एक Ecdysone रिसेप्टर-मजबूती, Reversibility, और नगण्य Leakiness के साथ Transgene की जानबूझकर अभिव्यक्ति के लिए विलक्षण जीन स्विच आधारित

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Genetics

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Summary

यहाँ, हम tebufenozide उपचार द्वारा pEUI (+) एकवचन जीन स्विच का उपयोग transgene अभिव्यक्ति का मॉडुलन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद.

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Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

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Abstract

transgene अभिव्यक्ति का सटीक नियंत्रण जैविक और नैदानिक अध्ययन में वांछनीय है । हालांकि, क्योंकि वर्तमान में कार्यरत जीन स्विच के द्विआधारी सुविधा दो चिकित्सीय अभिव्यक्ति इकाइयों के हस्तांतरण एक ही कक्ष में समवर्ती की आवश्यकता है, जीन थेरेपी के लिए प्रणाली के व्यावहारिक आवेदन सीमित है । transgene अभिव्यक्ति प्रणाली को सरल बनाने के लिए, हम एक जीन pEUI के रूप में निर्दिष्ट स्विच उत्पंन (+) transgene अभिव्यक्ति मॉड्यूल का एक पूरा सेट शामिल एक एकल सदिश में । GAL4 डीएनए के शामिल-बंधन डोमेन और संशोधित ईसीआर (GvEcR), एक ंयूनतम VP16 सक्रियकरण डोमेन एक GAL4 डीएनए के साथ जुड़े-बंधन डोमेन, साथ ही साथ एक संशोधित Drosophila ecdysone रिसेप्टर (ईसीआर), नव विकसित एकवचन जीन स्विच अत्यधिक है एक समय और खुराक पर निर्भर तरीके से एक रासायनिक उत्प्रेरण के प्रशासन के लिए उत्तरदायी. pEUI (+) वेक्टर दोनों जैविक अनुसंधान और पूर्व नैदानिक अध्ययन में transgene अभिव्यक्ति के नियंत्रण में सुधार के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण है । यहाँ, हम tebufenozide (Teb) के उपचार के द्वारा वेक्टर pEUI (+) का उपयोग कर एक क्षणिक और स्थिर transgene अभिव्यक्ति के मॉडुलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अतिरिक्त, हम एक रासायनिक उत्प्रेरण के रूप में Teb के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण दिशानिर्देश साझा करते हैं ।

Introduction

कई विभिंन जीन स्विचेस को ठीक सेल संस्कृति और पशु मॉडल में transgene अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता के लिए पता लगाया गया है, सफलता1,2,3की डिग्री बदलती के साथ । संभावित जीन स्विच सिस्टम सहित कई कड़े मानदंडों को पूरा करना चाहिए,: transgene, खुराक के सटीक दिशात्मक अभिव्यक्ति और उत्प्रेरणों के लिए समय पर निर्भर जवाबदेही, प्रमोटर की नगण्य leakiness, transgene के reversibility उत्प्रेरण हटाने के माध्यम से सक्रियण, और सेल लाइनों और प्रयोगशाला जानवरों1,2,3के लिए संतोषजनक विषाक्तता का स्तर । टेट्रासाइक्लिन4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10, सहित कई छोटे अणु उत्प्रेरणों का शोषण किया गया है, और ecdysone11,12,13,14. सामान्य तौर पर, इन प्रणालियों दो या तीन असतत अभिव्यक्ति इकाइयों, जिनमें से एक या दो जिनमें से एक विनियामक तत्व (उत्प्रेरण प्लाज्मिड) है कि एक छोटे से अणु उत्प्रेरण transcriptional गतिविधि हासिल करने के लिए बांध के साथ दो plasmids की आवश्यकता होती है; और एक अंय प्लाज्मिड (प्रभाव प्लाज्मिड) एक विनियामक डीएनए क्षेत्र है कि उत्प्रेरण-बाध्य विनियामक तत्व के उपयोग की अनुमति देता है के नियंत्रण में युक्त transgene । द्विआधारी प्रणाली के मुख्य दोष यह है कि यह दो वैक्टर के सहवर्ती परिचय (उत्प्रेरण और प्रभाव) लक्ष्य कक्ष में की आवश्यकता है । क्षणिक transgene अभिव्यक्ति प्रयोगों में, दो plasmids के एक साथ अभिकर्मक अनिवार्य रूप से कोशिकाओं है कि अकेले या तो उत्प्रेरण या प्रभाव, या सह transfected असमान के साथ transfected है की आबादी पैदा करता है । इसके अतिरिक्त, बाइनरी प्रणाली में स्थिर कोशिका रेखाएं स्थापित करने के लिए एंटीबायोटिक के चयन के कम से दो दौर की आवश्यकता होती है, जो कि समय लेने वाली और श्रमसाध्य है । इस प्रकार, एक सदिश में transgene अभिव्यक्ति और विनियमन के लिए आवश्यक घटकों के सभी संयोजन एक ही कक्ष में सभी आवश्यक तत्वों की सहवर्ती अभिव्यक्ति की गारंटी और transgene अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए अनुमति देने के लिए आदर्श होगा छोटे अणु उत्प्रेरण के साथ उपचार के माध्यम से ।

