En flera Format polyakrylamid-baserad analys för att studera effekten av extracellulärmatrix stelhet på bakteriell infektion av vidhäftande celler

Immunology and Infection
 

Summary

Vi har utvecklat en flera format polyakrylamid-baserad analys för avsökning av effekten av extracellulärmatrix stelhet på bakteriell infektion av vidhäftande celler. Denna analys är kompatibel med flödescytometri, immunfärgning och dragkraft kraft mikroskopi, möjliggör kvantitativa mätningar av biomekaniska interaktioner mellan celler, deras extracellular matris och patogena bakterier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Extracellulär matrix stelhet består av en av de flera mekaniska stimuli från omgivningen som är kända att påverka cellulära beteende, funktion och öde i allmänhet. Även om allt mer vidhäftande celltyper Svaren till matrix stelhet har karaktäriserats, hur cellernas känslighet för bakteriell infektion beror på matrix stelhet är till stor del okända, som är effekten av bakteriell infektion på den biomekanik av värdceller. Vi hypotes att mottagligheten för värd endothelial celler till en bakteriell infektion beror på styvheten i matrisen där dessa celler finns, och att infektionen värdens celler med bakterier kommer att förändra deras biomekanik. För att testa dessa två hypoteser, användes endotelceller som modell värdar och Listeria monocytogenes som en modell patogen. Genom att utveckla en roman flera format assay, visar vi att effekten av matrix stelhet på infektion av endothelial celler av L. monocytogenes kan bedömas kvantitativt genom flödescytometri och immunfärgning följt av mikroskopi. Dessutom kan använder dragkraft kraft mikroskopi, effekten av L. monocytogenes infektion på värd endotelceller biomekanik studeras. Den föreslagna metoden möjliggör analys av effekten av vävnad-relevanta mekanik på bakteriell infektion av vidhäftande celler, som är ett viktigt steg mot att förstå de biomekaniska interaktioner mellan celler, deras extracellular matris, och patogena bakterier. Denna metod är också tillämplig på en mängd andra typer av studier på cell biomekanik och svar på substrat stelhet där det är viktigt för att kunna utföra många replikat parallellt i varje experiment.

Introduction

Celler i mest djurvävnader är vanligtvis vidhäftande, bifoga både till angränsande celler och deras extracellulär matrix (ECM). Ankringen av celler till sin ECM är avgörande för många cellulära processer som sträcker sig från cell motilitet till cell spridning och överlevnad1,2. Cellulära förankringar till ECM beror både på ECM sammansättning och stelhet. Cellerna reagera på förändringar i den senare av dynamiskt omarrangera sin cytoskelettet, cell-ECM och cell-cell sammanväxningar, vilka i sin tur kritiskt förändrar cell biomekanik och funktioner3,4,5,6 . ECM stelhet kan variera i rymden (dvs, anatomiska läge), i tid (dvs, åldrande) och patofysiologiska processer (t.ex., åderförkalkning, cancer, infektioner, etc.). Exempelvis är det allmänt accepterat att endothelial celler bosatt på styvare-jämfört med mjukare-matriser utöva ökade krafter till sin ECM och till varandra och uppvisar ökad motilitet och spridning7,8. Jämväl, fibroblaster bosatta på styvare matriser förmedla hög kontraktila krafter till sin ECM och Visa ökad spridning, motilitet och ECM produktion9,10,11. Även om cellen mekanik och svar på ECM stelhet har studerats ingående för olika celltyper, förhållandet mellan vidhäftande värdceller, är styvheten i sin ECM, och bakteriella infektioner fortfarande till stor del okända.

För att studera rollen av ECM stelhet i bakterier-värd-cell interaktioner, valdes L. monocytogenes (Lm) som patogenen som modell. LM är en allestädes närvarande livsmedelsburna bakterie som kan orsaka systemisk infektion i en mängd olika däggdjur värdar. Detta fakultativt intracellulära patogener kan flytta från intestinala epitelet till avlägsna organ genom att gå igenom olika typer av vaskulär endothelia. Om det bryter mot den blood - brain barriären, Lm kan orsaka hjärnhinneinflammation, och när den passerar moderkakan, kan det orsaka spontan abort12,13. LM kan infektera annan värd celltyper och kan göra det genom att använda olika patogena strategier. LM-infektion har undersökts främst i samband med epitelceller, medan mycket mindre är känt om hur Lm kan infektera och bypass endothelial celler som kantar lumen blodkärl14,15,16. Dessutom är det fortfarande till stor del okänt hur styvheten i ECM där endotelceller bosatta modulerar Lm: s förmåga att invadera dessa värdceller och sedan sprida. LM och flera ytterligare bakteriearter (dvs, Rickettsia parkeri) dra nytta av aktin cytoskelettet värdens celler de infektera både invadera i cytoplasman och underlätta cell till cell spridning17 , 18 , 19. de uppnå detta genom uttrycket av proteiner som möjligt för dem att störa värd aktin polymerisation vägar och att producera aktin komet svansar som underlättar deras framåt framdrivning16,20. Till följd av infektion behöver värdcellens aktin cytoskelettet dynamiskt ordna på ett sätt som är fortfarande inte helt kännetecknas, som potentiellt påverkar biomekanik av vara värdcellerna inklusive de fysiska krafterna som de utövar på sin ECM och på varje andra. För att undersöka dessa processer, mänskliga mikrovaskulära endotelceller (HMEC-1) valdes som modell värdceller av tre skäl: 1. endotelceller är kända för att vara mycket mechanosensitive som de utsätts ständigt för olika fysiska ledtrådar21; 2. de strategier som Lm sysselsätter för att infektera endotelceller är fortfarande till stor del okända22; och 3. HMEC-1 kan är en förevigade cellinje och, därför, lätt odlade och utsatts för genetisk manipulation.

Bakteriell infektion i värdceller har mestadels varit studerade in vitro- genom sådd celler på glas eller polystyren substrat som är betydligt styvare än fysiologiska ECM av de flesta celler12,14,23. Att undersöka infektionen av celler som dirigeras till en matris vars stelhet är fysiologiskt relevanta och att klargöra rollen av ECM stelhet på infektionen av celler av bakteriella patogener, följde vi en nyskapande strategi baserad på tillverka tunna microbead-embedded polyakrylamid hydrogels avstämbara styvhet på plattor med flera. Nya i det föreslagna tillvägagångssättet ligger i att det tillåter övervakning flera villkor samtidigt på grund av dess flera format och att den är kompatibel med flera tekniker beroende på det särskilda sätt som substratesna byggs. HMEC-1 celler seedade på dessa protein-belagd hydrogels och sedan infekterade med olika Lm stammar som antingen blir fluorescerande vid internalisering eller är konstitutivt fluorescerande. Rollen av ECM stelhet på infektion känslighet av HMEC-1 värdceller utvärderades av flödescytometri. Dessutom användes immunfärgning och fluorescence mikroskopi för att skilja mellan vidhängande och internaliserad bakterier. Slutligen utfördes framgångsrikt dragkraft Force Microscopy (TFM) för att karakterisera effekten av Lm infektion på dragkraft betonar att värd endotelceller utövar på deras matriser under infektion. Presenterade analysen kan enkelt ändras för att möjliggöra ytterligare studier på effekten av ECM stelhet på infektion känslighet av vidhäftande celler med olika cellinjer eller patogener.

