Name: 주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 학습하세요 Drosophila 감각 신경 손상 모델을 활용한 생체 내 실시간 영상 및 투광자 레이저 절단 기법을 통한 신경재생 촉진 및 억제 인자 선별 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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우리는 기술 지원에 대 한 제시카 Goldshteyn 감사합니다. 노래 랩에서 일 NIH 그랜트 R00NS088211, 그리고 지적 및 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 새로운 프로그램 개발 수상에 의해 자금이 다.

1입니다. 문화 접시와 병의 준비
<ol><li>포도 주스 한 천 배지 준비<ol>
<li>비 커와 일시적으로 agar 완전히 녹아 때까지 저 어 약 4-5 분 동안 전자 레인지에 한 천 분말, 200ml 포도 주스와 192 mL ddH2O 10 g를 추가 합니다.</li>
		<li>약 60 ° c 솔루션 진정 연기 후드, 4.2 mL 95% 에탄올과 4.0 mL 빙 초 산을 추가 합니다. 잘 ddH2오 믹스 400 mL에 솔루션의 전체 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>각 35 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 약 2-3 mL를 추가 합니다. 400 mL 포도 주스 한 천 해결책의 총 약 120-150 번호판을 확인 합니다.</li>
		<li>진정 하 판이 고 공고히 한 솔루션 10 분 기다립니다. 한 천 배지 각자 밀봉된 애 가방에 포도 주스를 포장 하 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drosophila 문화 병의 준비<ol>
<li>블레이드를 사용 하 여 초파리 문화 병의 1 개의 벽에 1.5 c m 측면 길이 삼각 구멍 펀치와 환기에 대 한 면의 2-2.5 cm 직경 공 구멍을 채우십시오.</li>
		<li>효 모 반죽의 0.5 c m3 에 대 한 보충 포도 주스 한 천 배지와 병을 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 초파리 애벌레의 수집
<ol><li>성인 파리의 십자가를 설정합니다<ol>
<li>장소 10 처녀 암컷과 5 남성 성인 문화 병 포도 주스 한 천 배지와 연결에 함께 난다.</li>
		<li>병 바닥까지 25 ° C에서 되도록 놓습니다 포도 주스 한 접시에 알을 낳는 것 이다 파리. 하루에 적어도 한 번 효 모 반죽과 접시를 변경 합니다. 균질 성 발달 단계의 애벌레의 수확을 허용, 2-h 컬렉션 기간에 대 한 20 개 이상의 처녀 여성 및 10 남성 2.1.1 단계에서 시작 합니다.</li>
		<li>0.5% 프로 산 성 솔루션에 배어와 젖은 조직, 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에 25 ° C에서 격판덮개 문화. 산소 흐름을 차단 하지 않습니다 있도록 조직 정렬. 참고: 프로 산 솔루션 접시에 습도 유지 하 고 곰 팡이의 성장을 피하기 위해 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>특정 나이의 애벌레를 수확<ol>
<li>효 모 반죽 없이 새로운 포도 주스 한 접시에 원하는 단계, 예를 들어 2nd 3rd 탈피 애벌레 (AEL) 누워 계란 후 48-72 h에 애벌레를 전송 집게의 쌍을 사용 합니다.</li>
		<li>누 룩에서에서 제거 애벌레의 피부 하 여 레이저 axotomy 및 이미징 효 잠재적인 방해에서 방지 하기 위해 새로운 접시에 주변 탐색 합니다. 또는, PBS의 접시에 그들을 세척 하 고 티슈 페이퍼의 조각에 잠시 건조 하 여 애벌레 청소 철저 하 게.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 2-광자 부상과 Confocal 영상