बाइनरी जीन स्विच की कमियों को दूर करने के लिए हमने हाल ही में एक विलक्षण जीन स्विच विकसित किया, जिसका उपयोग एक Drosophila melanogaster ईसीआर आधारित जीन inducible प्रणाली15ने किया । Ecdysone मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति जब यह ईसीआर/ultraspiracle (खासियत) heterodimer है, जो बारी में डीएनए विनियामक तत्वों के लिए ईसीआर के बंधन में लाती है3,11के लिए बाइंड कर देता है । हड्डीवाला रेटिनॉइड एक्स रिसेप्टर (RXR), कीट खासियत की एक ortholog, रंगरूटों ईसीआर एक सक्रिय transcriptional उत्प्रेरक16बनाने के लिए । इस प्रकार, हड्डीवाला कोशिकाओं या ऊतक, ईसीआर और RXR में एक transgene के लक्षित अभिव्यक्ति के लिए सह होना चाहिए पहले एक साथ व्यक्त ecdysone या उसके एगोनिस्ट द्वारा उत्तेजित किया जा रहा है । ईसीआर-आधारित जीन स्विच की heterodimeric सुविधा के बाद से अंतर्जात RXR स्तर, Padidam एट अलसे प्रभावित किया जा सकता है । ईसीआर डीएनए की जगह-heterologous GAL4 डीएनए के साथ बाध्यकारी और सक्रियकरण डोमेन-बाध्यकारी, दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रोटीन vmw65 (VP16) सक्रियकरण डोमेन ईसीआर ligand-बाध्यकारी डोमेन है, जो तो अंतर्जात RXR को निष्क्रिय हो गया और एक homodimer का गठन करने के लिए जुड़े transcriptional गतिविधि हासिल करने के लिए17. ईसीआर आधारित जीन स्विच और एक chimeric ंयूनतम VP16 सक्रियण GvEcR, जो एक homodimer और cytosol ecdysone, एगोनिस्ट16के अभाव में Teb में स्थानीयकृत गठन के साथ संयुक्त डोमेन के शामिल प्रोटीन के निर्माण से सुधार हुआ था, 18. Teb के लिए बाध्य करके, GvEcR नाभिक को cytosol से अपने उपसेलुलर स्थानीयकरण बदल एक संकर zebrafish E1b ंयूनतम प्रमोटर के शामिल एक दस मिलकर दोहराया ऊपर सक्रियकरण अनुक्रम (UASs) के साथ संयुक्त प्रमोटर को पहचानने के लिए शुरू लक्ष्य जीन की प्रतिलेखन16