Protocol

1. tillverka tunna två lager polyakrylamid (PA) Hydrogels på plattor med flera

  1. Lös upp ammonium persulfatoxidation (APS) i destillerat ultrarent vatten för att uppnå en slutlig koncentration på 10 g/mL. Delprov och store lösningen vid 4 ° C för kortvarig användning (3 veckor).
    Obs: Ovanstående lösning kan förberedas i förväg hydrogel fabrication.
  2. Glas aktivering av 24-väl rätter
    1. Inkubera 24-väl glas botten pläterar med 13 mm diameter brunnar (se Tabell för material) för 1 h med 500 µL av 2 M NaOH per brunn vid rumstemperatur.
    2. Skölj brunnarna 1 x med ultrarent vatten och sedan tillsätt 500 µL av 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (se Tabell för material) i 95% etanol till varje brunn för 5 min.
    3. Skölj brunnarna 1 x igen med vatten och tillsätt 500 µL 0,5% glutaraldehyd i varje brunn i 30 min. Skölj brunnarna 1 x med vatten och torka dem vid 60 ˚C med locket.

Figure 1
Figur 1 : Bakteriell infektion haltbestämning av värdceller bosatta på tunna två lager fluorescerande pärla-embedded polyakrylamid (PA) hydrogels varierande styvhet. A. glas coverslips är kemiskt modifierade för att aktivera hydrogel fastsättning. B. 3,6 µL av PA blandningar deponeras på glas botten. C. blandningen är täckt med ett 12-mm cirkulär täckglas aktivera polymerisation. D. täckglaset tas bort med en nål spruta. E. 2.4 µL av en PA lösning med mikrokulor läggs ovanpå det nedersta lagret och utjämnade med en cirkulär täckglas. F. en buffert tillsätts i brunnen och täckglaset tas bort. G. UV-bestrålning för 1 h säkerställer sterilisering. H. en Sulfo-SANPAH-innehållande lösning läggs på de geler, som sedan placeras i UV-belysning för 10 min. jag. Hydrogels tvättas med en buffert och sedan inkuberas över natten med kollagen I. J. Hydrogel är utjämnad med cell media. K. vara värdcellerna är seedade. L. LM bakterier läggs till lösningen och infektionen synkroniseras via centrifugering. Mkr. 1 h efter infektion bakterier i lösningen tvättas bort och media kompletteras med ett antibiotikum tillsätts. N. 4 h efter infektion, Lm (JAT985) börjar fluorescerande. O. HMEC-1 celler är fristående från sin matris och lösningarna överförs till rören för att utföra flödescytometri Flödesmätningarna. Observera att dagar och ungefärliga tider för varje steg i analysen också anges. Denna siffra har ändrats från Bastounis och Theriot59Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Polyakrylamid hydrogel fabrication
    Obs: Se bild 1.
    1. Förbereda vattenlösningar som innehåller 3-10% av 40% lager akrylamid lösning (se Tabell av material) och 0,06 - 0,6% av 2% stamlösning bis-akrylamid (se Tabell för material) för att tillverka hydrogels avstämbara styvhet alltifrån 0,6 kPa till 70 kPa. Se tabell 1.
      1. För 0,6 kPa hydrogels, blanda 3% akrylamid med 0,045% bis-akrylamid. För 3 kPa hydrogels, blanda 5% akrylamid med 0.074% bis-akrylamid. För 10 kPa hydrogels, blanda 10% akrylamid med 0,075% bis-akrylamid. För 20 kPa hydrogels, blanda 8% akrylamid med 0.195% bis-akrylamid. För 70 kPa hydrogels, blanda 10% akrylamid med 0,45% bis-akrylamid.
        Obs: Ytterligare Detaljer för att uppnå önskvärt PA hydrogel styvheten kan hittas någon annanstans24,25,26,27.
    2. Förbered två vattenlösningar för varje önskvärd hydrogel stelhet. Förbereda lösning 1 vara pärla-fri och lösning 2 innehåller 0,03% 0,1 µm diameter fluorescerande mikro-pärlor (se Tabell för material).
    3. Degas lösningar 1 och 2 av vakuum för 15 min för att eliminera syre som är kända för att hämma polymerisation av lösningar.
    4. Lägga till 0,6% av 10 g/mL APS lösning och 0,43% tetramethylethylenediamine (TEMED) i lösning 1 för att aktivera en polymerisation initiering. Agera snabbt.
    5. Tillsätt 3,6 µL lösning 1 i mitten av varje brunn av 24-väl skålen (se steg 1.2 för dess framställning).
    6. Omedelbart täcka brunnarna med 12-mm obehandlad cirkulär coverslips och låt lösning 1 sitta 20 min så att det fullt polymerizes.
    7. Knacka försiktigt på sprutan nål till en yta för att skapa en liten krok på sin spets för att underlätta avlägsnande av coverslips. Lyft den coverslips använder sprutans nål.
    8. Lägga till 0,6% av 10 g/mL stamlösning APS och 0,43% TEMED till lösning 2. Deponera 2,4 µL av blandningen ovanpå det första lagret i varje brunn av 24-väl skålen.
    9. Täcka lösning 2 med 12-mm cirkulär glas coverslips, försiktigt trycka nedåt med ett par pincett för att säkerställa tjockleken på det andra lagret är minimal. Låt lösningen 2 polymerisera i 20 min.
    10. Tillsätt 500 µL av 50 mM HEPES pH 7.5 till var och en av brunnarna och ta sedan bort glas coverslips med sprutans nål och tång.
  2. Sterilisering, kollagen-beläggning och Jämviktstiden av polyakrylamid hydrogels
    1. UV-exponera hydrogeler för 1 h i vävnadsodling huven att tillåta sterilisering.
    2. Förbereda en blandning av 0,5% vikt/volym sulfosuccinimidyl 6-(4′-azid-2 '-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, se Tabell för material) i 1% DMSO och 50 mM HEPES pH = 7.5.
    3. Tillsätt 200 µL av denna lösning till den övre ytan av hydrogels. Agerar snabbt, utsätter dem för UV (302 nm) i ca 10 min att aktivera dem.
    4. Tvätta hydrogels två gånger med 1 mL 50 mM HEPES pH = 7.5. Upprepa tas om det behövs för att säkerställa att eventuella överskott crosslinker bort.
    5. Protein-coat hydrogels med 200 µL av 0,25 mg/mL rat tail kollagen jag (se Tabell för material) i 50 mM HEPES. Inkubera i hydrogels, med kollagen lösningen på toppen, över natten i rumstemperatur.
      Obs: För att förhindra dehydrering/avdunstning, placera plattorna med flera i en sekundär inneslutning och tillsätt laboratorium rengöring vävnader indränkt i vatten i inre peripheryen av reaktorinneslutningen.
    6. Använd en epifluorescence eller confocal Mikroskop med ett 40 X-objektiv för att mäta tjockleken på hydrogels. Gör så genom att lokalisera z ståndpunkter botten (där glasytan är) och topp plan av den hydrogel (där den fluorescerande pärlor intensitet är max). Subtrahera sedan z positioner för att bestämma höjden.
      Obs: Vi använde en inverterad epifluorescensmikroskop och ett 40 X-objektiv med numeriska bländaröppningen 0,65 för att mäta tjockleken på hydrogels. Atomic Force Microscopy mätningar (AFM) kan också utföras på denna punkt för att bekräfta exakta styvheten i den hydrogels (se figur 2).
    7. Innan sådd cellerna i ränta på hydrogels, tillsätt 1 mL av media på hydrogels och inkubera vid 37 ° c i 30 min till 1 h för att säkerställa Jämviktstiden dem.
      Obs: Vi lagt MCDB-131 full media eftersom det är media där modell värdcellerna (HMEC-1) odlades i (se steg 2.1 för detaljer).