<ol><li>현미경 설치 참고: 두 광자 레이저 스캔 현미경 confocal 레이저는이 실험을 위해 사용 되었다 하지만 해당 설치 다른 시스템도 충분 합니다. 두 광자 레이저 (930 nm) 부상과 아르곤 레이저를 전달 하기 위해 사용 되었다 (488 nm) GFP의 confocal 영상을 위해 사용 되었다.<ol>
<li>각 세션의 시작 부분에서 2 광자 레이저 / confocal laser(s)와 현미경 설정. 이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>930에서 2 광자 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 2 광자 부상, nm (1950 mW).<ol>
<li>라인 스캔 모드를 선택 합니다. 줄곧 pinhole을 엽니다. ~ 20%에 레이저 강도 증가 (390 mW).</li>
			<li>프레임 스캔으로 512 x 512를 선택 합니다. 최대 스캐닝 속도 (일반적으로 0.77 µs에 픽셀 유지 시간)를 사용 합니다. 평균 수는 1 비트 깊이 8 비트 확인 합니다.</li>
			<li>하 ~ 750, 고 0 오프셋 설정된 얻을.</li>
			<li>2 P GFP 930 제거를 쉽게 허용으로 실험 프로토콜 재사용 미래에이 사전 설정 저장 실험.</li>
		</ol>
</li>
		<li>488에 아르곤 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 confocal 영상, 대 한 뉴 멕시코:<ol>
<li>인수 탭 그리고 Z-스택을 선택 합니다.</li>
			<li>"레이저"에서 488 nm의 아르곤 레이저의 전원을 켭니다.</li>
			<li>채널선택 488 m m 레이저, 레이저 파워 5-10%를 증가 이동 합니다. Pinhole에 대 한 1-2 공기 단위 (AU)를 사용 합니다. 650에 이득을 조정 합니다.</li>
			<li>획득 모드에서 프레임 스캔으로 1024 x 1024를 선택, 최대 검색 속도, 2의 평균 수 8 비트의 비트 심도 사용 하 여.</li>
			<li>GFP 이미징이 미리 설정된 실험 프로토콜을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>애벌레 마 취 diethyl 에테르와 장착<ol>
<li>증기 두건에서 15 cm 플라스틱 페 트리 접시에에서 60-m m 유리 접시를 놓습니다. 배 고 누워 유리 접시의 바닥에 휴지 조각 다음 조직에 포도 주스 한 접시를 놓습니다. 유리 그릇에 휴지가 젖 었는 접시에 남아 있는 액체 에테르의 레이어는 포인트 diethyl 에테르를 추가 합니다. 항상 뚜껑을 유지.</li>
		<li>준비 halocarbon의 한 방울을 유리 슬라이드 중앙에 27 오일. 4 관광 명소는 coverslip 지원 슬라이드의 네 모퉁이에 진공 그리스의 추가 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 청소 유 충 데리 러와 60 m m 유리 접시에 한 접시에 그것을 배치. 유리 접시의 뚜껑을 커버 하 고 유 충 이동 중지 될 때까지 기다립니다. PNS 부상/이미징, 유 충을 꺼내 꼬리 중지 꿈 틀 자 마자. CNS에 대 한 전체 애벌레 움직이지 않는, 될 때까지 기다릴 특히 머리 세그먼트. 참고: 에테르 노출의 타이밍은 중요 합니다. 토론을 참조 하십시오.</li>
		<li>신중 하 게 마 취 유 충을 선택 하 고 슬라이드에 halocarbon 오일 방울 머리 똑바로 장소. 슬라이드 위에 coverslip을 추가 합니다. 부드러운 압력을 사용 하 여 때까지 유 충 (그림 1A)를만 지는 coverslip에 밀어.</li>
		<li>그는 신경/축 삭/모 수석의 현미경 렌즈에 가까운 위쪽에 왼쪽 이나 오른쪽, 애벌레를 향해 coverslip을 부드럽게 눌러 유 충의 위치를 조정 합니다.</li>
		<li>모두는 tracheas 표시 되도록 PNS 부상, 유 충 등 사이드를 탑재 합니다. 다음 클래스 III 다 신경 축 삭 (그림 1B 및 1 C), 클래스 4 다 신경 축 삭 (그림 1B , 1E), 부상에 대 한 90도 또는 ~ 30 클래스 IV 다 신경 모 수석 (부상도 부상에 대 한 왼쪽 유 충 ~ 30도 롤 그림 2A)입니다.</li>
