vida neurônios corticais na vivo, existem limitações ainda técnicas para capturar o global TC trajetórias5, 6. portanto, em vitro métodos para geração de imagens ao vivo de axônios de TC que fornece ferramentas poderosas para análises estruturais de formação de ramificação e sinapse do axônio.

Nosso grupo pela primeira vez estabeleceu um método de cultura estático fatia com membrana permeável7. Usando este método, uma fatia de cortical do rato foi cocultured com um bloco talâmica sensorial, e conexões de TC de lâmina específica foram recapituladas neste organotypic cocultures7,8. Etiquetando esparsas com uma proteína fluorescente ainda mais nos permitiu observar crescimento do axônio TC e ramo formação9,10,11. Recentemente, temos desenvolvido um novo método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e formação de sinapse de axônios individuais de TC no organotypic cocultures12. Para visualizar sites pré-sináptica e axônios TC simultaneamente, DsRed e EGFP-tag Sinaptofisina (SYP-EGFP) foram co transfectadas em um pequeno número de neurônios talâmicos por eletroporação de coculture o organotypic. O método atual facilita a análise morfológica de axônios de TC e permite a observação a longo prazo, que pode ser usada para mostrar a relação causal entre a formação de ramificação e sinapse do axônio.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos comités de bem-estar animal da Universidade de Osaka e da sociedade de neurociência do Japão.

1. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral

Nota: Para o procedimento detalhado, consulte o original publicações7,8,13. Todos os procedimentos devem ser executados sob condições estéreis. Ratos Sprague-Dawley (SD) são utilizados para culturas neuronal.

  1. Preparação dos reagentes
    Nota: Volumes dos seguintes reagentes são para o cérebro de um rato.
    1. Prepare-se 10 x modificado N2 suplemento 13: insulina (50 μg/mL), progesterona (200 nM), hidrocortisona (200 nM), Selenito de sódio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glicose (60 mg/mL)
    2. Prepare soro contendo meio de cultura (10 mL): 85% DMEM/F12, suplemento de N2 10 x modificado 10%, 5% de soro fetal bovino (FBS)
    3. Preparar meio de cultura livre de soro (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% x 10 modificado N2 suplemento
    4. Prepare a solução de colágeno de cauda de rato (0,5 mL). Em breve, tomar fibras concursos de um rabo de rato em condições estéreis e incubar durante uma noite em solução de ácido acético. Após a centrifugação, recolher o sobrenadante (alguns mg/mL) e armazenar em um refrigerador13.
  2. Preparação de pratos de cultura
    1. Coloque uma inserção da membrana em uma placa de Petri de 35mm.
    2. Adicionar 40-50 μL de solução de colágeno de cauda de rato para a membrana e espalhe a solução de colágeno em torno do centro.
    3. Ar seco a membrana completamente em uma bancada limpa.
    4. Colocar 1,5-2 mL do meio de cultura contendo soro para o prato, para que a membrana é encharcada com o meio.
    5. Coloque o prato de cultura numa incubadora (37 ° C, ar umidificado 95% e 5% CO2) antes do chapeamento.
  3. Preparação de fatias corticais
    1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 10 min ou mais.
    2. Dissecar o cérebro todo rapidamente de um dia pós-natal (P) 2 rato sob anestesia gelada (imergido em lascas de gelo por alguns minutos).
    3. Lugar do cérebro em uma placa de Petri contendo 100 mL de frio Hanks de 100mm equilibrada solução salina.
    4. Remover o problema de pia do cérebro com pinça fina e cortar fatias corticais (300-400 μm de espessura) do córtex visual e somatossensorial com tesoura microcirúrgica (para detalhes, veja a Figura 1).
      Nota: Estima-se aproximadamente a espessura das fatias corticais pela escala de grades sob um microscópio binocular.
      Nota: Alternativamente, fatias corticais podem ser feitas com um vibratome sob condições estéreis.
    5. Transferi algumas fatias corticais para a inserção de membrana com uma pipeta descartável de plástico.
    6. Ajustar as posições das fatias perto do centro da inserção da cultura, com uma pipeta Pasteur fogo-polido (para obter detalhes, consulte8,13) e remover o excesso de meio da inserção.
      Nota: Ajuste o nível do meio ligeiramente abaixo da superfície das fatias para que as fatias podem receber uma oferta suficiente do gás e do médio. Isto é crucial para a viabilidade celular.
    7. Manter as fatias em meio de cultura contendo soro a 37 ° C, em um ambiente de umidificado 95% ar e 5% de CO2e cultura sozinha por um dia antes de um bloco talâmica é levado e colocado ao lado.
  4. Preparação dos blocos talâmicos
    1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 10 min ou mais.
    2. Anestesia um rato grávido (embrionário dia 15) por injeção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) contendo anestésico.
    3. Dissecar cada embrião partir os cornos uterinos e colocar os embriões em uma placa de Petri contendo 100 mL de solução salina balanceada de Hanks frio de 100mm.
    4. Sob um microscópio binocular, remover o cérebro de cada embrião e cortar blocos talâmicos que contêm principalmente o núcleo geniculado lateral e complexo (aproximadamente 0,5 mm x 3) ventrobasal7 usando tesoura microcirúrgica (ver Figura 1).
  5. Cultura e manter organotypic cocultures
    1. Usando uma pipeta Pasteur, coloque o bloco talâmica junto a superfície ventricular da fatia cortical que foi colocada no filtro de membrana.
    2. Manter os cocultures em meio de cultura contendo soro a 37 ° C, em um ambiente de ar umidificado 95% e 5% de CO2.
    3. Troca metade do médio com meio de cultura livre de soro depois de dois dias em cultura. Depois disso, troca o meio de cada 2-3 dias.
      Nota: O nível de médio porte deve ser verificado após o câmbio médio, como é importante para a sobrevivência da pilha.