Figure 2
Figur 2: AFM mätningar av PA hydrogel stelhet och pärlor distribution. A. Data visar den beräknade Youngs modul (mått på stelhet) av PA hydrogels, tanke på mängden akrylamid och bis-akrylamid används kontra de Youngs modul mätt genom AFM (N = 5-6). De vågräta strecken skildra medelvärdet. Styvheten i de 0,6 kPa hydrogels kunde inte mätas eftersom hydrogels var mycket mjuk och följas till AFM spetsen. B. Detta är en fas bild av konfluenta HMEC-1 celler och den motsvarande bilden av pärlor inbäddade på översta ytan av en mjuk 3 kPa-PA hydrogel. Den HMEC-1 var seedad för 24 h vid en koncentration av 4 x 105 celler per brunn. C. denna bild är samma som bild 2B men för celler som bor på en stel 70-kPa PA hydrogel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. mänskliga mikrovaskulära endotelceller kultur och sådd på Hydrogels

  1. Kultur HMEC-1 (mänskliga, mikrovaskulära endotelceller) celler i MCDB-131 full media som innehåller MCDB-131 media kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 10 ng/mL av epidermal tillväxtfaktor, 1 µg/mL av hydrokortison och 2 mM av L-glutamin (se tabellen av material ).
  2. Dela konfluenta kulturerna 1:6 varje 3-4 dagar och hålla cellerna till passagen 40.
  3. En dag före experimentet, lossa cellerna från deras kultur fartyget med 0,25% trypsin/EDTA. Först tvätta cellerna och deras kultur fartyget 1 x med steril fosfat buffrad saltlösning (PBS) och Lägg sedan till lämplig mängd 0,25% trypsin/EDTA (2 mL per 100 mm maträtt eller 75 cm kolv 1 mL per 60 mm maträtt eller 25 cm kolv), ruvning kolven vid 37 ° C i 5-10 min att tillåta avskildheten av cellerna från deras substrat.
  4. Neutralisera trypsin genom att lägga till önskad volym av MCDB-131 full media, Pipettera försiktigt att bryta upp klumpar av celler, och placera sedan lösningen i ett koniskt centrifugrör.
  5. Försiktigt snurra lösningen av celler så att cellerna är jämnt fördelade och sedan ta ut 20 µL av lösningen och mycket försiktigt fylla ut de två kamrarna under täckglas av ett glas hemocytometer.
  6. Pellet ner lösningen av celler som ingår i den koniskt centrifugrör med centrifugering för 10 min vid 500 x g.
  7. Under 10 min väntetiden, räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Använda ett mikroskop, fokusera på linjerna av hemocytometer med ett 10 X-objektiv och sedan använda en hand tally counter för att räkna antalet celler i en 1 x 1 mm fyrkantig.
  8. Flytta hemocytometer till en annan 1 x 1 mm kvadrat, räkna cellerna det och upprepa sedan processen två gånger. Beräkna medelvärdet av de fyra mätningarna och sedan multiplicera Genomsnittligt med 104. Slutvärdet är antalet livskraftiga celler/mL i cellsuspensionen som att centrifugeras.
  9. Avlägsna vätskan ur det koniskt centrifugröret samtidigt att cellpelleten inte störs. Att resuspendera cellerna i MCDB-131 full media vid en koncentration på 4 x 105 celler/mL.
  10. Utsäde cellerna i fjädringen på hydrogels genom att först ta bort media som hydrogels inkuberades och sedan lägga 1 mL cellsuspension på varje hydrogel.