के लिए पहले रिपोर्ट ईसीआर आधारित सरल जीन स्विचेस16,18, हम एक एकल वेक्टर में transgene अभिव्यक्ति उत्तेजक के लिए सभी आवश्यक तत्वों के साथ सुसज्जित है, और फिर नामित प्रणाली के द्विआधारी सुविधाओं संयुक्त नव निर्मित वेक्टर, pEUI (+) (GenBank प्रवेश संख्या: KP123436, चित्र 1a)15। GvEcR चालक (इसके बाद चालक) को जवाब देने के प्रभाव दस मिलकर यूएएस एक E1b ंयूनतम प्रमोटर के बाद एक बहु क्लोनिंग साइट (MCS) के साथ EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, और AflII मांयता दृश्यों के लिए अगले दोहराता है (चित्र 1b) । इसके अतिरिक्त, transfected कोशिकाओं के चयन की सुविधा के लिए, एक SV40 प्रमोटर चालित puromycin एन-एसिटाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (पीएसी) जीन चालक और प्रभाव क्षेत्रों के बीच स्थिर सेल लाइनों (चित्रा 1) बनाए रखने के लिए रखा गया था ।

हम pEUI (+) का उपयोग कर transgene अभिव्यक्ति के क्षणिक और स्थिर मॉडुलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । इसके अलावा, हम एक ecdysone एगोनिस्ट के रूप में Teb के सफल प्रयोग के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं ।

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Protocol

1. Transgene उपक्लोनिंग

  1. pEUI (+) के MCS में एक उचित प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइट (या साइटों) का चयन करें, और वांछित दिशा में ब्याज की जीन उपक्लोन (चित्रा 1).
    नोट: EGFP या झंडा epitope-टैग ankyrin दोहराने डोमेन 13A (ANKRD13A) transgene EcoRI के pEUI साइट में उपक्लोन किया गया था (+) वेक्टर एक अनुक्रम में टी-4 डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर-और बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग विधि19
  2. ३७ ° c पर 1 ज के लिए EcoRI के साथ pEUI (+) Linearize । मिक्स ५०/µ एल के रेखीय pEUI (+) के साथ ४० एनजी/µ l के साथ पीसीआर-प्रवर्धित EGFP या ANKRD13A, और 10 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी से पहले कमरे के तापमान (आरटी) में 1 मिनट के लिए टी-4 डीएनए पोलीमरेज़ (1 यू) के साथ प्रतिक्रिया । १०० µ l को सीधे रिएक्शन मिक्सचर के 10 µ l जोड़ें DH10B निंनलिखित परिवर्तन प्रयोग के लिए सक्षम कोशिकाओं ।
    नोट: हालांकि कई प्रतिबंध एंजाइम मांयता साइटों pEUI (+) (चित्र 1b) के MCS में जोड़ा गया है, हम EcoRI साइट में लक्ष्य जीन क्लोनिंग की सिफारिश, बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग प्रौद्योगिकी19,20का उपयोग कर ।
  3. अनुक्रमण द्वारा सम्मिलित करें और फिर अभिकर्मक के लिए उपयुक्त है एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध पुष्टि.

2. क्षणिक अभिकर्मक और Teb उपचार

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) के 5 मिलीलीटर में ताजा पारित HEK293 कोशिकाओं से युक्त चार सेल संस्कृति व्यंजन (६० mm व्यास) 5-10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एंटीबायोटिक दवाओं (१०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin) के साथ पूरक तैयार करें । इसके बाद, "सेल संस्कृति माध्यम" या बस "संस्कृति माध्यम" FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक DMEM का प्रतिनिधित्व करता है । ३७ ° c पर HEK293 कोशिकाओं को बनाए रखें ।
  2. Transfect 1 ५० पर HEK293 कोशिकाओं में शुद्ध डीएनए के µ जी-६०% घनत्व का उपयोग कर 3 µ एल के अभिकर्मक रिएजेंट । डीएनए युक्त मंदक (DMEM बिना FBS और एंटीबायोटिक्स) के २०० µ एल के लिए अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें । आरटी में 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन के बाद, संस्कृति पकवान पर HEK-२९३ कोशिकाओं को मिश्रण जोड़ें । अभिकर्मक के लिए दो व्यंजन का प्रयोग करें, और अंय दो नियंत्रण के रूप में इलाज छोड़ दें ।
  3. 12-24 ज ऑफ अभिकर्मक के बाद, Teb (अंतिम सांद्रता, ०.२-10 µmol) को transfected नमूनों में से एक में और गैर-transfected नियंत्रणों में से किसी एक पर जोड़ें । प्रायोगिक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित अंय दो नमूने छोड़ दें ।
    नोट: Teb स्टॉक समाधान (५० dimethyl sulfoxide में भंग मिमी) सेल संस्कृति माध्यम में पतला किया जा सकता है, DMEM, या फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) एक उचित एकाग्रता पर प्रयोगात्मक मापदंडों के आधार पर संस्कृतिक कोशिकाओं को जोड़ने से पहले. हालांकि, जलीय समाधान में Teb के कम घुलनशीलता के कारण, मध्यम में Teb की एक उच्च एकाग्रता के साथ एक मास्टर मिश्रण तैयार करने से बचें; इसके बजाय, वांछित एकाग्रता पर Teb युक्त ताजा माध्यम के साथ पूरा सेल संस्कृति माध्यम की जगह ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12-48 ज के लिए Teb-इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं खेती ।
  5. यदि EGFP डालने का उपयोग कर, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप ( चित्रा 2) के तहत EGFP अभिव्यक्ति का विश्लेषण । अंयथा, एक immunoblotting परख के लिए कोशिकाओं फसल ।
    1. immunoblotting परख के लिए, दो बार बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ कोशिकाओं कुल्ला और फिर उंहें परिमार्जन बाहर एक सेल खुरचनी का उपयोग कर ।
    2. कोशिकाओं को जमा करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 18-25 डिग्री सेल्सियस (आरटी) पर 2 मिनट के लिए २१,००० x जी में फसल नीचे स्पिन ।
    3. पंजाबियों को पूरी तरह से खारिज करने के बाद बर्फ की ०.५ मिलीलीटर-शीत स्तनधारी प्रोटीन निष्कर्षण एजेंट (एम प्रति) जोड़ें, एक साथ को छेड़ने वाला अवरोध करनेवाला के साथ (5 µ l 100x चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल), गोली करने के लिए अगर कोशिकाओं एक ६० mm डिश में कल्चरल हैं ।
    4. pipetting के कई दौर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और फिर 18-25 डिग्री सेल्सियस (आरटी) में 15 मिनट के लिए निलंबित कोशिकाओं की मशीन ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २१,००० x g पर सेल lysate स्पिन ।
    6. एक ताजा १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जलीय supernatant स्थानांतरण ।
    7. immunoblotting द्वारा supernatant विश्लेषण, उचित एंटीबॉडी के साथ मानक प्रोटोकॉल के बाद ।