		<li>CNS 상해에 대 한 관심의 영역이 z-평면에서 현미경 렌즈에 가장 가까운 되도록 완벽 하 게 복 부 쪽 (그림 3A), 수 유 충을 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>두 광자 레이저에 의해 부상<ol>
<li>현미경 애벌레와 슬라이드를 놓고 무대에서 슬라이드 홀더를 가진 장소에서 안전 합니다. 유 충을 찾을 수 (0.3 없음) X 10 사용 하 여 목적.</li>
		<li>coverslip에 객관적인 오일 1 방울을 추가, (1.3 없음) X 40으로 전환 목표는 초점을 조정 하 고.</li>
		<li>스캔 모드를 전환 하 고 실험 프로토콜 2 P GFP 930 절제를 다시 사용 합니다. Pinhole 줄곧 열 다는 것을 확인 하십시오. 참고: 구성 해야 최적화 개별 시스템에 기반으로 합니다.</li>
		<li>(ROI), 관심 영역을 찾으려고 라이브 모드를 시작 하 고 적절 한 확대와 좋은 이미지 품질을 달성 하기 위해 설정을 세부적으로 조정할. 참고:이 단계의 목적은 최고의 품질의 이미지를 복용 하는 것 보다는 신경/축 삭/모 수석, 다치게 하 찾는 것입니다. 따라서, 최소한의 설정 대상 영역을 시각화 하기 위해 충분 한를 사용 하 여 노출 과도 또는 photobleaching를 피하기 위하여.</li>
		<li>자르기 단추를 사용할 수 있게 됩니다 있도록 라이브 검색을 중지 합니다. 스틸 이미지는 로드맵 역할을 하자. 자르기 기능을 선택 하 고 스캔 창 부상 될 대상에 초점을 조정 합니다.</li>
		<li>상해의 예비 사이트의 크기를 투자 수익을 줄일 수 있습니다. 예를 들어 그냥 축 삭 또는 상해의 정밀도 보장 하 고 주변 조직에 손상을 줄일 수 있는 모 수석의 폭을 커버. 필요한 경우 확대 투자 수익에 자르기 전에 더 정확한 부상에 대 한 허용 합니다.</li>
		<li>새로운 이미징 창을 엽니다. 스캔 속도 감소 시키고 레이저 강도 증가 한다. 라이브 모드에서 스캔 조직 형광 신호에 따라 레이저 강도 증가 결정 합니다.</li>
		<li>일반적으로, PNS 부상에 대 한 25% 및 VNC 부상에 대 한 50-100%에서 시작 하는 2 광자 레이저 강도 설정 합니다. PNS 축 삭 상해에 대 한 레이저 강도 ~ 480 mW 및 픽셀 인지 확인 유지 시간 8.19 μ s 이다. VNC 축 삭 상해에 대 한 레이저의 강도 및 픽셀 유지 시간은 일반적으로 965-1930 년 mW 8.19 32.77 µs, 각각 확인 합니다.</li>
		<li>연속 스캔을 시작 합니다. 연속 단추를 가리키면 커서를 둡니다. 이미지에 주의깊게 감시 하 고 형광에 있는 급격 한 증가 관찰 하자마자 검사를 중지 합니다. 참고: 형광 스파이크의 모양을 부상 사이트에 자동 형광 때문 이다.</li>
		<li>설정을 다시 사용 하 여 라이브 모드로 다시 전환 합니다. 그냥 초점을 조정 하 여 대상 관심 영역을 찾아. 참고: 성공적인 상해의 좋은 표시는 작은 분화구, 고리 모양의 구조, 또는 부상 사이트에서 지역화 된 파편의 외관 이다.</li>
		<li>다음 뉴런에 이동 하 고 반복 단계 3.3.5, 하나의 동물에 여러 신경 손상에서. 또는 점차적으로 증가 하는 힘 및 초기 부상 충분 하지 않은 경우 검사 속도 줄이는 동안 3.3.5 단계를 반복 합니다. 참고: 경우에는 레이저 파워는 너무 높은, 큰 손상된 영역 표시 됩니다 후 부상 라이브 스캔 이미지에. 너무 많은 부상 유 충의 죽음을 일으킬 수 있습니다.</li>
		<li>신중 하 게 제거 하는 coverslip 고 부상된 유 충 효 모 반죽과 새로운 접시에 전송 유 충을 복구 합니다. 집게;와 한 접시에 여러 동굴을도 랑 또는, 전체 접시 접시 밖으로 크롤 링 하는 유 충의 가능성을 줄이기 위해 사용 하는 대신 접시에 한 천의 섬을 확인 합니다.</li>
		<li>젖은 조직 (0.5% 프로 산 솔루션 젖 었)와 문화 실내 온도 또는 25 ° C에서 60 mm 페 트리 접시에 접시를 넣어 참고: 유 충 약 25 ° c.에에 비해 실 온 (22 ° C)에서 추가 일에 대 한 애벌레 단계에 유지 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이후 부상 confocal 영상<ol>