3. infektion av humant mikrovaskulära endotelceller med L. monocytogenes

  1. Förberedelser
    Obs: Förbereda följande lösningar i förväg.
    1. Streptomycin, kloramfenikol och gentamicin bestånd
      1. Förbereda 50 mg/mL streptomycin stamlösningar av väger 0,5 g streptomycin sulfat och upplösning det helt i 10 mL av ultrarent vatten.
      2. Förbereda 7,5 mg/mL av kloramfenikol stamlösningar av väger 75 mg av kloramfenikol och upplösning det helt i 10 mL 100% etanol.
      3. Förbereda 20 mg/mL av gentamicin stamlösningar av väger 0.2 g av gentamicin sulfate och upplösning det helt i 10 mL av ultrarent vatten.
      4. Filter-sterilisera alla lager lösningar med ett 0,2 µm spruta filter och lagra dem vid-20 ° C för långtidsanvändning (1-2 månader).
    2. Hjärna hjärta infusion (BHI) media och agar plattor
      1. Leta upp två 1-L kolvar och lägga till en magnetisk rör inuti varje kolv.
      2. För BHI media, tillsätt 37 g BHI pulver i en mätkolv och tillsätt ultrarent vatten upp till 1 L. Mix lösningen kraftigt genom att placera kolven på en magnetisk uppståndelse platta tills pulvret är upplöst.
      3. För BHI agarplattor, lägga till 37 g BHI pulver och 15 g av granulerad agar (se Tabell för material) i den andra kolven och tillsätt ultrarent vatten upp till 1 L. Mix lösningen kraftigt genom att placera kolven på en magnetisk uppståndelse platta tills pulvret är upplöst.
      4. Skruva fast locken på behållarna inte för hårt och autoklavera lösningarna använda vätskan inställning eller enligt autoklavs specifikationer.
      5. Ta bort lösningen från autoklaven och sedan kyla ner agar-BHI lösningen på 55 ° C. Om BHI media i 1 L kolven hålls sterila, det kan användas för upp till en månad.
      6. För att förbereda bakterierna agar-BHI plattor, först lägga till antibiotika, om så är lämpligt, till den kolv som innehåller BHI och agar (beroende på de bakteriestammar odlas). Kort ut kolven på en magnetisk uppståndelse tallrik att tillåta snabb blandning.
        Obs: De antibiotika som används här är specifika för de Lm-stammar som används, men alla nödvändiga antibiotika kan användas i BHI-agarplattor. Vi lagt streptomycin till en koncentration av 200 µg/mL och kloramfenikol till en koncentration på 7,5 µg/mL eftersom 10403S Lm stammar är resistenta mot streptomycin. Dessa stammar har varit konjugerat med en plasmid som innehåller kloramfenikol kolinacetyltransferas öppen läsning ramen, därav motståndet mot kloramfenikol.
      7. Häll blandningen i 10-cm polystyren bakterier kultur plattor (ca 20 mL per platta). För att få bort bubblor, flame den övre ytan av plattorna kort. Coola tallrikar över natten i rumstemperatur.
      8. Nästa dag, tätar torra plattorna och lagra dem vid 4 ° C.
  2. Infektion av humant mikrovaskulära endotelceller med L. monocytogenes
    1. Tre dagar innan infektionen, strimma ut Lm stam för att användas från en glycerol lager (lagras vid-80 ° C) på BHI-agar plåt som innehåller 7,5 µg/mL av kloramfenikol och 200 µg/mL streptomycin, om så är lämpligt.
      Obs: Stammen att vara strimmiga ut kan vara en vildtyp eller mutant, konstitutivt uttrycker fluorescens (för immunfärgning JAT1045 användes) eller uttrycker fluorescens under ActA arrangören (för flöde flödescytometri eller dragkraft force microscopy JAT983 eller JAT985 användes)22.
    2. Inkubera plattorna vid 37 ° C tills diskret kolonier bildas (1-2 dagar).
    3. Dagen innan infektionen, växa önskad stammen över natten, skakar det på 150 rpm vid 30 ° C i BHI media med 7,5 µg/mL av kloramfenikol (om tillämpligt).
      1. Placera 5 mL BHI media i en 15 mL koniskt centrifugrör, tillsätt 7,5 µg/mL av kloramfenikol (i tillämpliga fall) och sedan ympa en enda koloni från agarplattan med hjälp av en steril 10 µL spets.
    4. Nästa dag, strax före infektion, Mät den optiska densiteten av bakterier lösningen på 600 nm (OD600) genom att späda provet 1:5; Använd en kyvetten innehållande BHI ensam för att tjäna som en tom.
    5. Späd den nattliga kulturen till en OD600 0,1 och inkubera, skakar för 2 h vid 30 ° C, i BHI media med 7,5 µg/mL av kloramfenikol (om tillämpligt) för att tillåta bakterierna att nå log-fas tillväxt.
    6. Mäta OD600 av bakteriell lösningen, som förväntas bli runt 0,2 - 0,3. Om OD600 är högre, späd det till 0,2 - 0,3 med BHI ensam.
    7. Ta 1 mL bakteriell lösning i en mikrocentrifug rör. Snurra den ner under 4 minuter vid 2000 x g använder centrifugering vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera bakteriell pelleten i 1 mL av vävnadsodling-grade PBS, i vävnadsodling huven. Tvätta bakterierna som är två gånger mer genom att snurra ner dem under 4 minuter vid 2000 x g i rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera bakterierna i 1 mL PBS.
    8. Förbered den infektion mix genom att blanda 10 eller 50 µL av bakterier resuspended i PBS med 1 mL MCDB-131 full media för en multiplicity av infektion (MOI; dvs, antalet bakterier per värdcellen) av ungefärligt 50 bakterier per värdcellen eller 10 bakterier per värdcellen.
    9. Ta bort mediet från brunnarna av 24-väl pläterar, noga med att inte störa hydrogels eller celler. Tvätta cellerna 1 x med 1 mL MCDB-131 full media och sedan lägga till 1 mL av bakterier till varje brunn.
    10. Hålla några infektion mix (minst 100 µL) för bestämning av MOI (se steg 3.3).
    11. Täck tallriken med lock och Linda plattorna med polyeten mat wrap att undvika läckage. Placera plåtarna i centrifugen och snurra proverna för 10 min vid 200 x g att synkronisera invasionen. Flytta plattorna i vävnadsodling inkubatorn och inkubera dem under 30 minuter vid 37 ° C.
    12. Tvätta proverna 4 x med MCDB-131 full media och flytta dem till vävnadsodling inkubatorn. Efter en ytterligare 30 min, ersätta media med media kompletteras med 20 µg/mL gentamicin.
  3. Bestämning av multiplicityen av infektion (MOI)
    1. Under de första 30 minuters inkubationen av vara värdcellerna med bakterier, förbereda 10-faldig seriespädningar av infektion mixen att avgöra MOI. Gör 10-faldig utspädningar genom att blanda 100 µL av den infektion mix med 900 µL 1 x PBS (10-1 utspädning). Blanda sedan, 100 µL 10-1 utspädning med 900 µL av PBS (10-2 utspädning).
    2. Fortsätt tills en 10-5 utspädning erhålls.
      Obs: Alla lösningar måste blandas väl före spädning av dem, och färska ren pipettspetsar bör användas vid varje steg.
    3. När spädningarna görs, placera 100 µL av de 10-2 - 10-5 spädningar på mitten av BHI/agar/kloramfenikol/streptomycin pläterar (om tillämpligt).
    4. Göra en spridare från en glas-pipett med brand för att böja pipetten för att skapa en krok. Doppa pipetten i 100% etanol för sterilisering och sedan bränna bort etanol med en flamma.
    5. När spridaren har svalnat, sprida de bakteriella utspädningarna homogeneously på plattorna från 10-5 utspädning och flyttar till mer koncentrerad mixar. Inkubera plattorna upp och ner vid 37 ° C i 2 dagar.
    6. Beroende på kolonin densitet, avgöra antalet kolonier av antingen den 10-3 och 10-4 eller den 10-4 och 10-5 utspädning plattor. Beräkna MOI enligt följande:
      antal kolonier × utspädning faktor ÷ volym inledande lagt till = antalet CFU per µL
      antal CFU per µL × volym av bakterier mix per brunn = antal CFU per brunn
      antal CFU per väl × volym av celler per brunn = antalet bakterier per cell
      Obs: CFU står för kolonibildande enheter.
    7. Genomsnitt MOIs från två plattor för att få de slutliga MOIs.

4. flödescytometri att kvantifiera extracellulära-matris-styvhet beroende infektionskänslighet av värdceller

  1. Väg 5 mg kollagenas och placera det i en 15 mL koniskt centrifugrör. Tillsätt 10 mL av 0,25% trypsin-EDTA och blanda dem väl.
  2. 8 h efter infektion, ta bort mediet från brunnarna Skyltens 24-väl och Tvätta brunnarna 1 x med vävnadsodling PBS. Ta bort PBS från brunnarna och tillsätt 200 µL av trypsin-EDTA/kollagenas mixen till varje brunn. Placera detta i vävnadsodling inkubator för 10 min till tillåta full avlossning av cellerna.
  3. Använd färska pipett för varje brunn och Pipettera mixen upp och ner 8 x. Försiktig så att inte skada cellerna. Tillsätt 200 µL av full media till varje brunn för att neutralisera trypsin.
  4. Överför 400-µL cell lösningen i varje brunn till en 5-mL polystyren tub med badmössa 35 µm cell sil (se Tabell för material).
  5. Analysera 10 000-20 000 celler per prov med flödescytometri. Utföra datainsamling genom flödescytometri och bestämma procentandelen av infekterade celler per brunn med en relevant kommersiellt tillgänglig programvara. Använd framåt scatter kontra sida spridningsdiagram att utfärda utegångsförbud för huvuddelen av fördelningen av blodkroppar.
    Obs: Detta kommer att säkerställa analys av enstaka celler och eliminera skräp eller cell midjekort jacka eller trillingar.
    1. Mäta fluorescens signalen från kontroll-infekterade celler och utfärda utegångsförbud för befolkningen i infekterade celler exklusive autofluorescens.

5. immunfärgning av extracellulära bakterier, mikroskopi och bildbehandling

Obs: Detta tillvägagångssätt följs för att skilja mellan ECM-styvhet beroende bakteriell vidhäftning på cellytan värd kontra bakteriell internalisering (invasion) inom värdarna.