3. pEUI (+) जीन स्विच के जीनोमिक एकीकरण के साथ स्थिर HEK293 सेल लाइनों की जनरेशन

  1. Transfect 5-10 शुद्ध pEUI के µ जी (+) HEK293 कोशिकाओं में transgene के साथ कि ५०-६०% एक ९० मिमी व्यास सेल संस्कृति डिश में धाराप्रवाह हैं, का उपयोग कर 15-30 µ के अभिकर्मक एल । डीएनए युक्त मंदक (DMEM बिना FBS और एंटीबायोटिक्स) के ५०० µ एल के लिए अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें । आरटी में 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन के बाद, HEK-२९३ कोशिकाओं को संस्कृति पकवान पर मिश्रण जोड़ें ।
  2. अभिकर्मक के बाद, transfectants विकसित करने के लिए अनुमति देते है और गैर के तहत puromycin प्रतिरोध जीन उत्पादों-चयनात्मक संस्कृति मध्यम (puromycin के बिना) ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24-48 ज के लिए व्यक्त करते हैं ।
  3. trypsinization द्वारा कल्चरल व्यंजन से कोशिकाओं को अलग कर देना. संस्कृति माध्यम को खारिज करने के बाद, पूर्व गर्म पंजाबियों (३७ ° c) के साथ transfectants कुल्ला, ०.२५% trypsin/ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें । पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम (10 मिलीलीटर, ३७ डिग्री सेल्सियस) जोड़कर trypsin/EDTA शमन के बाद, फसल एक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में केंद्रापसारक के बाद २१,००० एक्स जी में 2 मिनट के लिए पर 18-25 ° c ।
  4. transfectants पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम (३७ डिग्री सेल्सियस) के ५० मिलीलीटर में पुनः निलंबित, और ९० मिमी ताजा सेल संस्कृति व्यंजन में कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर स्थानांतरण । संस्कृति ३७ ° c पर कोशिकाओं को ५० तक-६०% puromycin उपचार से पहले प्रवाह (सामांय में, यह लगभग लेता है 24-48 एच) ।
  5. सेल संस्कृति माध्यम में ३७ ° c पर transfectants खेती 3-4 सप्ताह के लिए 3 µ g/एमएल puromycin के साथ पूरक । चयन अवधि के दौरान चयन दबाव बनाए रखने के लिए हर 2-3 दिनों में puromycin (3 µ g/mL) युक्त कोशिका संस्कृति माध्यम को बदलें । जब कोशिकाओं को पूरी तरह से धाराप्रवाह हो जाते हैं, उंहें puromycin-संस्कृति माध्यम से युक्त चरणों में ३.३-३.४, प्रक्रियाओं के बाद विभाजित । यदि आवश्यकता न हो तो शेष कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम में त्यागें ।
    नोट: Puromycin चयन शर्तें विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए प्रायोगिक रूप से स्थापित की जानी चाहिए । हम सेल संस्कृति माध्यम में puromycin के 3 µ जी/ यह गैर में सेल मौत transfected HEK293 प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था ।
  6. व्यक्तिगत कॉलोनियों से कोशिकाओं फसल, एक क्लोनिंग सिलेंडर का उपयोग कर, और निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    1. कक्ष संस्कृति माध्यम को त्यागें । थाली कुल्ला पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) के साथ दो बार अस्थायी कोशिकाओं को हटाने के लिए पंजाब.
    2. बाँझ संदंश का उपयोग करना, व्यक्तिगत कॉलोनियों पर क्लोनिंग सिलेंडर सेट.
    3. प्रत्येक सिलेंडर के लिए ०.३५% trypsin/EDTA की ०.२ मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. 1 मिनट के लिए ३७ ° c पर पकवान गर्मी जब तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, और फिर पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) के कुछ बूंदें जोड़ें संस्कृति मध्यम सिलेंडरों के लिए ।
    5. प्रत्येक सिलेंडर से कोशिकाओं को एक 6-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए स्थानांतरण, संस्कृति मध्यम के 2 मिलीलीटर और 1 µ g/puromycin के एक कुआं में एमएल के साथ ।
      नोट: जब कोशिकाओं धाराप्रवाह हो, ऊपर संस्कृति पैमाने । अब क्लोन (ओं) की स्थापना की जा सकती है ।
  7. कोशिका संस्कृति मध्यम में व्यक्तिगत क्लोन को बनाए रखने के साथ पूरक 1 µ g/puromycin के एमएल ।
  8. Teb उपचार के लिए उनकी संवेदनशीलता का परीक्षण करके व्यक्तिगत कॉलोनियों को मान्य (अंतिम एकाग्रता, 10 µ मीटर) के लिए 24 घंटे immunoblotting के साथ transgene के अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण करके Teb करने के लिए क्लोन की जवाबदेही का परीक्षण. एक वांछित क्लोन (या क्लोन) का चयन करें । transgene के प्रेरण स्तर का विश्लेषण करने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12-48 ज के लिए संस्कृति माध्यम में एक Teb-इलाज और एक अनुपचारित नमूना खेती । transgene की अभिव्यक्ति स्तर immunoblotting के माध्यम से मापा जा सकता है, चरणों में प्रक्रियाओं का पालन 2.5.1-2.5.7.