<li>이미지 마 취와 다음 confocal 레이저 이미징 단계 3.2에서 장착의 동일한 절차를 사용 하 여 유 충을 준비 하 여 원하는 시간 지점에서 부상된 유 충. 참고: 이미지 확인 axonal 상해 상해 (AI) 후 24 시간 및 48 h AI (클래스 4 다 신경) 또는 72 h 재생을 평가 하기 위해 AI (클래스 III 다 신경) 유 충.</li>
		<li>10 X 목표를 사용 하 여 유 충을 찾아 (0.8 없음) X 25로 전환 후 목표. GFP 이미징실험 프로토콜을 다시 사용 합니다.</li>
		<li>라이브 버튼을 클릭 하 고 이전 부상 같은 뉴런을 찾을.</li>
		<li>라이브 검색 창에서 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 설정 합니다. 중지를 Z 스택 이미지를 얻으려고 시작 실험 을 클릭 합니다. 참고: 재생의 정량화가 가능한 이미지를 캡처할 때 정규화 지점 (축 삭 수렴 지점) 포함 되어 있는지 확인 (그림 1D, 1 층)-이 설명 데이터 분석 섹션에서 추가.</li>
		<li>전환 이미지 처리하, 촬영, 이미지를 선택 하 고 최대 강도 투영을 생성. Z-스택 및 최대 강도 프로젝션 이미지를 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>처리 하 고 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 계량.</li>
	<li>PNS에서 축 삭 재생의 정량화<ol>
<li>재생 비율, lesioned 했다 모든 axons 중 축 삭 재생의 %는 계산 합니다. 으로 부상 사이트 넘어 regrows 재생성으로 축 삭을 점수.</li>
		<li>측정 재생 길이, 축 삭 길이 증가입니다. ImageJ로 측정, 세그먼트 선 도구를 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 추적 하 고 분석 메뉴에서 측정값 을 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 대표 하는 라인의 길이.</li>
		<li>정규화 된 축 삭 길이 증가 재생 지를 계산 합니다. 참고: 축 삭 길이 셀 바디와 수렴 하는 지점 (DCAC)-축 삭 길이/DCAC (그림 1D 및 1F) 축 삭 사이의 거리에 의해 정규화 됩니다. 이 값 애벌레 스케일링은 어떤 axonal 성장에 대 한 계정을 수 있습니다. 양수 값 재생, 0 의 값은 아무 재생 나타내고 음수 값은 철회.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모 수석 중생의 정량화<ol>
<li>재생 비율, 다 신경 절단 하는 모든 사람들 사이에서 %는 분명 모 수석 자라나 표시를 계산 합니다. 참고: 모 수석 자라나는 경우 새로운 긍정적인 dendrites 철회 수지상 줄기에서 및 부상 사이트 넘어 밖으로 regrow로 점수입니다. 부상 사이트 결정 랜드마크로 그리고 어떤 경우에, 잔여 상해 유도 autofluorescence 쉽게 표시.</li>
		<li>지 포인트의 증가, 부상 후 새로운 모 수석 분기 포인트의 추가 계산 계산 합니다.</li>
		<li>총 모 수석 길이 증가, 부상 후 추가 된 모든 새로운 모 수석의 누적 길이 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CNS 축 삭 재생의 정량화 참고: 병 변 사이트는 처음으로 지점 몇 군데 (그림 3B)에 변성을 보여줍니다, 그것은 재생 길이 속도의 분석에서 포함 될 것입니다.<ol>
<li>측정 재생 길이regrowing 축 삭의 길이입니다. 참고: 단일 병 변 사이트의 regrowing 축 삭 부상 전에 원래 축 삭 경로 원본으로 식별 됩니다.</li>
		<li>Normalized 재생 길이, 재생 길이 commissure 세그먼트-commissures ("Y" 그림 3A 와 3B) 사이의 경도 거리의 길이를 정규화를 계산 합니다. 참고:이 값 애벌레 크기 차이의 효과 대 한 올바른 수 있습니다.</li>
		<li>재생 속도, 재생 했다 lesioned, 특정 유전자 형의 재생 능력을 반영 하기 위해 모든 세그먼트 사이 세그먼트의 %를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