Figure 4
Figur 4 : Immunfärgning för Lm-infekterade HMEC-1 celler bosatt på hydrogels varierande styvhet att skilja bakteriell vidhäftning kontra invasion. Dessa bilder visar ett representativt exempel på differentiell immunfärgning visar A. cellkärnorna (DAPI), B. alla bakterier (GFP), och C. utanför bakterierna (Alexa-546). HMEC-1 cellerna var bosatta på en mjuk 3-kPa hydrogel. Pilarna pekar på bakterier som har varit internaliserat, så visas på den gröna kanalen endast. Uppgifterna i D-F avser N = 20 bilder som tagits av infekterade HMEC-1 celler bosatt på mjuka 3-kPa och stela 70-kPa hydrogels ochVisa D. de totala bakterierna per kärnor; E. internaliserade bakterier per kärnor; och F. invasion effektivitet (förhållandet av internaliserade bakterier till totala bakterier). De vågräta strecken skildra data betyder. P-värde beräknades med icke-parametriska Wilcoxon Rank Sum test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. 30 min efter infektion, tvätta HMEC-1 celler infekterade med JAT1045 (Lm som konstitutivt uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP)) 4 x med media.
  2. Efter den fjärde tvättningen, blanda 1 µL av 1 mg/mL Hoechst färgämne med 1 mL MCDB-131 full media och lägga till varje brunn för att färga cellernas kärnor. Placera cellerna i vävnadsodling inkubatorn i 10 min.
  3. Tvätta cellerna 1 x med PBS. Fixera dem med en icke-permeabilizing fixativ för differentiell immunfärgning för 20 min vid rumstemperatur28.
    Obs: Fixeringsvätskan innehåller 0.32 M sackaros, 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA, och 4% formaldehyd (elektronmikroskopi grad).
  4. Tvätta cellerna 1 x med PBS. Blockera proverna för 30 min med 5% bovint serumalbumin (se Tabell för material) i PBS.
  5. Inkubera proverna för 1 h med en anti-Lmprimär antikropp (se Tabellen för material) efter utspädning 1: 100 i PBS som innehåller 2% BSA.
  6. Tvätta proverna i PBS 3 x och sedan ruva dem för 1 h med en AlexaFluor-546 get-anti-kanin sekundär antikropp (se Tabell för material) utspädd 1: 250 i PBS som innehåller 2% BSA. Tvätta proverna 3 x i PBS. Lagra proverna i 1 mL PBS för avbildning.
  7. Bild och analysera mer än 1 000 celler per tillstånd.
    1. För imaging, använda en inverterad epifluorescensmikroskop med en CCD-kamera (se Tabell av material) och en 40 X luft plan fluorit luft mål med 0.6 numeriska bländaröppningen (NA).
      Obs: Kraften är inställd på 25% och exponeringstiden till 100 ms. den Mikroskop filter används för mCherry är 470/525 nm, för god Jordbrukarsed 530/645 nm och DAPI 395/460 nm, för magnetisering och utsläpp respektive. Mikroskopet använde vi kontrollerades av en öppen källkod mikroskopi programvara paketet29.
    2. För differentiell immunfärgning, räknas alla 'gröna' bakterier associerade med enskilda celler som vidhäftande. Räkna bakterier som är både 'grön' och 'röd' (på grund av antikropp bindande) som icke-internaliserat.
      Obs: Vi identifierat antalet atomkärnor genom att köra ett skräddarsydda skript och CellC programvaran (se Tabell för material) för uppräkning av bakterier30.

6. multi-väl dragkraft kraft mikroskopi och enskiktslager Stress mikroskopi

Figure 5
Figur 5: Lm-infekterade HMEC-1 celler minska omfattningen av dragkraft krafter de utövar på sin ECM under infektion. Panel A visar fas bilden, B visar fältet deformation, C visar dragkraft stress fältet och D visar fältet intracellulära spänning oinfekterade HMEC-1 celler som bor på en 20-kPa hydrogel. Färgfälten av deformeringen kartor (µm) av dragkraften stress kartor (Pa) och av intracellulära spänningen kartor (nNµm-1) visas på den övre delen av värmekartor. Staplarna visar tre representativa tidpunkter: 3, 8 och 18 h efter infektion. E-H. Samma som paneler A-D men för celler som smittats med Lm på en MOI på 300. Bilder av bakterier (röda kanalen) är ovanpå fas bilder av cellerna. TFM inspelningar genomfördes av imaging flera brunnar samtidigt. Fönsterstorleken för PIV var 32 bildpunkter med 16 överlappar varandra. Skalstapeln är 32 µm. Denna siffra har ändrats från Bastounis och Theriot59. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Förbereda den PA hydrogels på en 24-well platta (se steg 1). Frö HMEC-1 celler (se steg 2) och smitta dem med JAT983 som beskrivs ovan (se steg 3).
  2. Förbereda ett live-mikroskopi medium genom att komplettera Leibovitzs l-15 med 10% fetalt bovint serum och 10 ng/mL av epidermal tillväxtfaktor 1 μg/mL hydrokortison.
    Obs: Den l-15 innehåller redan 2 mM L-glutamin, så det inte är nödvändigt att lägga till extra som i fallet med MCDB-131 media.
  3. 4 h efter infektion (när de internaliserade JAT983 börjar fluorescerande), blanda 1 μL av 1 mg/mL Hoechst färgämne med 1 mL l-15 full media och lägga till varje brunn för att färga cellernas kärnor. Placera cellerna i vävnadsodling inkubatorn i 10 min och sedan ersätta i varje brunn l-15 full media med 1 mL av l-15 full media kompletteras med 20 µg/mL gentamicin.
  4. Täck tallriken med dess locket och placera det i en mikroskopets miljökammare (se Tabell för material) utjämnad till 37 ˚C.
    Obs: För imaging, använda en inverterad epifluorescensmikroskop med en CCD-kamera (se Tabell av material) och en 40 X luft plan fluorit luft mål med 0,6 NA.
  5. Förvärva Multi-Channel time-lapse bilder av fluorescerande pärlorna och fluorescerande bakterier, och fas kontrast bilder av vara värdcellerna, varje 10 min för 4 till 12 h.
    Obs: För bildtagning, kraften var satt till 25% och exponeringstid att 100 ms. den Mikroskop filter (excitation/utsläpp) används för mCherry och god Jordbrukarsed är 470/525 nm och 530/645 nm respektive.
  6. I slutet av inspelningen, tillsätt 500 µL 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) i vatten i var och en av brunnarna.
    Obs: Cellerna kommer att tas bort från hydrogel och hydrogel återgår till sin ursprungliga odeformerade tillstånd eftersom det är elastiskt.
  7. Ta en bild av hydrogel och använda den som referens odeformerade bilden.
  8. Bestämma hydrogel tvådimensionell deformation vid varje ögonblick av tid använder particle image velocimetry (PIV)31, jämföra varje bild av time-lapse serien med referensbilden av den odeformerade hydrogel. Använda de lämpliga fönsterstorlekar och överlappning beroende på experimentet.
    Obs: Vi använde windows 32 pixlar överlappning av 16 pixlar.
  9. Beräkna 2D dragkraft betonar att celler utöva på hydrogel som beskrivs på andra ställen32,33.
  10. Beräkna enskiktslager spänningen från dragkraft stressen som tidigare beskrivs34 av lösa ekvationer av mekaniska jämvikt för en tunn elastisk platta föremål reaktion styrkor skapad av den PA hydrogel på den enskiktslager, som är av en mittemot tecken för uppmätta dragkraft påfrestningar.
    Obs: Se kompletterande Material 1.