2. eletroporação

Todos os procedimentos devem ser executados sob condições estéreis.

Nota: Execute electroporation um dia após o preparo dos blocos talâmicos para evitar o desprendimento dos blocos.

  1. Plasmídeos
    1. Fazer uma mistura de plasmídeos da seguinte forma: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL.
      Nota: Purificar os ambos Plasmideos usando um kit de Maxiprep livre de endotoxinas e dissolver numa solução salina balanceada de Hanks.
  2. Instalação de equipamento de eletroporação
    Os instrumentos elétricos como um estimulador e um isolador devem ser conectados conforme mostrado na Figura 2.
    1. Conecte o estimulador do isolador bifásico.
    2. Conecte um eletrodo (um fio de prata 0,2 mm de diâmetro) para o terminal negativo do isolador.
    3. Conecte um eletrodo (um fio de prata 1 mm de diâmetro) em série com um resistor Ω a 100 e o terminal positivo do isolador.
    4. Ligar o amplificador ao osciloscópio para monitorar se correntes elétricas são passadas através do resistor, medindo a tensão com o amplificador.
  3. Preparação de pipetas de vidro
    Nota: Dois tipos de pipetas de vidro são utilizados para ejeção da solução do plasmídeo e a aplicação de pulsos elétricos.
    1. Fazer as pipetas de capilares de vidro com um extrator de eletrodo.
    2. Quebre a ponta para a pipeta de ejeção (o diâmetro da ponta deve ser de 20-50 μm).
    3. Moer e polir a ponta da pipeta eletrodo com lixa seguida de fogo-polimento (o diâmetro interno deve ser de 50-200 μm).
      Nota: Ponta do eletrodo deve ser plana e Lisa, como que toca diretamente o tecido.
  4. Procedimento de eletroporação
    1. Conecte as ejeção e eletrodo pipetas para os manipuladores.
    2. Introduza um fio de prata (0,2 mm de diâmetro) dentro da pipeta de eletrodo.
    3. Anexe a pipeta de ejeção de uma seringa de 1 mL com um tubo de plástico.
    4. Ocupam > 5 μL de solução de plasmídeo dentro da pipeta de ejeção por sucção da seringa.
    5. Colocar o coculture no palco electroporation e inserir o eletrodo de diâmetro de 1 mm no meio de cultura.
    6. Coloque a pipeta de ejeção do explante talâmica.
    7. Empurre a seringa manualmente após a ponta toca a superfície do bloco talâmica.
      Nota: Sobre 0,5 μL do plasmídeo solução geralmente é usada por um bloco talâmica.
    8. Coloca a pipeta do eletrodo no bloco talâmica imediatamente depois da retração da pipeta ejeção.
    9. Entrega os pulsos elétricos (50-400 μA, trens de 3 a 5 de 200 pulsos quadrados de 1 ms duração a 200 Hz). Monitore a amplitude e o número de trens no osciloscópio.
      Nota: A amplitude das correntes elétricas depende do diâmetro interno de um eletrodo pipeta13.
    10. Retire a pipeta do eletrodo e devolver o prato para a incubadora.
  5. Observação microscópica
    1. Coloque o prato de cultura num palco microscópica de um microscópio confocal vertical equipado com dois conjuntos de filtro para EGFP (excitação, 488 nm; emissão, 515 nm) e DsRed (excitação, 514 nm; emissão, 565 nm).
    2. Com imagens de 10-25 seções óticas em tamanhos de 1-7 µm-passo com uma lente objetiva distância de long-trabalho X 20. Selecione individualmente distinguíveis rotulados axônios que expressam tanto DsRed e SYP-EGFP.
      Nota: A área observada é aproximadamente 0,7 x 0,7 mm (correspondente a 1024 x 1024 pixels, ou seja, 0,68 μm/pixel).
    3. Capture imagens cada 24 h para a geração de imagens diária. Concluída dentro de 10 min à temperatura ambiente e retornar as culturas para a incubadora. Para a imagem latente de lapso de tempo curto intervalo, manter a cultura em uma câmara de cultura, que mantém que o ambiente de humedecido 95% ar e 5% CO2 a 37 ° C.