플라이를 설정 넘어, 여성 및 남성 사용의 수는 genotypes 및 특정 실험에 필요한 애벌레의 수에 따라 달라질 수 있습니다. WT 파리에 대 한 일반적인 크로스 10 여성 5 남성을 사용합니다. 컬렉션 창 애벌레 나이 요구의 정확도 따라 축소 수 있습니다. 예를 들어 2-h 컬렉션 기간 더 균질 인구의 애벌레를 얻을 것입니다. 이 경우에, 20 또는 더 처녀 여성을 사용 하 여 십자가를 설정 도움이 됩니다 충분 한 달걀을 얻을. 첫날부터 수확량은 일반적으로 부족 한, 그래서 수집 계란 접시 챔버를 설정 후 2 개 이상 일. 때 더 계란 접시 배양, 조직 0.5% 프로 산 솔루션 뿐만 아니라 접시에 습도 유지할 것 이다 하지만 금형의 성장을 방지는 물 대신에 60 mm 페 트리 접시에 담가 두는 것이 좋습니다.
애벌레 마 취 및 장착에 대 한 장치를 설정할 때 때문에 에테르 플라스틱을 통해 녹을 것 이다 유리 접시를 사용 하 여 있는지 확인 하십시오. 유리 접시는 15 cm ...