7. kvantitativ Time-lapse mikroskopi att bedöma Extracellular-matris-styvhet beroende av L. monocytogenes spridning genom Endothelial celler

Figure 6
Figur 6: Time-lapse kvantitativ mikroskopi data av Lm spridning genom HMEC-1 enskiktslager seedade på substrat med 3-kPa och 70-kPa stelhet. A. i denna panel visas fortfarande bilder från två representativa infektion foci på 0, 200, 400 och 600 min. Fas kanalen skildrar HMEC-1 cell enskiktslager, och den röda kanalen skildrar intracellulära Lm (se steg 7 i protokollet). B. denna panel visar området konvex skrovet som omfattar infektion fokus ritas som en funktion av tiden. Fokusområdet av villkoret 3-kPa (röd) växer snabbare än de 70-kPa (grön). C. i denna panel visas det radiella avståndet från mitten till kanten av infektion fokus ritas som en funktion av tiden för representant infektion foci växer i HMEC-1 enskiktslager seedade på PA substrat 3-kPa (röd) och 70-kPa (grön) stelhet. Den radiella hastigheten (dr/dt) är konstant för villkoret 3-kPa, men bifasisk för 70-kPa villkoret. D. dessa data visar den radiella hastigheten för de första 200 min av tio oberoende infektion foci. Den röda (3-kPa) och grön (70-kPa) datapunkter skildra sluttningarna av de två foci som beskrivs i föregående panelerna. De vågräta strecken skildra data betyder. P-värde beräknades med icke-parametriska Wilcoxon Rank Sum test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Förbereda den PA hydrogels på en 24-well platta (se steg 1), utsäde HMEC-1 celler (se steg 2) och växa över natten JAT983 kulturer som beskrivits ovan (se steg 3).
  2. Dagen för infektion, Förbered infektion mixen genom att blanda 10 µL av bakteriell pelleten per mL MCDB-131 full media. Försiktigt ta bort mediet från brunnarna i de 24 brunnar och tillsätt 1,9 mL MCDB-131 full media och 0,1 mL av den bakteriella mix till varje brunn.
    Obs: Den lägsta MOI som används i denna analys är nödvändigt att analysera spridning händelser som ska starta från en enda bakterie invadera en värdcell.
  3. Täck tallriken med lock och försegla det med en plastfolie att undvika läckage. Placera plåtarna i centrifugen och snurra proverna för 10 min vid 200 x g att synkronisera invasionen.
  4. Flytta plattorna i vävnadsodling inkubatorn och inkubera dem i 5 min.
  5. Tvätta proverna 4 x med media och flytta dem till vävnadsodling inkubatorn. Efter en ytterligare 5-7 min, ersätta media med media kompletteras med 20 µg/mL gentamicin.
  6. Inkubera plattan i inkubatorn för en extra 5 h för att tillåta actA arrangören att aktivera och köra uttrycket av mTagRFP öppen läsning ram35.
  7. Förbereda ett live-mikroskopi medium genom att komplettera Leibovitzs l-15 med 10% fetalt bovint serum och 10 ng/mL av epidermal tillväxtfaktor 1 µg/mL hydrokortison.
    Obs: Den l-15 innehåller redan 2 mM L-glutamin, så det inte är nödvändigt att lägga till extra som i fallet med MCDB-131 media.
  8. Blanda 1 μL av 1 mg/mL Hoechst färga med 1 mL av l-15 full media och lägga till varje brunn för att färga cellernas kärnor. Placera cellerna i vävnadsodling inkubatorn i 10 min och sedan ersätta i varje brunn l-15 full media med 1 mL av l-15 full media kompletteras med 20 µg/mL gentamicin. Täck tallriken med dess locket och placera det i en mikroskopets miljökammare (se Tabell för material) utjämnad till 37 ˚C.
    Obs: För imaging, användes en inverterad epifluorescensmikroskop med en CCD-kamera (se Tabell av material) och en 20 X luft plan fluorit luft mål med 0,75 NA. Kraften var inställd på 50% och exponeringstiden till 50 ms den Mikroskop filter används för mCherry är 470/525 nm för magnetisering och utsläpp respektive.
  9. Bild flera positioner varje 5 min med en autofokus funktionen för att övervaka hur Lm sprids genom HMEC-1 enskiktslager seedade på varierande stelhet hydrogels.
    Obs: L-15 buffras med HEPES, så det inte är nödvändigt att använda CO2 under bildtagning.

Representative Results

ECM stelhet-beroende infektionskänslighet HMEC-1 celler Lm:
PA hydrogels varierande styvhet, alla bestrukna med kollagen jag, byggdes på flera glas botten pläterar som beskrivs i steg 1 i protokollet (se figur 1). AFM mätningar utfördes för att bekräfta exakta styvheten i hydrogels, som tidigare beskrivits26,27 (se figur 2). Tidigare studier har visat att de lokala efterlevnaden av basalmembranet av endothelial celler kan variera från 1 kPa (t.ex., hjärnvävnad) till 70 kPa (t.ex., aorta)36,37,38, 39 , 40. därför valde vi att testa infektion av HMEC-1 celler bosatt på matriser med följande styvheten: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa och 70 kPa. För varje hydrogel stelhet, var sex hydrogels fabricerade för att bedöma reproducerbarheten för resultaten.

Flödescytometri användes för att bedöma den ECM stelhet-beroende infektionskänslighet HMEC-1 celler Lm (se figur 3). HMEC-1 celler var infekterade med en Lm stam (JAT985) som uttrycker en fluorescerande markör efter internalisering (actAp::mTagRFP), möjliggör upptäckt av intracellulära bakterier bara (se figurerna 1 L - 1N). JAT985 saknar också ActA, inaktivera bakterier från att sprida sig från cell till cell, eftersom ActA är nödvändig för bildandet av aktin komet svansar och efterföljande bakteriell spridning. 7 - 8 h efter infektion, HMEC-1 cellernas infektion bedömdes med hjälp av flödescytometri. För att säkerställa att analysen av enstaka celler, var huvuddelen av distributionen av blodkroppar gated använder framåt kontra sida spridningsdiagram och sedan en andra Usenets steg utfördes för att utesluta celler som uppvisar autofluorescens (se figurerna 3A - 3 C ). De preliminära resultaten som avbildas i figur 3 visar att HMEC-1-infektion med Lm är cirka två gånger större för HMEC-1 celler som finns på de stela 70 kPa hydrogels jämfört med celler som finns på de mjuka 0,6 kPa hydrogels (se siffrorna 3B - 3D). ökad Lm infektion känsligheten för HMEC-1 celler bosatt på stiff jämfört med mjuk matriser kan bero på: 1. ökade Lm vidhäftning på HMEC-1; 2. ökad Lm invasion in HMEC-1; eller 3. båda de ovanstående samarbete förekommer. För att testa vilken hypotes håller, HMEC-1 celler seedade på mjuk (3 kPa) och stel (70 kPa) hydrogels och infekterade med konstitutivt GFP uttrycker Lm (se figurerna 4A - 4 C). Proverna var fast strax efter infektion och externa (självhäftande) bakterier var fläckade av antikroppar. Med kvantitativ mikroskopi, upptäckte vi att det finns betydligt fler bakterier följa HMEC-1 när värdcellerna finnas på stiff jämfört med mjuka geler (se figur 4D). Konsekvent med flöde flödescytometri data, det finns betydligt mer bakterier internaliseras av HMEC-1 när värdcellerna finnas på stiff jämfört med mjuka geler (se figur 4E). Men invasionen effektivitet (bakterier internaliserat/totalt antal bakterier) Lm i HMEC-1 celler är liknande, oavsett substrat stelhet (se figur 4F).