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Representative Results

O experimento aqui descrito destina-se a revelar a relação entre formação de ramificação e sinapse de axônio de TC. Para visualizar simultaneamente trajetórias axonal e locais de sites pré-sináptica, única ou poucas células talâmicos em organotypic cocultures foram transfectadas com dois plasmídeos codificação SYP-EGFP e DsRed usando eletroporação. Durante a segunda semana de cultura, axônios individualmente distinguíveis do TC foram claramente rotulados por DsRed (Figura 3). Só os axônios que exibiram DsRed e SYP-EGFP foram selecionados para observação. Axônios de TC rotulados invadiu a fatia cortical e formaram ramos principalmente nas camadas superiores, indicando que os axônios talâmicos no organotypic cocultures ramos de formulário com assemelhando-se a especificidade laminar que encontrei na vivo7, 8,10,14,15,16,17. Ao mesmo tempo, punctate agregações de SYP-EGFP (SYP-EGFP partitura) podem ser observadas ao longo de axônios TC DsRed-rotulado (Figura 3D-3F). Desde que estes partitura SYP-EGFP eram em sua maioria colocalized com sinais de immunopositive para VGLUT2, que é um marcador pré-sináptica de células tálamo, e para PSD95, que é um marcador geral pós-sináptico, é provável que SYP-EGFP partitura representam a maioria pré-sináptica sites sobre TC axônios12.

Time-Lapse imaging de axônios TC revelou ainda que ramificação do axônio e formação de sinapse dos neurônios talâmicos fosse contínuo e dinâmico com adição e eliminação (Figura 4)12. Além disso, a maioria das filiais foram encontrados para emergir da partitura SYP-EGFP, indicando que sites pré-sináptica desencadear a formação de filial (para detalhes, ver12).

Figure 1
Figura 1 . O procedimento para a preparação de um cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. (A) a vista superior de um cérebro de rato neonatal. O primeiro corte é feito paralelo à linha média (1). Em seguida, 300 - 500 μm de espessura coronais seções são cortadas do córtex visual e somatossensorial primário (2). Finalmente, faça um parasagital cortar para obter as fatias corticais (3). (B), uma representação esquemática de um coculture organotypic do tálamo e córtex cerebral. Corticais fatias de rato pós-Natal dia 2 e talâmicos quarteirões embrionário dia 15 são cocultured no filtro de membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Um diagrama esquemático de instrumentos eletrônicos para eletroporação. O estimulador, o isolador e a pipeta de eletrodos são conectados em série. Para entregar o DNA carregado negativamente, a pipeta de eletrodo está ligada ao polo negativo do isolador. As correntes elétricas para eletroporação podem ser monitoradas com o osciloscópio. TH: tálamo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Axônios de Thalamocortical em um coculture depois de 2 semanas na cultura. (F) Coexpression de SYP-EGFP com DsRed em um axônio thalamocortical (TC). Plasmídeos DsRed mais SYP-EGFP foram introduzidos em culturas de células talâmicos em 1 dia em vitro (DIV) usando electroporation. (A) um organotypic coculture de fatias talâmicos e corticais após 12 DIV. (B) A DsRed-rotulado talâmica célula estende um axônio na fatia cortical e forma ramos em camadas superiores. (C) uma imagem ampliada da região in a box no (A). (D-F) mostrar o rótulo DsRed TC axônio (D) e SYP-EGFP partitura (E) na região de (C)in a box. Observou-se discreto acúmulo de SYP-EGFP ao longo de um único axônio de TC. TH: tálamo. Barras de escala: (B) (C) a 1 mm, 100 µm e (F) 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Imagem de lapso de tempo de um axônio thalamocortical expressando SYP-EGFP e DsRed em um coculture organotypic. DsRed além de plasmídeos SYP-EGFP foram introduzidos em culturas de células talâmicos em 1 DIV usando eletroporação. Este axônio foi fotografado diariamente mais de 4 dias (11 DIV DIV 14). Barra de escala: 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo atual também é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos do desenvolvimento do crescimento de axônios, além do TC projeção11. Por exemplo, uma combinação de cultura fatia cortical e a técnica de eletroporação permite visualizar a morfologia axonal individual de neurônios corticais e observação de longo prazo9,18.

Usando o protocolo atual, os papéis de genes interessantes na formação de ramificação e sinapse do axônio também podem ser analisados pelo co expressão de proteínas fluorescentes e os genes de interesse. Normalmente, mais de 90% das células expressando proteína fluorescente são co transfected com um plasmídeo segundo quando a relação molar das soluções do plasmídeo é ajustada para 1:218,19. No entanto, a relação ideal pode ser diferente como eficácia de transfeccao co e nível de expressão são variados entre vetores.

Embora o protocolo atual é eficiente para experimentos de lapso de tempo, existem alguns problemas técnicos. Para tratamento de imagens diário, uma coculture foi colocado num palco microscópico todos os dias. Embora o desenvolvimento axonal não parecem ser afetado seriamente por diária de imagem10, cada observação deve ser concluída dentro de 10 min para minimizar a evaporação da solução de cultura e alterações no pH do meio de cultura. Como alternativa, seria melhor manter a temperatura, umidade e pH das culturas em fase microscópica12.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos também o Gabriel Hand para leitura crítica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

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References

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