4. Teb की कमी

  1. Teb-मुक्त माध्यम के साथ कोशिका संस्कृति माध्यम युक्त Teb की जगह से Teb उत्तेजनाओं बुझाने ।
    नोट: यह पहली बार एक नई संस्कृति पकवान पर कोशिकाओं reसीडिंग के बिना विकास मीडिया की जगह की सिफारिश की है । अवशिष्ट Teb को प्लास्टिक डिश से चिपके हुए प्रतीत होता है और transgene की एक मजबूत पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति में लाना होगा । एक नई संस्कृति की थाली पर कोशिकाओं reसीडिंग करने से पहले, फसल की कोशिकाओं को या तो संस्कृति माध्यम या पंजाबियों के साथ कई बार कुल्ला ।
    1. trypsinization द्वारा कल्चरल व्यंजन से कोशिकाओं को अलग कर देना. संस्कृति माध्यम युक्त Teb खारिज करने के बाद, Teb-उत्तेजित कोशिकाओं को दो बार कुल्ला पूर्व गर्म पंजाब के साथ (३७ ° c), जोड़ें ०.२५% trypsin/EDTA की 1 मिलीलीटर, और 1 मिनट के लिए मशीन में ३७ ° c । पूर्व गर्म Teb-मुक्त संस्कृति मध्यम (10 मिलीलीटर, ३७ डिग्री सेल्सियस) जोड़कर trypsin/EDTA शमन के बाद, फसल एक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में केंद्रापसारक के बाद २१,००० x g पर 2 मिनट के लिए 18-25 ° c ।
    2. ५० मिलीलीटर पूर्व गर्म Teb-मुक्त संस्कृति मध्यम (३७ डिग्री सेल्सियस), और ३ ६० mm ताजा सेल संस्कृति व्यंजन में कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर स्थानांतरण में कोशिकाओं को पुनः निलंबित । संस्कृति क्रमशः 24, ४८ और ७२ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं ।
    3. फसल अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं और immunoblotting का उपयोग करके transgene के अभिव्यक्ति स्तर को मापने ।
      नोट: इन प्रायोगिक शर्तों के तहत, transgene अभिव्यक्ति undetectable लगभग 3 दिनों के बाद Teb में कोशिकाओं की संस्कृति-मुक्त सांस्कृतिक माध्यम (चित्रा 3) बन गया । transgene के व्यंजक स्तर को immunoblotting द्वारा मापा जा सकता है, 2.5.1-2.5.7 चरणों के अनुसार.

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Representative Results

GvEcR आधारित एकवचन जीन स्विच को फिगर 1aमें दर्शाया गया है । pEUI (+) वेक्टर Teb के साथ उपचार द्वारा विनियमित transgene अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया था । pEUI के प्रभाव क्षेत्र (+) एक 10xUAS और एक E1b ंयूनतम प्रमोटर एक MCS युक्त EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, और AflII प्रतिबंध एंजाइम मांयता साइटों के द्वारा पीछा शामिल हैं । MCS (चित्र 1b) के पीछे एक SV40 पॉली (A) सिग्नल जोड़ा गया था । एक पीएसी जीन pEUI के चालक और प्रभाव क्षेत्रों के बीच डाला गया था (+) puromycin करने के लिए प्रतिरोध प्रदान करने के लिए ।

गतिविधि और pEUI (+) के leakiness का मूल्यांकन करने के लिए, हम MCS (pEUI (+)-EGFP) के EcoRI साइट में, क्षणिक transfected प्लाज्मिड कोशिकाओं में निर्माण HEK293, और 24 ज के लिए अलग सांद्रता पर प्रशासित Teb के EGFP का क्लोन ( चित्र 2) । जबकि नकली वेक्टर transfectants फ्लोरोसेंट संकेतों Teb उपचार की परवाह किए बिना नहीं दिखाया (चित्रा 2a, बी), pEUI (+)-EGFP transfectants उत्तरोत्तर Teb की बढ़ी हुई राशि के लिए संवेदनशील बन गया (चित्रा 2c-एफ ). इससे भी महत्वपूर्ण बात, pEUI (+)-Teb के उपचार के बिना EGFP transfectants एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 2c) के तहत कोई पता लगाने वाला EGFP संकेतों में लाना नहीं था ।

आगे pEUI की जवाबदेही को मांय (+) Teb करने के लिए, हम एक ध्वज epitope क्लोन-EcoRI के pEUI साइट (+) में ANKRD13A जीन टैग, HEK293 कोशिकाओं में निर्माण हस्तांतरित, और फिर उंहें puromycin चयन करने के लिए 3 सप्ताह के लिए स्थापित करने के अधीन ANKRD13A transgene के साथ एक वांछित कक्ष रेखा । हम Teb के साथ एक 24 एच उपचार के बाद ANKRD13A transgene की अभिव्यक्ति का विश्लेषण और सेल लाइन की स्थापना की अच्छी तरह से जवाब (चित्रा 3) । हम आगे सांस्कृतिक मीडिया से Teb घट कर pEUI (+) जीन स्विच के reversibility का प्रदर्शन किया. के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, ANKRD13A अभिव्यक्ति नहीं रह गया था जब हम Teb में कोशिकाओं को संस्कृति मुक्त मीडिया का पता लगाने में ।

Figure 1
चित्र 1 . pEUI के योजनाबद्ध आरेख (+). () pEUI (+) के सदिश मानचित्र का निर्माण किया गया. एक सीएमवी प्रवर्तक ड्राइव GvEcR के गठन की अभिव्यक्ति । Teb-बाउंड GvEcR नाभिक में translocate होगा और 10xUAS सीआईएस-अभिनय विनियामक अनुक्रम transgene में डाला MCS की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करने के लिए बाध्य करेगा । (B) में वर्ग कोष्ठक के बीच अनुक्रम जानकारी (A) में pEUI (+) का संपूर्ण प्रभाव अनुक्रम होता है । तीर व्यक्तिगत प्रतिबंध एंजाइम मांयता MCS में शामिल साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . GvEcR आधारित एकवचन जीन स्विच Teb के उपचार के लिए प्रतिक्रिया करता है । HEK293 कोशिकाएं विनिर्दिष्ट डीएनए के निर्माण से transfected थीं । अभिकर्मक के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं के संकेत एकाग्रता पर Teb के साथ 24 घंटे के लिए प्रेरित किया गया । EGFP transgene गतिविधि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया । pEUI (+) के साथ मॉक transfectants (A) या बिना (B) Teb उपचार के साथ कोई भी detectable प्रतिदीप्ति नहीं दिखाया । (-) pEUI में फ्लोरोसेंट तीव्रता (+)-EGFP-transfected कोशिकाएं Teb खुराक-निर्भर तरीके से बढ़ जाती हैं । स्केल बार, 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . HEK293 कोशिकाओं छुरा बंदरगाह pEUI (+)/FLAG-ANKRD13A जवाब reversibly के प्रशासन को Teb । epitope-टैग ANKRD13A अभिव्यक्ति फ्लैग करें Teb (१.५ µ m) उपचार द्वारा ट्रिगर किया गया था । Teb के साथ उपचार के 24 ज के बाद, कोशिकाओं को समय की संकेत राशि के लिए Teb ड्रॉप आउट मीडिया के लिए बंद कर दिया गया । ANKRD13A की सापेक्ष राशि पश्चिमी सोख्ता द्वारा विरोधी ध्वज एंटीबॉडी के साथ मापी गई । α-tubulin के अंतर्जात व्यंजक स्तर को नियंत्रण के रूप में एंटी-α-tubulin एंटीबॉडी के साथ मापा गया था. सफ़ेद तारांकन एक अज्ञात क्रॉस-प्रतिक्रियाशील प्रजातियों को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक द्विआधारी जीन अभिव्यक्ति स्विच का उपयोग कर के मुख्य दोष एक साथ लक्ष्य कक्ष में दो अलग plasmids (चालक और प्रभाव) देने की जरूरत है । यह plasmids के एक असमान वितरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और स्विच के एक असंगत प्रतिक्रिया में परिणाम1,2,3. दो वेक्टर प्रणाली की एक और कमी यह है कि एंटीबायोटिक चयन के दो दौर की एक ंयूनतम के लिए होनहार सेल लाइनों की पहचान की आवश्यकता है । इसलिए, एक जीन inducible एक इकाई शामिल कैसेट लंबे समय से जैविक अनुसंधान में उपयोग के लिए मांग की गई है । pEUI (+) एकवचन transgene अभिव्यक्ति स्विच एक एकल सदिश transgene उत्तेजना के लिए आवश्यक सभी विनियामक इकाइयों के साथ सुसज्जित में निहित है । इस प्रकार, transgene के प्रेरण स्तर, pEUI में उपक्लोन (+), क्षणिक अभिकर्मक प्रयोग और रासायनिक उत्प्रेरण की खुराक में डीएनए transfected की मात्रा पर निर्भर है । इसके अलावा, हम आगे pEUI के उपयोग का परीक्षण (+) वेक्टर एक स्थिर सेल लाइन पैदा करने से ANKRD13A transgene15की एक प्रतिलिपि युक्त । स्थापित सेल लाइन Teb उपचार के लिए उच्च संवेदनशीलता दिखाया (चित्रा 3). सामूहिक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता, reversibility, और कम leakiness15, अभिव्यक्ति स्तर में सीमित भिन्नता के साथ pEUI बनाने के लिए (+) लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक मूल्यवान आणविक और सेलुलर उपकरण.

विभिंन inducible जीन प्रणालियों के अलावा, हम GvEcR-निर्भर जीन प्रेरण कैसेट का चयन किया । GvEcR अन्य प्रणालियों पर कई फायदे हैं: पहला, lipophilic प्रकृति (Teb सहित) रासायनिक उत्प्रेरण के रूप में इस्तेमाल कई ecdysone सादृश्य सेलुलर झिल्ली के कुशल प्रवेश के लिए लाभप्रद है21; दूसरा, रीढ़ में कोई ईसीआर orthologs नहीं हैं, इसलिए ecdysteroid एगोनिस्ट परमाणु रिसेप्टर्स व्यक्त की endogenously के समारोह को प्रभावित नहीं करते21,22; तीसरा, ecdysteroids रीढ़ में अहानिकर है और तेजी से साफ कर दिया संचलन प्रणाली से vivo21,23 में; और चौथे, के बाद से कई ecdysone एगोनिस्ट इस प्रकार अब तक विकसित किया गया है, इष्टतम आकार छोटे अणुओं का चयन करके, शोधकर्ताओं अवांछनीय जटिलताओं13,22,24से बच सकते हैं । हालांकि pEUI (+) Teb के लिए उच्च संवेदनशीलता से पता चलता है, pEUI की जवाबदेही का परीक्षण (+) अन्य ecdysteroid एगोनिस्ट के लिए मूल्यवान साबित हो सकता है. गैर-स्टेरॉयड ईसीआर एगोनिस्ट के अस्तित्व, जैसे methoxyfenozide, कि पानी में अधिक घुलनशील हैं Teb24 से pEUI (+) के अनुप्रयोगों के दायरे को चौड़ा कर सकते हैं । हालांकि pEUI में transgene की अभिव्यक्ति (+) है कि एक Tet-On प्रणाली15में से अपेक्षाकृत कमजोर है, transgene प्रेरण के स्तर VP16 transactivation डोमेन की एक बहु की नकल के अलावा द्वारा संवर्धित किया जा सकता है (नहीं दिखाया गया डेटा). हाल ही में जीन थेरेपी अनुप्रयोगों कोशिकाओं या ऊतकों कि संबंधित कार्यात्मक जीन उत्पाद आनुवंशिक रोग25,26,27के कारण में एक लक्ष्य जीन की सुरक्षित प्रसव पर ध्यान केंद्रित किया है । हालांकि, गैर-विनियमित transgene ऊतक के नियंत्रण के तहत विशिष्ट या वायरल गठन प्रमोटरों लक्ष्य जीन है, जो स्थानीय ऊतक नुकसान की संभावना28,29तरक्की की हाइपर अभिव्यक्ति बटोरना कर सकते हैं । इस प्रकार, जीन थेरेपी के लिए एक विश्वसनीय जीन स्विच के आवेदन अवांछित जटिलताओं से बचने सकता है । pEUI (+) वेक्टर जैविक और नैदानिक अध्ययनों में transgene अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक सुविधाजनक और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है । वर्तमान में, हम एक विलक्षण lentiviral वेक्टर विकसित कर रहे है GvEcR के आधार पर हमारे सिस्टम के आवेदन रेंज में वृद्धि हुई है ।

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Disclosures

हम इस रिपोर्ट से संबंधित हित का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक एस वाई चोई (Chonnam राष्ट्रीय विश्वविद्यालय) बहुमूल्य टिप्पणियां और हमारी पांडुलिपि के गहन पढ़ने के लिए धंयवाद । इस काम को Chungnam नेशनल यूनिवर्सिटी के एक रिसर्च फंड ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

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