후 중앙 신경 시스템 (CNS)에 부상 환자, 영구 장애 발생할 수 있습니다 및 또한 신경 퇴행 성 질환1,2에에서 돌이킬 수 없는 신경학 상 적자에 역할을 다시 생성 하는 축 삭의 무 능력 ,3,,45. CNS 환경 뿐만 아니라 본질적인 성장 능력 뉴런의 축 삭 외상 후 재생성 수 있습니다 여부를 결정 합니다. 세포 외 요인 oligodendrocyte, astroglial, 및 fibroblastic 소스에서 신경 성장4,6,7,8, 하지만 이러한 분자의 제거를 방해 하 보였다 만 제한5돋 아 수 있습니다. 본질적인 재생 신호 재생 성공5,9 에 영향을 미칠 수 있습니다 잠재적인 치료 목표를 대표 하지만 이러한 프로세스는 분자 수준에서 아직도 분명 하지. 영양 요소 신호 또는10Pten 인산 가수분해 효소 등 생 브레이크의 제거 증가 axonal 재생 특정 상황에서 발생할 수 있습니다. 개별적으로 효과적인 것으로 발견 하는 다른 방법의 조합 또한만11,12,,1314날짜 제한 전체 복구를 제공 합니다. 따라서, 타겟된 치료에 대 한 추가 경로 식별 하는 절망적 인 필요가 있다. 뿐만 아니라 자라나는 축 삭의 개시 여부와 축 삭 다시 올바른 대상, 개혁 시 냅 스 특이성, 와이어 및 달성 하는 방법 기능 복구 중요 한 의문점이 있습니다.
요약에서 기계 지시 된 축 삭 재생의 현재 이해는 매우 단편적인 여전히. 문제의 일부는 축 삭의 기술적인 어려움 포유류 실시간 재생, 소모, 비용과 수행 대규모 유전 스크린에 도전 하는 방식. 초파리 melanogaster, 다른 한편으로, 복잡 한 생물 학적 질문의 연구에 대 한 매우 강력한 시스템을 입증 했다. 과일 파리 유전자를 정의 하 고 신호 통로 기 막히게 인간에서 보존 하는 수단이 되었으며 인간의 조건, 광대 한 분자 유전학 도구를 통해 신경 퇴행 성 질환 등의 연구에 대 한 성공적인 모델 되었습니다. 유전자 기능15조작에 사용할 수 있습니다. 특히, 초파리 신경 상해 및 자라나15,16에 관련 된 유전자의 발견에 대 한 이상적인 도구가 될 여겨진다. 성인 머리 또는 애벌레 복 부 신경 코드 (VNC) 찌르는 바늘, 애벌레 VNC 또는 집게, 애벌레 신경 레이저 axotomy, 후 각 수용 체 신경 제거, 뇌 explants 부상, 신경 호감을 포함 한 몇 가지 비행 신경 상해 모델 개발 되었습니다. 그리고 날개 퇴직금15,17,18,19,20,21,,2223여 주변 신경 병 변. 최근 작품 활용 초파리 부상 모델 excitingly, 세포와 유전자 경로 일부는 포유류24에에서 보존 될 표시 되었습니다 신경 부상에 대응 하는 신 경계에 의해 사용에 대 한 우리의 이해 고급 ,25. 다시,이 신경 선의 소설 메커니즘을 식별에 대 한이 모델 생물의 유틸리티를 강조 한다.
여기에 설명 된 2-광자 초파리 애벌레 감각 신경 상해 레이저 기반 모델이 이다. 두 광자 레이저 zebrafish에서 vivo에서 200326에 축 삭을 처음 사용 되었다. 같은 해, 첫 번째 레이저 dendriotomy 초파리 27펄스 질소 레이저 사용 하 여 수행 했습니다. 잠시 후, 여러 선 충 C. 실험실 축 삭 재생28의 모델을 확립 펨 레이저를 사용 합니다. 2007 년, 우 동료 비교 및 선 충 C. 레이저29의 다양 한 종류에 의해 유도 된에서 레이저 부상 간의 차이점을 보고. 2010 년에 축 삭 재생 레이저 axotomy 후 처음 초파리30에 표시 했다. 이 광범위 한 레이저 부상 문학에 건물, 우리는 개발 조직 이웃의 최소한의 섭 동으로 대상된 사이트에 상해의 정확한 유도 허용, 2-광자 레이저를 사용 하 여 비행 신경 상해 모델 상대적으로 깨끗 한 제공 단일 셀 해상도와 neuroregeneration의 기본 및 외부 속성을 공부 하는 시스템. 특히, 우리 모두는 말 초 신 경계 (PNS)에서 수지상 arborization (다) 감각 신경에 대 한 부상 메서드의 집합 설정한 및 CNS. 다 신경 그들의 모 수석 분기 복잡성에 의해 주로 구별 4 가지 종류로 분류 될 수 있다: 431종류 I. 우리의 출판된 일 다 신경 재생 phenotypic 및 분자 수준에서 포유류 부상 모델 유사한 보여준다: 다 신경 클래스 4와 클래스 특정 재생 속성을 표시 하지만 나 III 다 신경 재생을 전시 하지 클래스는 PNS; 클래스 4 다 신경 축 삭 주변에 견고 하 게 다시 생성 하지만 그들의 재생 잠재력은 따라서 닮은 포유류; 지 루트 신경 절 (DRG) 신경, CNS에서 극적으로 감소 Pten 통해 mTOR 활동 강화 삭제 또는 Akt overexpression 비행19CNS 축 삭 재생 향상. 이 부상 모델을 활용 하 여 우리 유전 스크린을 수행 되 고 있다 식별 RNA 가공 효소 Rtca 축 삭 재생을 위한 진화론 보존된 억제 요인으로 세포 스트레스 및 RNA 수정20 축 삭 상해를 연결 .
제시 패러다임에서 부상 애벌레 클래스 IV 또는 III 다 신경, ppk 권총-CD4-tdGFP 또는 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80에 의해 표시 된 각각의 레이저 axotomy/dendriotomy를 통해 유도 된다. 부상 (h AEL) 누워 계란 후 약 48-72 h에 3rd 탈피 애벌레를 2nd 에 수행 됩니다. PNS에 대 한 axotomy 병 변 세포 체, CNS axotomy ~ 20 µ m 직경, VNC에 commissure에의 지역 및 기본 수지상 브랜치 포인트에 dendriotomy에서 축 삭 ~ 20-50 µ m의 섹션 타겟팅 됩니다. 같은 신경은 부상 (AI) 완전 한 transection, 확인 후 8-24 h 고 48-72 h 재생을 평가 하기 위해 AI에서 몇 군데. 시간 경과 confocal 영상 통해 변성 및 부상 vivo에서 개별 axons/dendrites의 재생 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>디에틸 에테르, ACS 시약, 무수</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 27 Oil</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS), 20x 농축액, pH 7.5, 공급업체 # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>한천 가루, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>포도 주스</td><td>Welch' s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 95% (시약, 알코올 95%)</td><td>, VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경: 직사각형</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50mm X 22mm</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

주변에 neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 vivo에서 초파리 부상 모델

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

손상 된 신경의 재 성장을 용량 신 경계 외상 후 neuroregeneration 및 복구 기능을 제어합니다. 지난 몇 년간 다양 한 내부 및 외부 억제 요인 축 삭 재생의 제한에 관련 된 발견 되었습니다. 그러나,이 금지 신호를 단순히 제거 추가 규제의 존재를 나타내는 성공적인 재생에 대 한 충분 하지 않습니다. 초파리 melanogaster, 과일 파리, 척추 동물, 인간을 포함 한와 진화론 보존된 유전자와 신호 경로 공유 합니다. 파리의 강력한 유전자 도구 상자를 결합 하 여 두 광자 레이저 axotomy/dendriotomy와 함께, 우리는 설명 여기 초파리 감각 신경-체계적으로 소설에 대 한 심사를 위한 플랫폼으로 수지상 arborization (다) 신경 상해 모델 재생 레 귤 레이 터. 간단히,이 패러다임) dendrite(s) 또는 axon(s) 2 광자 레이저, c) 라이브 confocal 영상 포스트 상해 및 d) 데이터 분석을 사용 하 여 애벌레, b) 병 변 유도의 준비를 포함 한다. 우리의 모델에는 단일 레이블된 뉴런, 축 삭, 및 주변 및 중앙 신경 시스템에의 잘 정의 된 신경 하위의 dendrites의 높은 재현성 부상 수 있습니다.

다 신경 클래스 특이성 뿐 아니라 주변 및 중앙 신경 조직 사이 잠재적인 차동 재생을 보여줍니다. 이 축 삭 재생 (를 사용 하 여 클래스 IV PNS 부상)로 (클래스 IV CNS 상해와 클래스 III PNS 부상) 재생에 대 한 금지는 그에 필요한 새로운 요소에 대 한 화면에 독특한 기회를 제공 합니다.
PNS에서 축 삭 재생
예를 들어, 클래스 III과 클래스 4 다 신경 세포의 재생의 특성을 설명 합니다. 이러한 신경 양측 각 몸 세그먼트에 있습니다. 여러 신경 같은 유 충;에 손상 될 수 있습니다. 복 부 세그먼트 a 7-a 2의 오른쪽에 일반적으로 3-4 신경. 클래스 III 및 클래스 IV 다 신경 수 구상 될 UAS-CD4tdGFP, 19-...

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

이 초파리 유충 감각 뉴런 손상 모델의 전반적인 목표는 생체 내 라이브 이미징, 이광자 레이저 축삭 절개술/건수 절개술 및 강력한 파리 유전자 도구 상자를 신경 재생의 잠재적 촉진제 및 억제제를 스크리닝하기 위한 플랫폼에 결합하는 것입니다. 이 방법은 말초 및 중추 신경계 모두에서 신경 생성을 위한 새로운 내적 및 외적 조절자를 식별하는 것과 같은 신경 생성 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 재생을 위한 새로운 후보를 쉽고 빠르고 저렴한 방법으로 스크리닝할 수 있다는 것입니다.이 시스템은 신경 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 신경 퇴행성 질환 및 뉴런-아교세포 상호 작용과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 축삭돌기 재생과 수지상 재생을 모델링하기 위해 다양한 유형의 뉴런을 사용하는 다양한 실험 설정이 사용되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 유충 수집을 위해 다음과 같이 배양 병을 준비하십시오.초파리 배양병의 한쪽 벽에 칼날을 사용하여 1.5cm의 구멍을 뚫고 그 구멍을 면봉으로 채워 환기시킵니다. 그런 다음 포도 주스 한천 접시에 효모 페이스트를 약간 바르고 접시를 사용하여 병의 주요 구멍을 막습니다. 그런 병에 10 명의 처녀 암컷과 5 명의 수컷으로 구성된 십자가를 설정하고 섭씨 25 도에서 배양하면서 매일 접시를 바꿉니다.오염을 방지하기 위해 약한 프로피온산에 적신 젖은 티슈로 수집된 플레이트를 배양합니다. 배양된 플레이트에서 집게를 사용하여 필요한 단계에서 유충을 수확합니다. 선택한 유충을 효모 페이스트가 없는 새 포도 주스 한천 플레이트에 부드럽게 옮깁니다.그들이 기어 다니며 스스로를 씻은 후, 그들은 이미지화 될 수 있습니다. 각 이미징 세션을 시작하려면 이미징 레이저와 현미경을 켭니다. 부상의 경우 이광자 현미경을 사용하십시오.이미징 소프트웨어에서 최대 1950밀리와트의 출력으로 930나노미터에서 GFP를 보도록 레이저를 설정합니다. 라인 스캔 모드를 선택하고 핀홀을 끝까지 엽니다. 그런 다음 레이저 강도를 PNS 부상을 일으키려면 최대 전력의 약 20%로 높이거나 VNC 부상을 입히려면 최대 전력의 50%에서 100%로 높입니다.그런 다음 스캔할 512 정사각형 픽셀 프레임을 선택하고 가능한 가장 높은 스캔 속도를 사용합니다. 평균 1비트와 8비트의 비트 깊이를 사용합니다. 그런 다음 게인을

a-drosophila-vivo-injury-model-for-studying-neuroregeneration

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

이 비디오는 Drosophila melanogaster 유충에서 축삭의 이광자 레이저 절제와 부상을 유도하고 부상 부위를 이미지화하는 예제 프로토콜에 대해 설명합니다.

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observation Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila larvae (이광자 레이저 유도 신경 손상: 초파리 유충에서 축삭돌기 퇴행 및 재생을 관찰하는 방법)

이 영상은 고출력 레이저를 이용하여 초파리 유충에서 표적 신경 손상을 유도하는 방법을 보여줍니다. 유충을 현미경으로 관찰한 후 저전력 레이저로 형광 뉴런을 스캔한 다음 레이저 출력을 높여 국소 손상을 유도합니다. 부상은 증가된 형광과 부상 부위의 분화구에 의해 확인됩니다.

Drosophila 유충에서 고출력 레이저를 사용하여 표적 신경 손상 유도

이 비디오는 초파리 뇌에서 관통 외상성 뇌 손상의 유도를 보여줍니다. 새로 출현한 파리를 선택하고 마취한 후 형광이 장착된 실체 현미경 아래에 배치합니다. GFP 발현 버섯 몸체가 확인되고 Minutien 핀이 삽입되어 부상을 입힙니다. 파리는 추가 연구를 위해 회복할 수 있습니다.

성체 초파리 파리의 관통 외상성 뇌 손상 유도

중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석​​과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

초파리 애벌레는 그들의 반투명 표피와 강력한 유전학 라이브 영상을위한 매력적인 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 3 차 령 초파리 유충의 신경 세포 내에서 세포 프로세스의 실시간 이미징을위한 '유충 칩'이라는 단일 층 PDMS 장치를 활용하는 방법에 대해 설명합니다.

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

이 문서는 성인 Drosophila 에 관통 외상성 뇌 손상을 입히고 결과 신경 발생을 검사하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Drosophila 중앙 두뇌에 있는 성인 신경 발생을 자극하고 분석합니다

학습하세요 Drosophila 감각 신경 손상 모델을 활용한 생체 내 실시간 영상 및 투광자 레이저 절단 기법을 통한 신경재생 촉진 및 억제 인자 선별 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

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