Dragkraft kraft mikroskopi av Lm-infekterade HMEC-1 celler:
LM infektion av HMEC-1 celler kunde ändra biomekanik av infekterade värdceller, inklusive fastsättning till sin ECM eller till varje annan, som påverkar deras barriär integritet. Vi försökte utvärdera huruvida det skulle kunna vara fallet med dragkraft Force Microscopy32 att beräkna de cell-ECM dragkraft krafter och enskiktslager Stress mikroskopi41 att beräkna de intracellulära spännan krafterna. Figur 5 illustrerar kartor av deformation fältet, dragkraft stress fält och intracellulära spänningar inom HMEC-1 celler som finns på 20-kPa hydrogels vid olika tid punkter efter infektion. Siffror 5A - 5 D hänvisar till oinfekterade kontroll HMEC-1 celler medan siffrorna 5E - 5 H referera till HMEC-1 celler infekterade med Lm vid en multiplicity av infektion lika med 300 bakterier per cell. Detta förarbete antyder att infekterade HMEC-1 celler minska omfattningen av deras cell-ECM och intracellulära betonar under loppet av en infektion med Lm, medan det är inte för oinfekterade kontroll celler.

ECM stelhet-beroende Lm spridning över HMEC-1 enskiktslager:
Time-lapse mikroskopi användes för att undersöka effekten matrix stelhet har på Lm spridning genom HMEC-1 enskiktslager. Eftersom Lm sprids genom enskiktslager, skapa bakterier fokus av infektion som växer som en funktion av tiden (se figur 6A och Video siffrorna 1 och 2). Den infektion fokusområdet mättes genom att rita en konvex skrov, de minsta konvexa polygon som omfattar en uppsättning punkter, runt de bakterier42. Det finns ingen standard metriska i fältet för att mäta effektiviteten av L. monocytogenes cell till cell spridning genom en enskiktslager av värdceller. För att bedöma spridning effektivitet, några har räknat antalet värdceller i en infektion fokus41, medan andra har dragit gränser manuellt runt gruppen av infektion värd celler43. Vi valde att rita en konvex polygon runt bakterier, eftersom det är en automatiserad, konsekvent och beräkningsmässigt billiga process att mäta effektiviteten av L. monocytogenes spridning. Så hittade vi en liten minskning infektion fokusområdet i HMEC-1 celler seedade på 70 kPa hydrogels jämfört med de seedade på 3 kPa matriser (se figur 6B och Video siffrorna 1 och 2). För att avgöra tillväxttakten av infektion fokus, var det radiella avståndet ritas som en funktion av tiden genom att ta kvadratroten av den infektion fokusområdet och dividera detta med pi. Denna matematiska omvandling förutsätter att formen på infektion fokus är ungefär cirkulär44. För att mäta hastigheten på fokus tillväxten, mättes förändringstakten (dvs, lutningen) av det radiella avståndet för både 3 - och 70-kPa matriser. Detta tillvägagångssätt klarlagd att infektion fokus växte snabbare och monotont i HMEC-1 celler seedade på 3-kPa matriser. I fokus ökade dock betydligt långsammare (första 200 min) och något långsammare (200 till 600 min) i celler seedade på 70-kPa matriser (se figur 6C). Faktiskt, analys av ytterligare uppgifter bekräftade att infektion fokus växte, i genomsnitt två gånger långsammare i 70-kPa matriser, särskilt under de första 200 min (se figur 6D).

Figure 3
Figur 3 : ECM stelhet-beroende känslighet HMEC-1 celler för Lm invasionen mätt med hjälp av flödescytometri .  HMEC-1 celler var infekterade med Lm (JAT985) och infektionen var analyseras med flödescytometri. A. i denna panel visas en sida kontra framåt spridningsdiagram för representativa HMEC-1 celler kommer från en enda brunn. Bulk fördelningen av celler valdes via gating för att utesluta skräp (vänster) och cell midjekort jacka eller trillingar (höger). B. Detta diagram visar ett histogram över logaritmen av Lm fluorescensintensiteten per cell för HMEC-1 förkromad på mjuk 0,6 kPa. C. denna graf visar ett histogram över logaritmen av Lm fluorescensintensiteten per cell för HMEC-1 förkromad på styvt 70 kPa hydrogels. Histogram för N = 4-6 replikat visas i olika färger. Kontroll infekterade cellernas histogram är lila. Porten används för att definiera vad är infekterad visas i rött. MOI är 100 och infektionen var bedömda 8 h efter infektion. D. Data visar andelen infekterade HMEC-1 celler kontra hydrogel stelhet (N = 5). De vågräta strecken skildra data betyder. P-värde beräknades med icke-parametriska Wilcoxon Rank Sum test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video Figure 1
Video figur 1: spridning av intracellulära Lm (röd kanal) genom en HMEC-1 cell enskiktslager (fas) dirigeras till en 3-kPa substrat. Cellerna var avbildade i Leibovitzs l-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inuti en klimatkammare jämviktas till 37 ˚C. Bilderna samlades varje 5 min. Filmen är 15 bildrutor/s. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video Figure 2
Video figur 2: spridning av intracellulära Lm (röd kanal) genom en HMEC-1 cell enskiktslager (fas) dirigeras till en 70-kPa substrat. Cellerna var avbildade i Leibovitzs l-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inuti en klimatkammare jämviktas till 37 ° C. Bilderna samlades varje 5 min. Filmen är 15 bildrutor/s. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Youngs modul (E, kPa) Akrylamid % (från 40% lager) Bisacrylamide % (från 2% lager)
0,6 3 0,045
3 5 0,075
10 10 0,075
20 8 0.195
70 10 0,45

Tabell 1. Sammansättningen av polyakrylamid (PA) hydrogels varierande styvhet. i den här tabellen andelen lager 40% akrylamid lösning och andelen stamlösning 2% bis-akrylamid att uppnå en viss stelhet (Youngs modul, E) anges i olika kolumner.

Supplemental Material
Kompletterande Material 1. Uträkningen av intracellulära spänning från Beräknad dragkraft påfrestningar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Celler kan känna en mängd fysiska miljö ledtrådar, vilket kan påverka inte bara cellernas morfologi men också deras gen uttryck och protein aktivitet, vilket påverkar kritiska cell funktioner och beteenden45,46. Styvheten i ECM av celler uppskattas alltmer som en viktig modulator av cellulära motilitet, differentiering, spridning, och slutligen cell öde47,48,49. Även om det har förekommit många senaste framsteg i att förstå det komplexa biomekaniska samspelet mellan celler och deras ECM, är lite känt om hur miljön stelhet påverkar mottagligheten av celler för bakteriell infektion. För att underlätta sådana studier har utvecklat vi denna roman flera analys baserat på väletablerade tillverkning av polyakrylamid hydrogels avstämbara styvhet som är förenlig med infektion analyser50. Traditionellt har har en bakteriell infektion i celler i vävnadskultur studerats på glas eller polystyren ytor som är cirka 1-3 storleksordningar styvare än naturliga ECM mest vidhäftande celler8,51. Analysen beskrivs här öppnar nya vägar genom att aktivera studiet av bakterier-värd-interaktioner i en fysiologiskt relevanta miljömässiga stelhet regim.

För bevis på konceptet presenteras analysens valdes HMEC-1 celler som modell vidhäftande värdceller och Lm som modell bakteriella patogener. Analysen kan dock förlängas för ytterligare studier om lämpligt ändras. Sådana studier kan innebära infektion av olika däggdjur vidhäftande värd celltyper genom ytterligare patogener, inklusive bakterier och virus. För denna särskilda analys, geler protein-belades med kollagen I, men beroende på mottagande cell, är det möjligt att använda en annan ECM protein-beläggning, såsom laminin eller Fibronektin, att underlätta fastsättningen av vara värdcellerna sevärdheter på hydrogel 52. en ytterligare faktor som beror på vilken värd cell är intervallet hydrogel stelhet studeras. Spänna av stelhet bör bero på vad är fysiologiskt relevanta för den specifika värd celltypen och hur väl den värden fäster bildar en enskiktslager på en viss stelhet hydrogel. På samma sätt, beroende på modell patogener önskas att undersökas, smärre ändringar behöva genomföras på infektion analysen beskrivs häri.

Innovation av analysen jämfört med tidigare metoder för tillverkning polyakrylamid hydrogels24,50,53 ligger i vissa unika funktioner integrerade i föreslagna infektion analysen. Först, hydrogels byggs på flera glas botten pläterar, som möjliggör screening av flera villkor samtidigt samt automatisering av vissa förfaranden. Övervaka flera villkor på samma gång eller undersöka flera replikat är avgörande eftersom resultatet av en sådan strategi kan påverkas av faktorer som den mottagande cell passagen och det exakta antalet bakterier tillsätts infektera värdar, som ofta ändrar mellan oberoende experiment. En ytterligare unik funktion av denna analys är att hydrogeler har en höjd av cirka 40 µm, vilket är tunn nog att bilden med hjälp av konventionella mikroskopi. Vi visade att vi framgångsrikt kan utföra både levande cell mikroskopi cell fixering och immunfärgning följt av imaging, utan att införa hög bakgrund fluorescens. Slutligen är hydrogeler tillverkade av två lager, med den övre med inbäddade fluorescerande mikrokulor, begränsade till en enda fokalplan. Detta attribut säkerställer att det inte blir någon out-of-fokus ljus stör under imaging. Förekomsten av pärlorna gör prövning såväl av ytans topografi av gelerna så att de är enhetliga och förbättrar prestanda för TFM och MSM24,32,41. Med TFM och MSM är det möjligt att beräkna cell-ECM och cell-cell styrkor respektive celler bosatt på varierande stelhet matriser. Med denna roman analys, är det möjligt att göra sådana mätningar av fysiska krafter genom att jämföra båda bidrag av miljömässiga stelhet och infektion samtidigt. Efter ett sådant tillvägagångssätt har effekt infektionen på värdcellen mekanik under hela dess kurs kan bestämmas. Dessutom utvecklingen av intracellulära stressen i celler kan beräknas med hjälp av MSM och kan användas som ett mått på enskiktslager barriär integritet. Slutligen, flera med tanke på analysen, det är möjligt att samtidigt införa farmakologiska och genetiska störningar med en bakteriell infektion, att undersöka mer ingående det komplexa samspelet mellan mottagande cell mekanik och infektion.

En inneboende begränsning i tekniken ligger i effekt substrat styvheten kan ha på andelen spridning av celler. Vanligtvis i infektion analyser måste vi se till att mottagande cell densiteten under olika förhållanden är samma. Det beror på att cell densiteten av sig själv kan påverka känsligheten för värdar till infektion. HMEC-1 celler som användes som värdceller visar inte en signifikant skillnad i antalet när seedade för 24 h på hydrogels. Dock kan olika celltyper uppvisar differentiell spridning, beroende på hydrogel styvheten, som kan bias infektion studier. Likaså kan infektion bias uppstå när celler utgör inte enskiktslager eller inte fäster bra på hydrogels, som uppstår när vissa celltyper är seedade på mycket mjuk matriser (t.ex., mänskliga navelsträngen endotelceller eller Madin-Darby canine njure epitelceller ympats på 0,6-kPa hydrogels54,55). Vad beträffar patogener är, vissa bakterier (t.ex., Borrelia burdgorferi) kan fästa värd celler och invaderar dem men kan också transmigrate genom dem56. Vi har inte ännu testat om denna analys skulle fungera för patogen själavandring studier, men det verkar möjligt eftersom tidigare studier på neutrofiler transmigrating endothelial celler seedade på PA hydrogeler har dokumenterats för att arbeta framgångsrikt57. Det har varit en hel del studier visar hur man tillverkar polyakrylamid hydrogeler av en given Youngs modul genom att blanda lämpliga koncentrationerna av akrylamid och bis-akrylamid24,25,26 ,27. Det är dock särskilt när man önskar utföra TFM experiment på celler som bor på hydrogels varierande styvhet, kritiska att bekräfta förväntade styvheten i hydrogels antingen via AFM eller andra indrag tekniker58. Små avvikelser från det förväntade värdet kan uppstå på grund av olika lösningsmedel används eller en år akrylamid stamlösning, eller på sätt AFM är mätningar utförs (t.ex., formen på AFM spets). Slutligen är den strategi som presenteras häri baserad på sådd värdceller på 2D matriser, som kan skilja sig från en mer realistisk och fysiologiskt relevanta 3D scenario. Tillverkning 3D geler med avstämbara stelhet, omfattar sådd dem med värdceller och sedan smittar dem med patogener, fortfarande emellertid vissa tekniska svårigheter. Ändå, vi räknar med att inom en snar framtid kommer vi att kunna utöka den aktuella analysen för att studera infektion i en 3D miljö.

Sammanfattningsvis beskrivs protokollet tillsammans med de preliminära resultaten bevisa att denna roman analys kan bli ett mycket användbart verktyg för att studera infektion av vidhäftande värdceller med patogena bakterier på ett kvantitativt sätt och i en mycket mer fysiologiskt relevant miljö än tidigare undersökta. Kraften i fabricera polyakrylamid hydrogels i föreslagna setup ligger i att analysen är kompatibel med utförandet av flera tekniker såsom flödescytometri, immunfärgning följt av ljusmikroskopi och dragkraft tvinga mikroskopi. Analysen kan användas för studier med infektion av annan vidhäftande värd celltyper av patogener, som vi räknar med kommer att ha en betydande inverkan på både nysta upp strategier som patogener infektera värdar och underlätta utvecklingen av Terapeutiska interventioner mot infektioner.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vårt tack till M. sidfot, R. Lamason, M. Rengaranjan och medlemmar av Theriot Lab för deras diskussioner och experimentellt stöd. Detta arbete stöds av NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam stipendiet för avancerad studie (F.E.O.), den Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) och den amerikanska hjärtat Association (E.E.B.). Flödescytometri utfördes vid Stanford delade FACS anläggningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4, (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97, (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3, (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5, (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240, (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14, (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138, (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12, (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24, (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79, (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85, (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108, (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12, (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204, (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90, (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8, (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86, (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15, (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1, (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39, (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7, (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3, (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124, (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71, (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167, (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171, (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509, (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14, (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137, (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7, (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10, (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6, (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7, (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13, (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106, (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3, (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79, (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118, (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12, (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4, (1), 7-20 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics