एक कुशल इन विट्रो स्थानांतरण विधि द्वारा एक Transcriptionally विनियमित स्लीपिंग ब्यूटी सिस्टम एक एकीकरण दोषपूर्ण Lentiviral वेक्टर में पैक

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

इस प्रोटोकॉल transcriptionally विनियमित सो सौंदर्य प्रणाली द्वारा मानव जीनोम में ब्याज की एक जीन के स्थिर एकीकरण प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन । दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर के एकीकरण की तैयारी, इन विट्रो transduction मानव कोशिकाओं की, और transduced कोशिकाओं पर आणविक परख की सूचना है ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Benati, D., Cocchiarella, F., Recchia, A. An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector. J. Vis. Exp. (131), e56742, doi:10.3791/56742 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

सो सौंदर्य (SB) transposon जीन हस्तांतरण और कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए सिद्ध प्रभावकारिता के साथ एक गैर वायरल घालमेल प्रणाली है । SB transposon मशीनरी, एक transcriptionally विनियमित अतिसक्रिय transposase (SB100X) और टी 2 आधारित transposon का अनुकूलन करने के लिए कार्यरत हैं । आमतौर पर, transposase और transposon प्लाज्मिड अभिकर्मक और SB100X अभिव्यक्ति द्वारा क्षणिक प्रदान की जाती है एक गठित प्रमोटर द्वारा संचालित है । यहां, हम एक कुशल विधि का वर्णन करने के लिए मानव कोशिकाओं है कि कई भौतिक और रासायनिक अभिकर्मक तरीकों के लिए प्रतिरोधी रहे है sb घटकों उद्धार, SB100X अभिव्यक्ति नियंत्रण और छुरा एक "कट और पेस्ट के माध्यम से ब्याज (भारत सरकार) के एक जीन एकीकृत sb तंत्र. अतिसक्रिय transposase की अभिव्यक्ति कसकर Tet-ON प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जाता है, व्यापक रूप से १९९२ के बाद से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल. ब्याज का जीन टी 2 transposon के उल्टे दोहराता (आईआर) द्वारा पार्श्व है । दोनों SB घटकों को एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर क्षणिक HEK293T कोशिकाओं में उत्पादित में पैक कर रहे हैं । मानव कोशिकाओं, या तो सेल लाइनों या मानव ऊतक से प्राथमिक कोशिकाओं, इन विट्रो में कर रहे हैं क्षणिक transduced वायरल वैक्टर के साथ. doxycycline के अलावा संस्कृति माध्यम में (dox, टेट्रासाइक्लिन अनुरूप), एक ठीक transposase अभिव्यक्ति की ट्यूनिंग मापा जाता है और इलाज कोशिकाओं के जीनोम में ब्याज की जीन के एक लंबे समय तक चलने वाले एकीकरण में परिणाम है । इस विधि कुशल और सेल लाइन (जैसे, हेला कोशिकाओं) और प्राथमिक कोशिकाओं (जैसे, मानव प्राथमिक keratinocytes) के लिए लागू है, और इस तरह आनुवंशिक इंजीनियरिंग और चिकित्सीय जीन हस्तांतरण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

Introduction

अतिसक्रिय SB100X टी 2 के लिए युग्मित transposase आधारित transposon पहले से ही पूर्व नैदानिक जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है1,2,3, जीनोम संशोधनों4,5, और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) reprogramming6,7। आमतौर पर, SB घटकों क्षणिक प्लाज्मिड अभिकर्मक द्वारा प्रदान की जाती है और एक मजबूत गठन प्रमोटर transposase की अभिव्यक्ति ड्राइव । हालांकि, अभिकर्मक के सुधार नए तरीकों के बावजूद, दो घटक प्रणाली के वितरण के कई अनुप्रयोगों के लिए एक चुनौती बनी हुई है । इस प्रकार, एक नए वितरण प्रोटोकॉल के विकास के हित में वृद्धि हुई है । इसके अलावा प्लाज्मिड के लिए अभिकर्मक तरीके8 और mRNA9, adenoviral के आधार पर वायरल डिलिवरी10,11, adeno-एसोसिएटेड वायरल (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 और lentiviral वैक्टर15 को पूर्व में प्रस्तावित किया जा चुका है । विशेष रूप से, पसंद की प्रणाली वायरल वेक्टर के एकीकरण के बिना SB घटकों के एक परिवर्तनीय प्रसव की गारंटी चाहिए । फिर भी, transposase के गठन की अभिव्यक्ति transposon के बेकाबू rehopping के जोखिम के कारण सुरक्षा चिंताओं को उठाती है ।

इसलिए, एक परिष्कृत Tet-ऑन प्रणाली द्वारा SB100X के transcriptional विनियमन पहली चुनौती है । एक संशोधित Tet-उत्तरदायी प्रवर्तक, मूल विकसित मिनिमल cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर Timidine कळेनासे (टी) के न्यूनतम प्रमोटर (-८१) के साथ प्रतिस्थापन द्वारा प्राप्त दाद सिंप्लेक्स वायरस के जीन-1 (एचएसवी-1)16, के ऊपर क्लोन है SB100X सीडीएनए (pTetOTKSB100X) । रूपांतरित रिवर्स-टेट्रासाइक्लिन-transactivator rtTA2एस-m217 एक अलग PGK (प्लाज्मिड-pCCLएस-m2) में क्लोन मजबूत गठित प्रवर्तक (phosphoglycerate प्रमोटर, PGKrtTA2) के नियंत्रण में व्यक्त किया है । जब संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया, dox rtTA2एसM2 मॉडुलन बांधता है और Tet प्रमोटर परिसर या, कसकर SB100X अभिव्यक्ति18के विनियमित प्रेरण में जिसके परिणामस्वरूप ।

दूसरी बड़ी चुनौती कई शारीरिक और रासायनिक विधियों द्वारा मानव प्राथमिक कोशिकाओं के अकुशल अभिकर्मक से उत्पन्ना होती है. कुशलतापूर्वक मानव अभिकर्मक के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं में transposase देने के लिए, SB100X और rtTA2एसM2 अभिव्यक्ति कैसेट दो एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर में पैक कर रहे है (IDLVs)19: IDLVTKSB और IDLVrtTA2एस- m2. वायरल वैक्टर क्षणिक HEK293T कोशिकाओं में तीसरी पीढ़ी के वैक्टर के रूप में उत्पादित कर रहे हैं20 और Vescicular Stomatitis वायरस (VSV-g), जो संक्रमण का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदान की ग्लाइकोप्रोटीन जी के साथ pseudotyped. वेक्टर कणों एचआईवी द्वारा ultracentrifugation और titrated द्वारा केंद्रित कर रहे है-1 ढकोसला p24 केप्चर । सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं transduce करने के लिए, वेक्टर कणों polybrene के साथ जटिल है और उपस्थिति या dox की अनुपस्थिति में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ मशीन हैं । transduced कोशिकाओं में SB100X अभिव्यक्ति की दवा पर निर्भर सक्रियण मात्रात्मक आरटी द्वारा मापा जाता है-पीसीआर (qRT-पीसीआर)18

एक बार Tet-विनियमित SB100X अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया जाता है, भारत सरकार के स्थानांतरण (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) लक्ष्य सेल जीनोम में आणविक घटनाओं स्पष्ट रूप से Bak और Mikkelsen द्वारा schematized है21। टी 2-transposon आईआरएस (IDLVT2) के बीच क्लोन भारत सरकार के लिए एक तीसरी IDLV वेक्टर एक अभिव्यक्ति कैसेट ले जा रहा है और निर्माण के रूप में ऊपर उल्लेख पैक । अन्त में, तीन IDLV वैक्टर को कुशलतापूर्वक transduce मानव कोशिकाओं (जैसे, प्राथमिक keratinocytes) इन विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है और भारत सरकार को doxycycline18की उपस्थिति में एकीकृत कर सकते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmids तर्फ

नोट: प्लाज्मिड pCCL-PGKrtTA2एस-M2 कृपया प्रो Zappavigna (मोडेना विश्वविद्यालय और Reggio एमिलिया, मोडेना, इटली) द्वारा प्रदान की गई थी । pCMVSB100X अतिसक्रिय transposase और पीटी/BH transposon प्लाज्मिड के कोडिंग अनुक्रम ले प्लाज्मिड कृपया प्रोफेसर जेड Ivics (पॉल Ehrlich संस्थान, Langen, जर्मनी) और प्रो जेड Izvak (अधिकतम Delbruck आणविक चिकित्सा, बर्लिन के लिए केंद्र द्वारा प्रदान किए गए थे, जर्मनी) ।

  1. सभी ई कोलाई (ई. कोलाई) में क्लोनिंग के लिए, पसंद की क्लोनिंग रणनीति और प्रतिबंध एंजाइम प्रक्रिया या टुकड़ा के पीसीआर प्रवर्धन का पालन करने के लिए क्लोन किया जाएगा ।
    नोट: तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में कार्यरत सभी plasmids को सारांशित करता है । प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए एक वर्णन और संदर्भ प्रदान किए गए हैं ।

2. वायरल वेक्टर उत्पादन

नोट: सभी वायरल वैक्टर एक BSL2 में एक खतरा डाकू में उत्पादित कर रहे है सुरक्षा रोकथाम स्तर, संस्थागत नियमों और विनियमों के अनुसार ।

  1. संस्कृति अनुयाई HEK293T कोशिकाओं Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम में 10% HyClone सीरम, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, और 2 मिमी glutamine के साथ पूरक ।
  2. 0 दिन: तैयार ५ १५ cm प्लेट्स/वायरल तैयारी और बीज 5.5 x10 6 कोशिकाओं मध्यम के 30 मिलीलीटर में ।
  3. दिन 1: अभिकर्मक
    1. अभिकर्मक शुरू करने से पहले, 2x HEPES बफर खारा (एचबीएस) के १०० मिलीलीटर तैयार:
      NaCl (5 मीटर) ५.६ एमएल
      HEPES (1 मी) १०.० mL
      Na2HPO4 (०.५ मीटर) ०.३ mL
      बाँझ पानी ८४.१ mL
      ३७% एचसीएल के साथ पीएच ७.१ को समायोजित करें ।
      नोट: 2x एचबीएस 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । एक सटीक पीएच कुशल अभिकर्मक के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है । इष्टतम पीएच रेंज ७.१२ के लिए ७.१० है ।
    2. मध्यम निकालें और अभिकर्मक से पहले ताजा मध्यम 4 एच की २२.५ मिलीलीटर/
    3. Transfect HEK293T कोशिकाओं के साथ अंतरण प्लाज्मिड, pMD. Lg/pRRE. D64VInt पैकेजिंग प्लाज्मिड, द pMD2. जी लिफाफा-एंकोडिंग प्लाज्मिड, और pRSV-Rev (Table 1) के अनुसार निंन राशि/
      स्थानान्तरण प्लाज्मिड २५.०० µ छ
      pMD. Lg/pRRE. D64VInt १६.२५ µ g
      pMD2 g ८.७५ µ g
      pRSV-फिरना ६.२५ µ g
      नोट: प्लाज्मिड DNAs को Maniatis22 द्वारा वर्णित CsCl प्रोटोकॉल के अनुसार या एक endotoxin-मुक्त प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग करके तैयार किया जाता है ।
      1. ५६.२५ डीएनए के µ g reसस्पेंड (4 plasmids के मिश्रण) में १.१२५ मिलीलीटर बाँझ पानी और जोड़ें १२५ µ एल के २.५ M CaCl2 (समाधान A) ।
      2. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब (समाधान बी) के लिए 2x एचबीएस के १.२५० मिलीलीटर जोड़ें ।
      3. एक 1 या 2 मिलीलीटर पिपेट (अभिकर्मक समाधान, कुल मात्रा २.५०० मिलीलीटर) के साथ bubbling जबकि समाधान एक (१.२५० एमएल) बी (१.२५० एमएल) dropwise करने के लिए जोड़ें ।
      4. कमरे के तापमान (आरटी) में 20 मिनट के लिए मशीन ।
      5. एक P1000 micropipette का उपयोग कर, सभी अभिकर्मक समाधान (२.५०० एमएल) सेल monolayer dropwise के लिए वितरित करें ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2में एक सेल संस्कृति मशीन में रातोंरात मशीन ।
  4. 2 दिन: मध्यम निकालें और ताजा मध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें (२.१ कदम देखें) ।
  5. 3 दिन: लीजिए और lentiviral कण-युक्त supernatant ध्यान केंद्रित ।
    1. लीजिए supernatant (~ ७० एमएल) से सभी (n = 5) transfected सेल प्लेट्स, एक ०.४५ µm PESS फिल्टर के माध्यम से फिल्टर और भरने 2 polyallomer ट्यूबों (1 इंच x ३.५ इंच)/viral तैयारी ।
    2. ultracentrifugation द्वारा वेक्टर कणों को १०६,००० x g पर २.५ h के लिए, ब्रेक के साथ 15 डिग्री सेल्सियस पर ध्यान दें ।
    3. तुरंत ultracentrifugation रोकने के बाद (के लिए ट्यूब में गोली के निलंबन से बचने के लिए), धीरे एक 10% ब्लीच युक्त कंटेनर में supernatant डालना और 2 १०० में बमुश्किल दिखाई छर्रों निलंबित 1x पंजाबियों (+ 1% BSA) के µ एल । यह गोली के रूप में सामांय है स्पष्ट और बहुत छोटा है । -८० ° c पर केंद्रित वेक्टर हौसले से तैयार है, या aliquot और स्टोर वायरल तैयारी का उपयोग करें ।
      सावधानी: supernatant में lentiviral कण होते हैं, जो कि इस तरह के जोखिम कचरे में छोड़े जाने से पहले ब्लीच किया हुआ होना चाहिए ।
  6. वायरल वेक्टर तैयारी अनुमापन करने के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक एचआईवी-1 ढकोसला p24 केप्चर किट का उपयोग करें ।
    नोट: वायरल वेक्टर उत्पादन का मानकीकरण करने के लिए, liposomes आधारित एजेंट नियोजित किया जा सकता है । फिर भी, वायरल वेक्टर titer अभिकर्मक दक्षता और प्लाज्मिड डीएनए की शुद्धता पर अत्यधिक निर्भर है ।

३. मानव कोशिका रेखाओं का Transduction (उदा., हेला कोशिकाएँ)

नोट: हेला कोशिकाओं Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, और 2 मिमी glutamine के पूरक में संस्कृति रहे हैं । तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में कार्यरत सभी वैक्टर को सारांशित करता है । प्रत्येक वेक्टर के लिए एक विवरण प्रदान की गई है । हेला कोशिकाओं के Transduction दो IDLV वैक्टर का सबसे अच्छा खुराक संयोजन में एसबी transposase के transcriptional विनियमन के सत्यापन की अनुमति देता है । IDLV खुराक की भिन्नता वेक्टर कण अनुमापन और लक्ष्य सेल प्रकार से संबंधित हो सकता है ।

  1. 0 दिन: बीज 2x10 एक 6-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह के लिए मध्यम के 3 मिलीलीटर में5 कोशिकाओं । 4 कुओं को तैयार करें ।
  2. दिन 1: हेला कोशिकाओं के Transduction ।
    1. प्रत्येक स्थिति के लिए, 1 मिलीलीटर मध्यम के अंतिम खंड के लिए lentiviral वैक्टर पतला (ऊपर नोट देखें) की उपस्थिति में 10 μL की polybrene (अंतिम एकाग्रता 8 μg/
      अच्छी तरह से #1 के लिए कमजोर पड़ने: नकली transduced कोशिकाओं (नकारात्मक नियंत्रण) ।
      अच्छी तरह से #2 के लिए कमजोर पड़ने: IDLVTKSB सदिश (२,६०० p24 के एनजी) ।
      कुओं के लिए कमजोर पड़ने #3, #4: IDLVTKSB वेक्टर (p24 के २,६०० एनजी) + IDLVrtTA2s-M2 सदिश (९,६०० p24 के एनजी) ।
    2. एक अच्छी तरह से जहां हेला कोशिकाओं 0 दिन में चढ़ाया गया और इसी अच्छी तरह से lentiviral वेक्टर कमजोर पड़ने जोड़ने से मध्यम निकालें ।
    3. Spinoculate 6-well प्लेट 20-25 ° c में ४५ मिनट के लिए ७५४ x g पर, और फिर 6-well प्लेट ३७ ° c और 5% CO2पर एक सेल कल्चर मशीन के लिए स्थानांतरण ।
    4. 6 घंटे के बाद, सभी कुओं में ताजा माध्यम के साथ वैक्टर युक्त माध्यम की जगह है और अच्छी तरह से #4 में 1 माइक्रोन के लिए doxycycline जोड़ें । ४८ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति मशीन में थाली रखो ।
  3. 3 दिन: आरएनए निष्कर्षण के लिए सेल गोली की तैयारी ।
    1. कक्षों को अलग करने से पहले, एक trypsin कार्य समाधान (1x) तैयार करें:
      २.५% Trypsin (10x) ५.० एमएल
      ५०० मिमी EDTA (अंतिम एकाग्रता = 5 मिमी) ०.५ मिलीलीटर
      1x पंजाबस ४४.५ mL
    2. उपयोग करने से पहले ३७ ° c पर गर्म trypsin काम समाधान । 4 डिग्री सेल्सियस पर काम समाधान trypsin स्टोर ।
    3. 1x पंजाबियों के साथ मीडियम और वॉश सेल निकालें । जोड़ने के पूर्व के ०.५ मिलीलीटर ३७ ° c trypsin काम कर रहे समाधान के लिए एक अच्छी तरह से और के लिए ३७ ° c में मशीन 7 मिनट (एक कोशिका संस्कृति मशीन में) ।
    4. मशीन के बाद, एक अच्छी तरह से trypsin को निष्क्रिय करने और एक केंद्रापसारक ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए सीरम युक्त मध्यम के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें । 1x पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ एक बार अच्छी तरह कुल्ला, और २४० x g पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक
    5. 1x पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं, २४० x जी पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । -८० डिग्री सेल्सियस पर ताजा एकत्र सेल छर्रों या स्टोर का उपयोग करें । कुल आरएनए से निकालने के लिए अर्द्ध मात्रात्मक आर-पीसीआर प्रदर्शन (6 कदम देखें) ।

४. मानव प्राथमिक कोशिकाओं का Transduction (उदा., keratinocytes)

नोट: मानव प्राथमिक keratinocytes घातक विकिरणित 3T3-J2 कोशिकाओं (फीडर परत)23, यान Barrandon (EPFL, लौसने, स्विट्जरलैंड) से एक तरह का उपहार पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।

  1. विकसित स्विस माउस 3T3-J2 कोशिकाओं Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम में 10% दाता गोजातीय सीरम, ५० यू/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, और 4 मिमी glutamine (3T3 माध्यम) के साथ पूरक ।
  2. बढ़ती keratinocytes cFAD माध्यम में घातक विकिरणित 3T3-J2 कोशिकाओं पर चढ़ाया, एक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और हैम F12 मीडिया मिश्रण (3:1) भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त (10%), पेनिसिलिन-streptomycin (1%), glutamine (2%), इंसुलिन (5 µ g/एमएल), adenine ( ०.१८ मिमी), hydrocortisone (०.४ µ ग्राम/एमएल), हैजा विष (०.१ एनएम), और ट्राईआयोडोथायरोनिन (2 एनएम) ।
  3. 0 दिन: बीज 3x105 घातक ढंग से विकिरणित 3T3-J2 कोशिकाओं, पहले 3T3 माध्यम में पतला 1X10 के एक अंतिम एकाग्रता के लिए5 कोशिकाओं/एमएल, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में । 9 कुओं को तैयार करें ।
  4. दिन 1: प्राथमिक keratinocytes के Transduction
    नोट: Transduction ऑफ keratinocytes दो transposase वैक्टर (IDLV-पीसीआर) के सर्वश्रेष्ठ खुराक संयोजन में एसबी qRT के transcriptional विनियमन के ठहराव की अनुमति देता है और भारत सरकार के एकीकरण (GFP) को लक्षित कक्षों में सत्यापित करने के लिए (cytofluorimetric द्वारा विश्लेषण).
    1. कक्षों को अलग करने से पहले, trypsin कार्य समाधान तैयार करें:
      ०.५% Trypsin-EDTA (10x) ५.० mL
      500mM EDTA (अंतिम एकाग्रता = 5 मिमी) ०.५ मिलीलीटर
      1x पंजाबस ४४.५ mL
    2. उपयोग करने से पहले ३७ ° c पर गर्म trypsin काम समाधान । 4 डिग्री सेल्सियस पर काम समाधान trypsin स्टोर ।
    3. संस्कृति में subconfluent keratinocytes को अलग करने के लिए, मध्यम निकालें, 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने और प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व गर्म trypsin काम समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें । सेल संस्कृति मशीन में 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    4. मशीन के बाद, एक अच्छी तरह से अच्छी तरह से reसस्पैंड और एक केंद्रापसारक ट्यूब के लिए सेल निलंबन के हस्तांतरण के 2 मिलीलीटर युक्त (यदि कई कोशिकाओं अभी भी जुड़े हुए हैं, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त मिनट के लिए मशीन संलग्न) । 1x पंजाबियों या ताजा माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से एक बार कुल्ला और सेल निलंबन के साथ केंद्रापसारक ट्यूब के लिए कुल्ला समाधान जोड़ें ।
    5. ५८० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    6. 1x पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं, ५८० x जी पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    7. एक 15 मिलीलीटर में ट्यूब, पतला 1.6 x105 keratinocytes cFAD मध्यम, प्रत्येक हालत के लिए एक कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर में ।
    8. polybrene के 20 μL की उपस्थिति में cFAD मध्यम के 1 मिलीलीटर में lentiviral वैक्टर पतला (8 µ जी की अंतिम एकाग्रता) 2 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में):
      कुओं #1, #2, #3 के लिए कमजोर पड़ने: नकली transduced कोशिकाओं (वैक्टर के बिना नकारात्मक नियंत्रण) ।
      कुओं #4 के लिए कमजोर पड़ने, #5: IDLVTKSB वेक्टर (p24 के १३,००० एनजी) + IDLVrtTA2s-M2 सदिश (४८,००० p24 के एनजी) ।
      कुओं के लिए कमजोर पड़ने #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB वेक्टर (p24 के १३,००० एनजी) + IDLVrtTA2s-M2 सदिश (४८,००० p24 के एनजी) + IDLVT2 वेक्टर (९,१६० p24 के एनजी) ।
    9. प्रत्येक lentiviral वेक्टर कमजोर पड़ने (1 एमएल) को इसी keratinocyte सस्पेंशन (1.6 x105 keratinocytes में 1 एमएल) में जोड़कर सस्पेंशन में Transduce सेल करें ।
    10. मध्यम को घातक रूप से विकिरणित 3T3-J2 कोशिकाओं को दिन में वरीयता प्राप्त 0 और प्लेट transduced keratinocytes (1.6 x105 keratinocytes में 2 मिलीलीटर) उन पर । transducing के बाद एक अच्छी तरह से अगले एक के साथ आगे बढ़ना ।
    11. 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन, और फिर सेल संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं 6 ज के लिए स्थानांतरण
      नोट: प्राथमिक keratinocytes spinoculate न करें, क्योंकि व्यवहार्यता और प्रसार दृढ़ता से प्रभावित होंगे ।
    12. 6 एच के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से cFAD मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । कुओं #5, #8, और #9 में 1 माइक्रोन doxycycline (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को वापस ।
  5. Day 2: cFAD मीडियम को 3 एमएल के साथ 10 एनजी/एमएल EGF के साथ बदलें ।
  6. 3 दिन: Trypsinize और कुओं से धो कोशिकाओं #1, #4, और #5 पहले वर्णित के रूप में (4.4.6 को निमा देखें) । -८० ° c पर सेल छर्रों फ्रीज qRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए कुल आरएनए निकालने के लिए (चरण 7 देखें).
  7. Trypsinize कक्षों को अच्छी तरह से #2, #6, और #8 चरण में वर्णित के रूप में 4.4.5 करने के लिए निमा और GFP व्यंजक के लिए cytofluorimetric विश्लेषण निष्पादित करें (चरण 5 देखें) ।
  8. कुओं से संस्कृति रखो #3, #7, और #9 कम 3-4 दोहरीकरण के लिए, संयुक्त राष्ट्र एकीकृत IDLVT2 वेक्टर पतला करने के लिए पर्याप्त (मानव प्राथमिक फीडर परत पर चढ़ाया keratinocytes के लिए 5 दिन) ।
  9. 6 दिन: लगभग 5 दिन पोस्ट transduction, trypsinize कक्ष (देखें चरण निमा से 4.4.5 तक) #3, #7, और GFP अभिव्यक्ति के लिए cytofluorimetric विश्लेषण करने के लिए #9 (चरण 5 देखें) ।
    नोट: प्रयोग समय और transduction दक्षता उच्च प्राथमिक सेल प्रकार और एकत्र नमूनों की परिवर्तनशीलता द्वारा प्रभावित कर रहे हैं ।

5. transduced प्राथमिक keratinocytes पर Cytofluorimetric विश्लेषण

नोट: एक प्रवाह cytometer एक नीली लेजर (४८८ एनएम), एक लाल लेजर (६३३ एनएम) और GFP और APC प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए फिल्टर के साथ विन्यस्त ( सामग्री तालिकादेखें) कार्यरत है ।

  1. 3T3-J2 फीडर लेयर से भेदभाव keratinocytes करने के लिए, लैबल transduced keratinocytes रेग्युलेटर को दिन में 3 और दिन 6 (देखें कदम ४.७ और ४.९) माउस मोनोक्लोनल APC-संयुग्मित विरोधी फीडर एंटीबॉडी के साथ ।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए धुंधला बफ़र के 4 मिलीलीटर तैयार करें:
      5% FBS २०० μL
      ५०० मिमी EDTA (अंतिम एकाग्रता = २.५ मिमी) 20 μL
      पंजाबियों 1x ३७८० μL
    2. धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर के साथ अलग कोशिकाओं धो लें । ५८० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    3. प्रवाह cytometry अधिग्रहण के लिए एक ट्यूब में, दाग बफर के १०० μL में 5x104 कोशिकाओं को पुनः निलंबित और विरोधी फीडर एंटीबॉडी (1:50) के 2 μL जोड़ें । अच्छी तरह से मिश्रण और अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
    4. 30 मिनट के बाद, धुंधला बफर के 2 मिलीलीटर के साथ धो लो । ५८० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । धुंधला बफर के २०० μL में reसस्पैंड ।
    5. cytofluorimetric विश्लेषण द्वारा APC और GFP संकेतों को प्राप्त18. GFP+ सेल अंश सुरक्ष- कोशिका जनसंख्या के transduced keratinocytes को इंगित करता है.
      नोट: यदि वांछित, paraformaldehyde में 2% के साथ cytometry प्रवाह से पहले सना हुआ नमूना तय 1x और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान में चलाने तक ।
  2. समापन बिंदु पर GFP+कक्षों के प्रतिशत के बीच अनुपात प्लॉट करके प्रवाह cytometry डेटा का विश्लेषण करें (5 दिन) और GFP+कक्षों का प्रतिशत 2 दिनों के बाद transduction, IDLVT2-transduced के अवशिष्ट स्तर को सामान्यीकृत किया गया कोशिकाओं.

6. अर्द्ध मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

नोट: एक पीसीआर थर्मल साइकिल चालक का उपयोग करें ।

  1. एक आरएनए शुद्धि किट का उपयोग कर transduced या नियंत्रण कोशिकाओं से कुल आरएनए निकालने, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार.
    नोट: कुल आरएनए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, कुल आरएनए के १०० एनजी और एक रिवर्स transcriptase किट का उपयोग कर एक 20 µ एल प्रतिक्रिया में संश्लेषित सीडीएनए ।
    नोट: सीडीएनए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. डिजाइन SB100X, rtTA2s-M2 और GAPDH (एक गृह व्यवस्था जीन) के लिए विशिष्ट प्राइमर ।
    सुझाए गए डिज़ाइन:
    SB फॉरवर्ड प्राइमर: 5 '-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3 '
    एसबी रिवर्स प्राइमर: 5 '-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3 '
    rtTAM2 आगे प्राइमर: 5'-GACGACAAGGAAACTCGCTC-3 '
    rtTAM2 रिवर्स प्राइमर: 5 '-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3 '
    GAPDH फॉरवर्ड प्राइमरी: 5 '-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
    GAPDH रिवर्स प्राइमर: 5 '-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 '
  4. ५० µ एल के एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में पीसीआर प्रदर्शन विशेष रूप से, प्रत्येक पीसीआर ट्यूब निंनलिखित प्रतिक्रिया में इकट्ठा:
    सीडीएनए (1:5 कमजोर पड़ने) (से कदम ६.२) १.०० µ l
    फॉरवर्ड प्राइमरी (10 µ मी स्टॉक) १.०० µ l
    रिवर्स प्राइमर (10 µ मी स्टॉक) १.०० µ l
    dNTPs (10 µ m स्टॉक) १.०० µ l
    बफर (+ MgCl2) (10x स्टॉक) ५.०० µ l
    Taq पोलीमरेज़ (5 U/µ l stock) ०.२५ µ l
    बाँझो पानी ४०.७५ µ l
  5. थर्मल साइकिल चालक के निंनलिखित कार्यक्रम का प्रयोग करें: 1 चक्र के लिए ९५ ° c पर 5 मिनट के लिए फिर ९५ ° c के साथ आगे बढ़ना 30 s, ५८ ° c के लिए 30 s, और ७२ ° c के लिए 30 s के लिए ३४ साइकिल के लिए SB100X, rtTA2 के लिए ३२ साइकिलs-M2 , और GAPDH के लिए 25 चक्र ।
  6. 1% agarose जेल तैयार करें । TBE 1x के १०० मिलीलीटर में agarose के 1 जी भंग (10x स्टॉक बाँझ पानी में पतला), एक चोंच या कुप्पी में । एक माइक्रोवेव में पिघल, हर मिनट घूमता है जब तक agarose पूरी तरह से घुल गया है । पिघल agarose ठंडा जब तक यह लगभग ५० डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, और फिर ethidium ब्रोमाइड के 5 µ एल जोड़ें (10 मिलीग्राम/ जेल कास्टिंग के लिए, एक कंघी के साथ एक इकट्ठे जेल ट्रे में पिघला agarose डालो ।
  7. लोड नमूने (10 µ एल प्रत्येक) agarose जेल पर और प्रदर्शन ट्रो.
  8. यदि वांछित, जेल चित्र प्राप्त करने और पीसीआर बैंड पर densitometric विश्लेषण करते हैं ।

7. मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (qRT-पीसीआर)

नोट: एक वाणिज्यिक अनुक्रम का पता लगाने प्रणाली कार्यरत है । glyceraldehyde 3-फास्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) के लिए पीसीआर प्राइमरों और 6-carboxyfluorescein (FAM) जांच व्यावसायिक रूप से खरीदे जाते हैं ।

  1. रेट्रो प्रतिलेखन के लिए, चरण ६.२ देखें ।
  2. SB100X के लिए विशिष्ट डिजाइन प्राइमरों और जांच के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
    सुझाए गए डिज़ाइन:
    SB .2 आगे प्राइमर: 5 '-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3 ',
    SB .2 रिवर्स प्राइमर: 5 '-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3 '
    जांच एसबी FAM: 5 '-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3 '
  3. ९६-अच्छी तरह से एक पीसीआर मास्टर मिश्रण और प्राइमर + जांच मिश्रण के साथ प्लेटों में वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन 25 µ एल की एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में विशेष रूप से, प्रत्येक कुआं के लिए निंनलिखित प्रतिक्रिया पर विचार करें:
    सीडीएनए (1:10 बाँझ पानी में कमजोर पड़ने) १.०० µ l
    2x मास्टर मिक्स १२.५० µ एल
    प्राइमरी + 20x की जांच मिक्स १.२५ µ l
    बाँझो पानी १०.२५ µ l
    नोट: तपसिल में सभी प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन । pipetting त्रुटियों को रोकने के लिए, एक मिश्रण के लिए कम n + 3 प्रतिक्रियाओं (बिना सीडीएनए) तैयार करते हैं । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग Aliquot ।
  4. रीयल-टाइम पीसीआर निम्न प्रोग्राम का उपयोग करके चलाएँ: 1 चक्र के लिए ९५ ° c 10 मिनट, उसके बाद ४० चक्र के लिए 15 एस और ६० ° c 1 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़.
  5. 2-सीडीएनएसीटी ΔΔ द्वारा समान ठहराव नमूना के GAPDH के स्तर तक SB100X के सापेक्ष व्यंजक (RQ value) को सामान्य करके qRT-पीसीआर डेटा का विश्लेषण करें, विशिष्ट डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का प्रयोग, तीन IDLV विनियमित sb घटकों (SB100X, rtTA2एस-M2 और टी 2-GFP transposon) ले जाने वैक्टर पैक किया गया और कुशलतापूर्वक उद्धार और कसकर मानव कोशिकाओं में SB प्रणाली को विनियमित करते थे । चित्र 1a हेला कोशिकाओं के इन विट्रो transduction के लिए एक योजना से पता चलता है, जो दो IDLV वैक्टर का सबसे अच्छा खुराक संयोजन के साथ SB transposase के transcriptional विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया था ( 2 तालिकामें रिपोर्ट). SB100X के transcriptional विनियमन qRT-पीसीआर द्वारा मापा गया था (चित्र 1b) और एक रिश्तेदार मात्रा (RQ) के रूप में की योजना बनाई ऑफ राज्य (IDLVTKSB अकेले RQ = 1) के संबंध में मूल्य । transduced हेला कोशिकाओं में, पृष्ठभूमि (IDLVTKSB) पर SB100X अभिव्यक्ति की एक 8 गुना सक्रियण (+ dox) प्राप्त किया गया था । विशेष रूप से, dox के अभाव में cotransduced हेला कोशिकाओं transposase अभिव्यक्ति से बाहर राज्यों के लिए तुलनीय दिखाया, TetTKs-M2 मॉडुलन द्वारा rtTA2 प्रमोटर की एक तंग नियंत्रण का संकेत है ।

Figure 1
चित्रा 1: transcriptionally की अभिव्यक्ति के लिए हेला कोशिकाओं के Transduction-विनियमित SB transposase IDLV वैक्टर द्वारा किए गए । (क) के लिए एक योजना इन विट्रो transduction हेला कोशिकाओं के IDLVs के साथ transposase की अभिव्यक्ति के लिए. (ख) qRT-पीसीआर हेला कोशिकाओं का विश्लेषण IDLVTKSB (p24 के २,६०० एनजी) की उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति (IDLVrtTA2 के p24एस-M2 (९,६०० एनजी) और 1 µ एम doxycycline (dox) के transduced के साथ । डैश्ड रेखा काफी अलग मान (* * * P < ०.००५) दिखा रहा है नमूनों को जोड़ता है । प्रयोग तपसिल में किया गया । मतलब एस. ई. एम त्रुटि पट्टियों के रूप में दिखाया गया है । (Cocchiarella, एफ. एट अल., २०१६18) से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 2 transposase के इष्टतम transcriptional विनियमन तक पहुंचने के लिए सेट अप खुराक को लेकर पता चलता है. हेला कोशिकाओं को बढ़ती खुराक के साथ transduced थे (१३०, २६०, और p24 के २,६०० एनजी) IDLVrtTA2 के साथ संयोजन में IDLVTKSB के (९६० और ९,६०० p24 के एनजी), उपस्थिति या dox की अनुपस्थिति में. अर्द्ध मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण स्पष्ट रूप से पता चलता है कि दोनों IDLVs की उच्च खुराक दृढ़ता से SB100X अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए आवश्यक थे । अलग लक्ष्य सेल प्रकार और वायरल वेक्टर अनुमापन में रूपांतरों समर्थन-इष्टतम SB अभिव्यक्ति में परिणाम हो सकता है, और हम इसलिए खुराक की स्थापना प्रयोगों प्रदर्शन की सिफारिश.

Figure 2
चित्र 2: IDLV खुराक दो IDLVs के इष्टतम खुराक संयोजन को परिभाषित करने के लिए हेला कोशिकाओं में प्रयोग की स्थापना. हेला कोशिकाओं पर अर्द्ध मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण IDLVTKSB सदिश के विभिंन खुराकों के साथ सह transduced (१३०, २६०, और p24 के २,६०० एनजी) के अभाव में या IDLVrtTA2s-M2 सदिश की उपस्थिति (९६० और ९,६०० p24 के एनजी) और dox । GAPDH एक मानक नियंत्रण के रूप में परिलक्षित किया गया । SB100X transposase और rtTA2s-M2 व्यंजक सभी परीक्षण स्थितियों में रिपोर्ट की गई हैं; नेकां = नकारात्मक नियंत्रण । (Cocchiarella, एफ. एट अल., २०१६18) से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

transcriptional विनियमित SB प्रणाली भी प्राथमिक कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से उन कोशिकाओं मानव प्राथमिक keratinocytes के रूप में कई अभिकर्मक विधियों, के लिए प्रतिरोधी में । चित्रा 3 J2 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए IDLV की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, विनियमित SB घटकों को ले जाने के साथ विकिरणित 3T3-dox फीडर परत पर खेती प्राथमिक keratinocytes के transduction के लिए एक योजना से पता चलता है ।

Figure 3
चित्रा 3: transcriptionally की अभिव्यक्ति के लिए IDLV वैक्टर के साथ मानव प्राथमिक keratinocytes के निलंबन में Transduction-विनियमित SB transposase और transposon. के लिए एक योजना इन विट्रो transduction मानव प्राथमिक keratinocytes के IDLVs के साथ व्यक्त करने के लिए transcriptionally-विनियमित एसबी transposase और transposon, उपस्थिति या अनुपस्थिति में 1 µ m dox. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 4a में qRT-पीसीआर विश्लेषण से पता चलता है कि transposase और मॉडुलन वैक्टर का सबसे अच्छा खुराक संयोजन, तालिका 2 में रिपोर्ट, ऑफ-स्टेट (-dox) पर एसबी अभिव्यक्ति की 15-गुना सक्रियण के परिणामस्वरूप. स्थानांतरण प्रयोग keratinocytes transduced में तीन IDLV वैक्टर (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 और IDLVT2) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में dox के साथ किया गया था । भारत सरकार की अभिव्यक्ति (GFP) टी 2 द्वारा beard-transposon, APC- डिब्बे में, प्रवाह cytometer विश्लेषण द्वारा मापा गया था २ दिनों के बाद transduction (डीपीटी) और संस्कृति के endopoint पर (5 मानव प्राथमिक keratinocytes के लिए दिन). समापन बिंदु पर पहुंच गया था जब एकीकृत टी 2-GFP transposon एक मुश्किल से पता लगाने के स्तर को गिरा दिया (एक औसत ०.६%) सेल प्रभाग-निर्भर कमजोर पड़ने के कारण । चित्रा 4B समापन बिंदु पर APC- डिब्बे में GFP+ कोशिकाओं के प्रतिशत के बीच अनुपात और 2 दिनों के बाद transduction, अकेले transposon के अवशिष्ट स्तर को सामान्यीकृत दिखाता है । यह व्यक्त भारत सरकार के छुरा अपने जीनोम में एकीकृत, मानव प्राथमिक keratinocytes के लिए 12% से कम मूल्यांकन की मेजबानी कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है ।

Figure 4
चित्रा 4: transduced मानव प्राथमिक keratinocytes में transposase और GFP की अभिव्यक्ति का विश्लेषण. (क) qRT-पीसीआर की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 1 IDLVrtTA2S m µ के IDLVTKSB और dox-M2 के साथ प्राथमिक keratinocytes transduced पर (ख) IDLVs की उपस्थिति या अनुपस्थिति में transposase अभिव्यक्ति के लिए IDLVT2 transposon और dox के साथ प्राथमिक keratinocytes की सह-transduction. Y-अक्ष पर,% GFP+ कक्ष 5dpt/% GFP+ कक्ष 2 डीपीटी * १०० (दो प्रयोगों का ± SEM) । * * काफी अलग मान दिखाएँ (P < ०.०५). (Cocchiarella, एफ. एट अल., २०१६18) से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्लाज्मिड विवरण संदर्भ
pCCL-TetOTKSB स्थानांतरण प्लाज्मिड IDLVTKSB वेक्टर उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । यह pTetOTKSB से व्युत्पंन प्लाज्मिड, pCCL lentiviral रीढ़ में TetOTKSB क्लोनिंग के बाद । 18, 20
pCCL-PGKrtTA2S-M2 स्थानांतरण प्लाज्मिड IDLVrtTA2एस-M2 वेक्टर उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । प्रो वी Zappavigna द्वारा प्रदान की गई
pCCL-T2GFP स्थानांतरण प्लाज्मिड IDLVT2 वेक्टर उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । इस प्लाज्मिड pT2GFP से व्युत्पंन, टी 2 के बीच GFP क्लोनिंग के बाद pCCL lentiviral रीढ़ में transposon आईआरएस । 18, 20
pMD. Lg/pRRE. D64VInt IDLV वेक्टर उत्पंन करने के लिए पैकेजिंग प्लाज्मिड । 19
pMD2. जी VSV-G लिफाफा के लिए प्लाज्मिड कोडिंग lentiviral वेक्टर उत्पंन करने के लिए । 20
pRSV-फिरना Rev प्लाज्मिड lentiviral वेक्टर उत्पंन करने के लिए । 20
वेक्टर विवरण
IDLVTKSB Tet-उत्तरदायी टी प्रमोटर के नियंत्रण में SB100X की अभिव्यक्ति के लिए एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वेक्टर ।
IDLVrtTA2एस-M2 एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वेक्टर PGK प्रमोटर के नियंत्रण के तहत rtTA2s-M2 संग्राहक की अभिव्यक्ति के लिए ।
IDLVT2 टी 2-transposon आईआरएस के बीच क्लोन भारत की अभिव्यक्ति के लिए एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वेक्टर ।

तालिका 1: Plasmids और वैक्टर इस प्रोटोकॉल में कार्यरत. वर्णन और संदर्भ प्रदान किए गए हैं ।

वैक्टर हेला (2x105 cells) Keratinocytes (1.6 x105 कोशिकाएं)
IDLVTKSB २,६०० एनजी p24 १३,००० एनजी p24
IDLVrtTA2एस-M2 ९,६०० एनजी p24 ४८,००० एनजी p24
IDLVT2 ९,१६० एनजी p24

तालिका 2: हेला कोशिकाओं और मानव प्राथमिक keratinocytes के transduction के लिए अनुकूलित वेक्टर खुराक ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां, हम एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करने के लिए छुरा सो सौंदर्य-मध्यस्थता स्थानांतरण द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं के जीनोम में एक भारत सरकार को एकीकृत । हालांकि एसबी प्रणाली जीनोम संपादन के लिए एक वायरल विधि प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था, एकीकरण मशीनरी (transposase और टी 2 transposon) के कुशल वितरण अनिवार्य है । इसलिए, शायद ही transfectable प्राथमिक कोशिकाओं पर sb प्रणाली का उपयोग करने के लिए, sb घटकों के एक वायरल वितरण हाल के वर्षों में10,12,15का पीछा किया गया था । हालांकि, वायरल वैक्टर में से कोई भी अब transposase के गठन की अभिव्यक्ति के मुद्दे को संबोधित किया है कि transposon के बेकाबू rehopping के जोखिम में परिणाम सकता है ।

transcriptionally transposase अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए, हमने एक संशोधित Tet-ऑन सिस्टम16का लाभ लिया । न्यूनतम टी प्रवर्तक TetO तत्व से जुड़े, dox की उपस्थिति में rtTA2s-M2 मॉडुलन करने के लिए बाध्य पर, एक ठीक पृष्ठभूमि (ऑफ-स्टेट, dox के अभाव में) पर transposase सक्रियण की ट्यूनिंग से संमानित । विनियामक प्रदर्शन उपयुक्त IDLVs (IDLVTKSB और IDLVrtTA2s-M2) वेक्टर खुराक संयोजन और सेल प्रकारों (उदा., हेला कोशिकाओं और मानव प्राथमिक keratinocytes) पर निर्भर करता है । स्वतंत्र रूप से लक्ष्य कोशिकाओं से, वेक्टर खुराक कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना लक्ष्य कोशिकाओं के transduction के उच्चतम स्तर को सुनिश्चित करना चाहिए, इस प्रकार एक वृद्धि खुराक-हेला कोशिकाओं में संयोजन प्रयोग (या अन्य सेल लाइनों) इष्टतम खुराक को परिभाषित करने के लिए, द्वारा अर्द्ध मात्रात्मक RT-पीसीआर, दृढ़ता से सुझाव दिया है ।

भारत सरकार के स्थानांतरण का मूल्यांकन प्राथमिक कक्षों में किया गया । मानव प्राथमिक keratinocytes पर वरीयता प्राप्त विकिरणित 3T3-J2 फीडर परत 3 transduced के साथ IDLVs थे (IDLVTKSB, IDLVrtTA2एस-M2 और IDLVT2) पर प्रयोग के रूप में परिभाषित खुराक. transposase के एक स्पष्ट dox निर्भर सक्रियण qRT-पीसीआर द्वारा प्रदर्शन किया गया था । इसके अलावा, भारत सरकार के स्थिर एकीकरण की उपस्थिति या dox की अनुपस्थिति में transduced कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति के cytofluorimetric विश्लेषण द्वारा प्रदर्शन किया गया था, IDLV विनियमित एसबी वाहन के लिए transcriptionally मंच रोजगार की संभावना का संकेत प्राथमिक कोशिकाओं के घटकों, और लक्ष्य कोशिकाओं के जीनोम में एक भारत सरकार के सफल एकीकरण ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम IDLV वेक्टर उत्पादन और इष्टतम दक्षता और वेक्टर खुराक संयोजन पर लक्ष्य कोशिकाओं के transduction हैं । HEK293T कोशिकाओं की कम अभिकर्मक क्षमता कम वेक्टर उपज में परिणाम हो सकता है । IDLVTKSB और IDLVrtTA2 के खुराक की परिभाषा-M2 के अभाव में उच्च leakiness में परिणाम हो सकता है कि Tet-ON घटक के एक असंतुलित होने से बचने के लिए आवश्यक है TetOTK प्रमोटर के dox उपचार पर कम गुना प्रेरण में । इन महत्वपूर्ण चरणों मामूली संशोधनों द्वारा संबोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, अभिकर्मक प्रोटोकॉल वाणिज्यिक अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग मानकीकृत किया जा सकता है । transduction प्रोटोकॉल ब्याज की कोशिका प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए, विशेष रूप से विचार है कि spinoculation कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना transduction क्षमता बढ़ जाती है । वैक्टर और polybrene लक्ष्य कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है और 6 घंटे या रात के बाद गर्मी के बाद ताजा माध्यम से बदल दिया । यह भी ध्यान देने योग्य है कि GFP+ कोशिकाओं का प्रतिशत 5 दिनों के बाद transduction IDLVs की पृष्ठभूमि एकीकरण से प्रभावित हो सकता है लायक है ।

इस विधि की एक छोटी सी सीमा है कि IDLV वैक्टर HEK293T कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा क्षणिक उत्पादन कर रहे हैं । वेक्टर खुराक के आधार पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए, दोहराया वेक्टर प्रोडक्शंस की आवश्यकता है । एक दूसरी सीमा भारत सरकार की लंबाई से संबंधित है, क्योंकि IDLV वेक्टर की कार्गो क्षमता लगभग 8 kb है ।

अंत में, इस विधि यहां transcriptionally विनियमित sb घटकों IDLV वैक्टर, जो, मौजूदा तरीकों के बीच में sb प्रणाली देने के लिए, tropism और उच्च transduction दक्षता की एक व्यापक रेंज दिखाने में पैक के माध्यम से एक भारत सरकार के एकीकरण की अनुमति देता है । इसके अलावा, संशोधित Tet-ऑन सिस्टम SB100X अभिव्यक्ति के एक transcriptional विनियमन परमिट, transposon के जोखिम में एक प्रासंगिक मुद्दा फिर से hopping या एकाधिक धारावाहिक स्थानांतरण घटनाओं में अगर वे आवश्यक हैं । इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों के सेल लाइनों के जीनोम इंजीनियरिंग शामिल (जैसे, हेला कोशिकाओं, HEK293 कोशिकाओं) वायरल वैक्टर के लिए स्थिर पैकेजिंग कोशिकाओं को स्थापित करने के लिए, और नैदानिक प्रासंगिक प्राथमिक कोशिकाओं में चिकित्सीय जीन के एकीकरण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मोडेना-pCCLएस-M2 PGKrtTA2 के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रो Zappavigna, विश्वविद्यालय मोडेना और Reggio एमिलिया, प्लाज्मिड, इटली के लिए धन्यवाद । हम यह भी स्वीकार करते है प्रो जेड Ivics (पॉल Ehlrich संस्थान, Langen, जर्मनी) और प्रो जेड Izvak (मैक्स Delbruck आणविक चिकित्सा के लिए केंद्र, बर्लिन, जर्मनी) pCMVSB100X और पीटी/BH plasmids के लिए । इस काम के डेबरा अंतर्राष्ट्रीय और इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine Lonza BE12-614F Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized GE Healthcare Life Sciences SH30071.03 Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml Lonza DE17-602E Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM Lonza BE17-605E Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline Lonza BE17-737E Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% Merck 106580 Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) Sigma-Aldrich 320331 Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection Fresenius Kabi - Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter Whatman 10462100 Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes Beckman Coulter 326823 Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg Lonza BE17-516F Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit Perkin Elmer NEK50001KT Kit for IDLV particle titration.
Polybrene Sigma-Aldrich 107689 Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg GIBCO BE17-160E Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 100938B AnalaR BDH Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) GIBCO 15400-054 Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin GIBCO 16030-074 Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media GIBCO 21765 Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum Lonza DE14-801F Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin GIBCO 10099-141 Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 Reagents for keratinocyte growth.
Adenine VWR 1152-25 Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone VWR 3867-1 Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052 Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T5516 Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF Austral Biological GF-010-9 Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody Miltenyi Biotech 130-096-099 To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase Life Technologies 18080051 Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) Sigma-Aldrich D7295 Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (any) - Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase Promega M740B Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology Sigma-Aldrich A9539 Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X Invitrogen 15581028 Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510 Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline Sigma-Aldrich D-9891 drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystem 4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon Corning 352096 Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile Falcon Corning 353025 Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile Falcon Corning 353046 Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL Eppendorf 0030 120.094 Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free (any) - Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystem 4346906 96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap BD Falcon 352052 Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) (any) - Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) (any) - Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter (any) - Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler (any) - Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment (any) - Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2 BD - Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 7900HT Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. (any) - Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor Beckman Coulter - Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41, (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36, (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28, (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41, (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9, (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137, (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8, (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8, (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16, (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39, (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19, (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12, (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1, (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics