Identifikation af virulens markører af Mycobacterium abscessus intracellulære replikering i fagocytter

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Her præsenterer vi to protokoller for at studere phagocyt -Mycobacterium abscessus interaktioner: screening af en transposon mutant bibliotek for bakteriel intracellulære mangel og bestemmelse af bakteriel intracellulære transkriptom fra RNA sekventering. Begge tilgange giver indsigt i genomisk fordele og transkriptom tilpasninger forbedre intracellulære bakterier fitness.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hvad adskiller Mycobacterium abscessus fra andre saprofytiske mykobakterier er evnen til at modstå fagocytose af menneskelige makrofager og evne til at formere sig inde i sådanne celler. Disse virulens træk render M. abscessus patogene, navnlig sårbare værter med underliggende strukturelle lungesygdom såsom cystisk fibrose, bronchiectasis eller tuberkulose. Hvordan patienter bliver smittet med M. abscessus uklart. I modsætning til mange mykobakterier, M. abscessus findes ikke i miljøet men måske bor inde amøber, miljømæssige fagocytter, der repræsenterer et potentielle reservoir for M. abscessus. Faktisk, M. abscessus er resistente over for amoebal fagocytose og intra-amøbe liv synes at øge M. abscessus virulens i en eksperimentel model af infektion. Dog er lidt kendt om M. abscessus virulens i sig selv. For at dechifrere de gener, der giver en fordel til M. abscessus intracellulære liv, blev en screening af en M. abscessus transposon mutant bibliotek udviklet. Parallelt, blev der udviklet en metode af RNA udvinding fra intracellulære mykobakterier efter fælles kultur med amøber. Denne metode blev valideret og tilladt sekvenseringen af hele M. abscessus transcriptomes inde i cellerne; give, for første gang, en global view M. abscessus tilpasning til intracellulære liv. Begge tilgange giver os et indblik i M. abscessus virulens faktorer, der aktiverer M. abscessus at kolonisere luftvejene hos mennesker.

Introduction

Slægten Mycobacterium omfatter arter lige fra harmløse saprofytiske organismer til store menneskelige patogener. Kendte patogene arter som Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum og Mycobacterium ulcerans tilhører undergruppe af langsomt voksende mykobakterier (sdb). I kontrast, undergruppe af hurtig-voksende mykobakterier (RGM) er kendetegnet ved deres evne til at danne synlige kolonier i mindre end 7 dage på agarsubstratet. RGM Gruppen består af mere end 180 arter, hovedsagelig ikke-patogene saprofytiske mykobakterier. Undersøgelser på RGM interaktioner med deres værter har hovedsageligt fokuseret på Mycobacterium smegmatis og vise, at disse mykobakterier elimineres hurtigt af den baktericid virkning af makrofager.

Mycobacterium abscessus er en af de sjældne RGM, der er patogene for mennesker og er ansvarlig for en lang række infektioner spænder fra hud og bløddele infektioner til pulmonal og formidlet infektioner. M. abscessus er sammen med Mycobacterium avium, anses at være de vigtigste mykobakterielle patogen i cystisk fibrose patienter1.

Forskellige undersøgelser udført på M. abscessus tyder på, at denne mycobacterium opfører sig som en intracellulær patogen, i stand til at overleve den baktericide svar af makrofager og fibroblaster i lungerne og huden, der ikke er normalt observeret i RGM 2 , 3 , 4. M. abscessus genomanalyse har identificeret stofskifteveje typisk findes i miljømæssige mikroorganismer i kontakt med jord, planter og akvatiske miljøer, hvor gratis amøber er ofte til stede5. De har også vist, at M. abscessus er udstyret med flere virulens gener ikke fundet i den saprofytiske og apatogene RGM, sandsynligvis erhvervet af horisontal genoverførslen i en niche gunstige for genetiske udveksling, der kan samles forskellige amøbe resistente bakterier.

Eksperimentelt, var en af de første slående resultater observation af intracellulære vækst af M. abscessus i makrofager samt M. tuberkulose6. M. abscessus modstår også forsuring af phagosome, apoptose og autophagy, tre væsentlige mekanismer af cellulære modstanden mod infektion2. Det har endda vist sig at M. abscessus er i stand til at etablere en øjeblikkelig kommunikation mellem phagosome og cytosol, en mere næringsrige miljø, der kunne favorisere bakteriel multiplikation2. Meget lidt er kendt om genomisk fordele, M. abscessus besidder eller har erhvervet for at muliggøre overlevelse i en intracellulær miljø. Amøbe coculture er en effektiv metode, der tillod isolationen af mange nye amøbe resistente bakterier som Mycobacterium massiliense7,8. En evne til at formere sig inden for amøber blev observeret i en model af aerosolization af M. abscessus i mus, som kan give en øget virulens M. abscessus4. En hypotese er, at M. abscessus havde udviklet genetiske træk opstod inden for dette miljø til at overleve i fagocyterende celler, som er forskellige fra andre ikke-patogene RGM. Disse opkøb kan favor muligheden for at sprede og dens virulens i den menneskelig vært.

Denne rapport beskriver værktøjer og metoder til at fremhæve de genomisk fordele til M. abscessus at overleve i miljøet, amøber. Til dette formål, screening af M. abscessus transposon mutanter først er beskrevet, på Acanthamoeba castellanii type stamme, som giver mulighed for identifikation af mutant's defekt for intracellulære vækst. En anden screening i makrofager er også rapporteret, at bekræfte, hvis fejlen fortsætter i den menneskelig vært. For det andet, for at forstå hvilke mekanismer er spændte i M. abscessus til at tilpasse sig livet i fagocyterende celler og øge dens virulens i den animalske vært, en metode, der er specielt tilpasset til M. abscessus blev udviklet, efter fælles kultur i nærværelse af amøber, der tillod ekstraktion af total RNA fra intra-amoebal bakterier. Som en konsekvens, blev en omfattende visning af M. abscessus gener, der er nødvendige for en intracellulær liv udviklet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bibliotek Screening

  1. Opførelsen af Tn mutant bibliotek
    1. Opnå en transposon bibliotek.
      Bemærk: For dette eksperiment, var et transposon mutant bibliotek opnået ej Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. Biblioteket blev bygget fra en glat kliniske stamme (43S) af den M. abscessus komplekse (M. abscessus subsp. massiliense) med en phagemid tilføres M. abscessus tillader tilfældige indsættelsen af en enkelt Tn i en TA dinucleotid (91,240 TA sekvenser i M. abscessus genom). For flere detaljer se reference af Rubin et al. 9 og Laencina et al. 10.
  2. Titrering af bibliotek og bevarelse af M. abscessusTn mutanter i plader
    Bemærk: Det tager en uge.
    1. Tø bibliotek på isen. Bestemme den bakterielle koncentration ved at udføre serielle fortyndinger i 1 mL vand (10-1 til 10-15). Plade en dråbe hver fortynding på en petriskål, som indeholder 7H 11 agarsubstratet med 250 mg/mL kanamycin. Inkuber plader ved 37 ° C i 3-4 dage.
      Bemærk: Her, en titrering af 1011 bakterier/mL blev inddrevet.
    2. Efter bestemmelse af koncentrationen af biblioteket, fortyndes bibliotek til en endelig koncentration på 3.000 bakterier/mL i 10 mL 25% glycerol-vand. Alikvot bibliotek i 10 cryotubes med 1 mL af biblioteket i hver tube. Gemme alikvoter ved-80 ° C.
    3. Når du er klar til brug, tø en alikvot af det fortyndede bibliotek på is og tilsæt 100 µL af biblioteket til 10 firkantede Mueller-Hinton (MH) agar plader (størrelse 12 cm) for at genoprette 200 til 300 enkelte kolonier efter 3-4 dages inkubation ved 37 ° C.
    4. Med sterile tandstikkere, overføre de enkelte kolonier (omkring 6.000 kolonier i 60 x 96-brønd plader) i 96-brønd plader fyldt med 200 µL af 7H 9 medium suppleret med 0,2% glycerol, 1% glukose, 250 mg/mL af kanamycin. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 dage uden rystelser.
    5. Overføre 100 µL af kultur (trin 1.2.4) til en 96-brønd plade der indeholder 100 µL af 7H 9 medium med 40% glycerol. Gemme den bestilte bibliotek ved-80 ° C.
    6. Gentag trin 1.2.3. til 1.2.5. med resten af biblioteket indtil 10.000 enkelte kloner er inddrevet (omkring 100 x 96-brønd plade og 30 MH plader).
  3. Forberedelse af amøber
    1. Kultur amøbe Acanthamoeba castellanii (AC) i 75 cm2 vævskultur flasker ved stuetemperatur (RT) i 30 mL af PYG medium (tabel 1) for forstærkning af cellen linje11.
      Bemærk: Modne trofozoitter fra store klæbende celler med talrige fordøjelsessystemet vacuoles er klart synlige på et mikroskop. Cellen fordobling tid skønnes at være 25 h. celler blev forstærket hver 3 dage ved at sprede en tredjedel af den oprindelige kultur i 75 cm2 vævskultur flasker.
    2. Fjerne PYG medium med 25 mL pipette. Cellerne vaskes med 10 mL af AC buffer (tabel 2), som ikke indeholder nogen kulstof eller nitrogen kilder12. Gentag vask to gange mere.
      Bemærk: AC buffer, som indeholder ingen kulstof eller nitrogen kilder undgår ekstracellulære væksten af mykobakterier. Dette minimum medium fører til encystment af amøber. For at begrænse dette, varme-inaktiverede E. coli blev tilføjet som et substrat (trin 1.4) til amøber og meget korte kultur gange blev forfremmet (48 h for mutant screening) og 4 h eller 16 h kultur for RNAseq eksperimenter. Alternativt kan du bruge dette medie men beriget med PYG medium (normalt 10%).
    3. Frigøre amøbe fra bunden af kolben med en enkelt livlig ryste af vævskultur kolben.
    4. Tælle celler med en hemocytometer til at justere den celle koncentration på 5 x 105 amøber/mL fortyndet i AC buffer.
  4. Udarbejdelse af varme-inaktiverede Escherichia coli bakterier at fodre amøbe efter infektion
    1. Vokse E. coli kliniske isoleres stamme fra en glycerol bestand i 100 mL af Luria bouillon (LB) natten over ved 37 ° C.
    2. Høste bakterierne ved centrifugering ved 1.835 x g i 10 min. i 50 mL rør. Supernatanten. Resuspenderes med 10 mL 10% glycerol-vand. Gentag vask to gange mere.
    3. Resuspenderes med 5 mL 10% glycerol-vand. Alikvot 0,5 mL i 1,5 mL rør. Bestemme mængden af bakterier/mL ved at udføre serielle fortyndinger og tilføje fortyndinger på LB agar plader. Gemme alikvoter ved-80 ° C.
    4. Dagen før amøbe infektion, tø en alikvot på is og gå videre til varme-drab ved at inkubere røret på 70 ° C i 60 min.
      Bemærk: Tjek inaktivering ved plettering 100 µL af inaktiverede bakterier på LB agar plader natten over ved 37 ° C. Ingen kolonier bør ses efter en nat af kultur.
    5. Fortynd de varme-dræbte bakterier til en koncentration af 107 bakterier i 50 µL af AC buffer og gemme de fortyndede bakterier ved 4 ° C for ikke mere end en uge.
  5. Fælles kultur amøber -M. abscessus Tn mutant: første skærm
    Bemærk: Det tager 3-4 måneder for screening af 6.000 mutanter.
    1. Sprede 5 x 104 amøber/godt til en 96-brønd plade i 100 µL af AC buffer. Inkuber i 1 time ved 32 ° C uden rystelser. Give den flydende amøbe trophozoïtes tid til at overholde brønde.
      1. Mens inkubere, tø bakterier på køl i 1 time.
    2. Tilsæt 5 µL af de optøede bakterier kulturer med en elektronisk multikanalpipette. Inficere for 1,5 h. skærmen omkring 6.000 individualiseret kloner fra 96-brønd plade Tn mutanter lager.
      Bemærk: MOI er ukendt på dette trin i protokollen; men alle 96-brønd plader der indeholder Tn mutanter blev dyrket på nøjagtig samme måde. Denne første skærmbillede sigter til hurtigt at identificere intracellulære mangelfuld mutanter, uden at overveje variationerne i inokulum tæthed.
    3. Efter 1,5 h af infektion, vend 96-brønd pladen på sterile gauzes placeret i en steriliseret metal bakke at fjerne AC medium under et stinkskab. Refill med 200 µL af AC medium. Gentag denne vask to gange mere.
    4. Tilføje 200 µL af frisk medium suppleret med 100 µg/mL amikacin at fjerne resterende ekstracellulære mykobakterier.
    5. Der inkuberes i 2 timer før man går videre med 3 ekstra vask (som beskrevet i trin 1.5.3). Efter vask, opretholde kulturer med 50 µg/mL amikacin i 200 µL af AC buffer.
    6. Tilføj 5 x 107 varme-inaktiverede Escherichia coli bakterier (fra trin 1.4) i slutningen af infektionen og hver 24 h at forhindre encystment af amøber.
    7. Efter 48 h af fælles kultur, lyse celler ved at føje 10 µL af 10% SDS (sodium dodecyl sulfat) til hver brønd og Inkuber i 30 min. ved 32 ° C. Fortsætte med seriel fortynding og tilføje på Columbia agar plader der indeholder 5% får blod (COS plader) for at vurdere antallet af intracellulære mykobakterier. Forsegle pladen med parafilm og inkuberes ved 37 ° C.
    8. Når kolonier vises på agar plader efter 3-4 dage, fotografere nummerpladen og identificere mutanter nedsat for intracellulære vækst ved at observere indskud med det laveste antal bakteriel kolonier.
      Bemærk: Har ikke noget om den form, højde eller tæthed af kolonien (fig. 1A). 136/6000 mutanter blev identificeret.
  6. Fælles kultur amøber -M. abscessusTn mutant: andet skærmbillede af mutanter identificeret under det første skærmbillede
    Bemærk: Det tager 2 uger. En anden skærm skal udføres med de 136 svækkede mutanter fremstillet efter det første skærmbillede til at kvantificere netop antallet bakterier podes og antallet af intracellulære overlevelse bakterier 2 dage efter infektionen.
    1. Vokset 1 koloni af hver påvirket mutant i 50 mL fyldt rør med 20 mL af 7H 9 medium suppleret med 0,2% glycerol, 1% glukose og 250 mg/mL af kanamycin. Tillade bakterier at nå den eksponentielle fase (0,6 < OD < 0,8).
    2. Vaske kulturen ved centrifugering (1.835 x g i 10 min.) i AC medium. Supernatanten. Gentag dette vaskes to gange mere med 20 mL af 7H, 9 medium suppleret med 0,2% glycerol, 1% glukose og 250 mg/mL af kanamycin.
    3. Resuspend bakterier i 5 mL af AC buffer.
    4. Bestemme kolonidannende enhed (CFU) koncentration af mutanter. I 24-godt plader, der tilsættes 1 mL vand til de to første rækker. Tilføj 100 µL af den bakterielle suspension til den første brønd. Med en mikropipette mix tre gange. Derefter Aspirér 100 µL og indbetaling til anden godt.
    5. Med et nyt tip, skal du gentage trin 1.6.4 fra den anden godt til den tredie m.v. indtil den tolvte godt.
    6. Opsug 30 µL af 10-12 fortynding og føje den til en COS plade. Gentag for de andre fortyndinger.
    7. Wrap COS plade med parafilm og Inkuber i 3-4 dage ved 37 ° C. Bestemme koncentrationen ved optælling af kolonierne.
    8. Udføre Co kultur assays, som beskrevet ovenfor i tre eksemplarer i en 24-godt plade med 5 x 104 amøbe pr. brønd i 1 mL af AC Co næringssubstratet. Podes med en mangfoldighed af infektion (MOI) af 10.
    9. Efter 48 h af fælles kultur, fortsætte med celle lysis som beskrevet i trin 1.5.7. Udføre serielle fortyndinger i vand (10-1 til 10-6) og tilføje 30 µL til COS plader. Inkuber pladerne i 4 dage ved 37 ° C, før du fortsætter med CFU optælling.
      Bemærk: Efter denne anden skærm, 60 af 136 mutanter blev bevaret.
    10. Gemme mutanter påvirket for at overleve inde i cellerne. Tilføje en koloni til et cryotube, der indeholder LB medium med glycerol (20% endelige) eller i en cryotube, der indeholder kommercielle løsning og microbeads at favorisere en langsigtet bevarelse og lette fremtidige podning og derefter opbevares ved-80 ° C.
    11. Vurdere den in vitro- mutant vækst ved at måle det optisk densitet (OD) på 600 nm hver 2 dage.
      1. Vokse 1 koloni af hver påvirket mutant i 50 mL rør fyldt med 20 mL af 7H 9 medium suppleret med 0,2% glycerol, 1% glukose og 250 mg/mL af kanamycin. Tillade bakterier at nå den eksponentielle fase (0,6 < OD < 0,8) før justering OD til 0,01 for at begynde kinetik.
      2. Udelukke mutanter med en in vitro- vækst defekt sammenlignet med WT stamme fra sæt af intracellulære mangelfuld mutanter.
  7. Fælles kultur af makrofager -M. abscessus Tn mutant defekt for en intra-amøbe liv
    Bemærk: Det tager 1 måned.
    1. Sprede 5 x 104 J774.2 murine makrofager pr. brønd af en 24-godt plade i 1 mL af rigt medie, DMEM suppleret med 10% af føtal kalv Serum (FCS). Inkuber plader i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 til at tillade makrofag vedhæftning. Give 3 replikater.
    2. Udføre infektionen. Podes Tn mutanter, med et MOI 10, fortyndet i DMEM med 10% FCS i et volumen på 100 µL.
    3. Efter 3 h af infektion, skal du udføre tre vask med 1 mL af DMEM (en vakuumpumpe kan bruges). Derefter behandle med 250 µg/mL amikacin (i DMEM med 10% FCS) i 1 time at fjerne resterende ekstracellulære mykobakterier.
      1. Efter 3 ekstra vasker med 1 mL af DMEM, opretholde kulturer i 250 µg/mL amikacin (i DMEM med 10% FCS) til en endelige rumfang på 1 mL, forhindre ekstracellulære mykobakterielle multiplikation.
    4. 72 h efter fælles kultur, fjerne medium og lyse af makrofager ved tilsætning af 1 mL koldt vand. Inkuber i 30 min. ved 4 ° C.
    5. Udføre CFU assays på COS plader til at vurdere antallet af intracellulære bakterier.
      1. I en 24-godt plade, der tilsættes 1 mL vand til de to første rækker. Tilsæt 100 µL af cellen Co lysate til den første brønd. Med en mikropipette mix tre gange. Opsug 100 µL og deponere dem i andet godt.
      2. Gentag fortynding fra det andet godt til den tredie m.v. indtil den tolvte godt med en ny spids. Derefter Aspirér 30 µL af 10-12 fortynding og føje den til en COS plade.
      3. Gentag for de andre fortyndinger. Wrap COS plade med parafilm og vente 3-4 dage til at observere og kolonierne.
  8. Identifikation og sekventering af stedet for indsættelse af Tn i M. abscessus mutanter
    Bemærk: Det tager 1,5 måneder til 60 mutanter.
    1. Genomisk udvinding af de identificerede M. abscessus mutanter
      1. Vokse mutanter i en 50 mL tube med 20 mL af 7H 9 medium suppleret med 0,2% glycerol, 1% glukose og kanamycin 250 mg/mL til eksponentiel fase (OD600= 0,8).
      2. Høste 10 mL af kulturer (2,396 x g, 5 min). Supernatanten. Suspendere bakterier i 500 µL af løsning jeg (25% saccharose, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL Lysozym, 40 mM thiourinstof). Opløsningen overføres til 2 mL rør med skruelåg, og der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
      3. Tilsættes 500 µL opløsning II (25% saccharose, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Efter pipettering op og ned 5 - 10 gange, tilføje zirconium perler indtil et volumen på 500 µL i røret.
      4. Fortsætte med celle lysis med en homogeniseringsapparat (3 x 6.000 rpm, 45 s) med en 1 min inkubation på isen mellem hver runde.
      5. Tilsæt 5 µL af 20 mg/mL Proteinase K (100 µg/mL endelig) og inkuberes prøver overnatning på 55 ° C.
      6. Der tilsættes 1 mL af kolde fenol/chloroform/isoamyl alkohol (25:24:1) under et stinkskab. Bland prøverne af vortexing før man går videre med centrifugering ved RT og 16.500 x g i 30 min.
      7. Genskab den vandige fase efter centrifugering, og tilføje et lige saa stort volumen af kolde fenol/chloroform/isoamyl alkoholopløsning under en hætte. Der centrifugeres prøver på 16.500 x g for 30 min til at inddrive den vandige fase igen.
      8. Tilføje 0,7 volumen af RT isopropanol til den gendannede vandfasen under et stinkskab. Invertere langsomt rør for at tillade DNA nedbør og Inkuber 5 min på RT. Derefter centrifugeres i 10 min. ved 16.500 x g og RT.
      9. Fjern supernatanten og vaske pellet med 500 µL af 70% ethanol under en hætte. Der centrifugeres rør til 10 min på 16.500 x g på RT før du fjerner ethanolen. Der inkuberes i 10 min at tillade resterende alkohol fordampning.
      10. Endelig, suspendere DNA pellet i 100 µL DNase/RNase gratis vand. Bestemme DNA udbytte og renhed DNA med et spektrofotometer.
      11. Fjerne 1 µg genomisk DNA og fordøje med 10 U i ClaI for en nat for sub kloning Tn indsættelsesstedet. Brug producentens protokol.
        Bemærk: Clajeg enzym er en af de mest højt repræsenteret restriktionsenzymer i M. abscessus genom (2,173 begrænsning websteder). En Clajeg begrænsning websted findes også i Tn sekvens opstrøms af kanamycin modstand kassette af Tn mutant. Således Clajeg-medieret subcloning gør det for at identificere Tn indsættelsesstedet.
    2. Sub kloning i et plasmid genomisk DNA indeholdende Tn
      Bemærk: Før fortsætter med Tn-subcloning i den 2,686 bp pUC19 ampicillin-resistente plasmid, tilføje en Clajeg begrænsning websted på webstedet for flere kloning af plasmidet. Rækkefølgen af pUC19 plasmid kan findes på dette link https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Følg fabrikantens 's protokol at fordøje pUC19 plasmid med EcoRjeg og HindIII, som frigiver et fragment af 51 bp og et fragment af 2635 bp. rense den dobbelt fordøjet vektor med en kommerciel PCR rensning kit til at eliminere 51 bp udgivet fragment.
      2. Mix 1 µL (koncentration 25 pmol/µL) af to supplerende oligonukleotider (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' og 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') af 28 bp hver indeholder Clajeg begrænsning websted og i enderne HindIII og EcoR Jeg begrænsning websteder. Varme ved 100 ° C i 10 min og derefter afkøles for at binde dem.
      3. Fordøje de parrede primere af EcoRjeg og HindIII efter producentens protokol.
      4. Ligate 150 ng af EcoRjeg /HindIII-begrænset pUC19 plasmid med forskellige koncentration af parret primere (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2,5 pmol/µL) for 1 h i RT med 1 U af T4 DNA ligase i en endelige mængden af 20 µL. Check kloning af en anden Enzymatisk nedbrydning.
      5. Fordøje den modificerede plasmid med Clajeg i 2 timer ved 37 ° C.
      6. Ligate 50 ng af Clajeg-begrænset pUC19plasmid og 50 ng af genomisk DNA fordøjet af Clajeg for 1 h i RT med 1 U af T4 DNA ligase i 10 µL.
      7. Fortsæt til E. coli electrocompetent bakterier transformation med 5-10 µL af ligatur (2500 V, 200 ohm, 25 µF). Vælg kloner på LB agar plader suppleret med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL ampicillin at vælge bakterier forsynet med plasmider med dele af Tn sekvenser.
      8. Vokse resistente kloner natten over i LB flydende medium med passende antibiotika markeringen (50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL ampicillin).
      9. Uddrag plasmid DNA. Kontrollere tilstedeværelsen af indsatsen ved enzymatisk begrænsning og sekvens 3' slutningen af Tn at identificere forstyrret genet med en oligonukleotid (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') svarer til de sidste 17 basepar af Tn kanamycin modstand kassette.
      10. Juster sekvens mod M. abscessus gå 06 stamme ved at udføre et nukleotid blast (BLAST-N).

2. RNA udvinding af intracellulære mykobakterier for Rnaseq analyse

Bemærk: Det tager 4 måneder for eksperimenter og 4 måneder for RNAseq analyse.

  1. Fælles kultur af amøber-M. abscessus i partier
    Bemærk: I de følgende eksperiment udføres Co kultur i 50 mL rør med agitation at favorisere bakterier til celle kontakter.
    1. Vokse M. abscessus i 7 H 9 medium suppleret med 0,2% glycerol, 1% glukose til midten af eksponentielle fase på 120 rpm.
    2. Vaske bakterierne to gange med 10 mL af AC buffer.
    3. Anslå bakterier koncentrationen ved at måle OD600nm (1 OD600= 4 x 108 mykobakterier). Tilføje 8,5 x 108 mykobakterier til 8,5 x 106 amøber i 10 mL af AC medium.
    4. Inkuber i 1 time ved 30 ° C med blid agitation (omkring 80 rpm).
    5. Høste cellerne ved centrifugering ved 253 x g i 12 min. Fjern supernatanten og suspendere celler i 10 mL af AC buffer. Gentag denne vask to gange mere.
    6. Resuspend celler i 10 mL af AC buffer indeholdende 50 µg/mL amikacin for at fjerne ekstracellulære bakterier og Inkuber i 4 timer ved 30 ° C med blid agitation (80 rpm). Cellerne vaskes to gange igen.
  2. Ekstraktion af total RNA fra intracellulære M. abscessus
    Bemærk: Udføre trin 2.2.1–2.2.3 under stinkskab på grund af brugen af giftige reagenser.
    1. Efter de sidste vask, resuspend de inficerede amøber i 4 mL af kold løsning III (tabel 3) med dyrlægeordination 280 µL af β-mercaptoethanol at forstyrre amøber. Dette er guanidinium kaliumthiocyanat (GTC) trin. Opretholde suspensionen i isbad i 10 min. Centrifuge cellen lysate for 30 min på 2,396 x g og 4 ° C for at pille de frigivne intracellulære bakterier.
    2. Fjern supernatanten og suspendere den bakterielle pellet i 1 mL kold løsning III. Høste bakterier ved 2396 x g i 30 min. ved 4 ° C. Resuspenderes i 1 mL ekstraktionsbuffer og overførsel til en 2 mL skrue rør indeholdende zirconium perler (indtil 500 µL graduering af røret). Gemme rør i mindst 24 timer ved-80 ° C.
      Bemærk: Opbevaring i lysis reagens tillader inaktivering af RNases og celle opløsning.
    3. Når du er klar til brug, tø prøver på is og lyse dem med en homogeniseringsapparat ved at udføre to runder på 6.000 rpm for 25 s, efterfulgt af en runde på 6.000 rpm for 20 s med en 1 min inkubation på isen mellem hver runde.
    4. For at prøven afkøles, Ruger dem i isbad i 10 min. Derefter tilføje 200 µL chloroform fortyndet i isoamyl alkohol. Efter vortexing centrifugeres prøver for 1 min, i 15 min. ved 16.500 x g og 4 ° C.
    5. Tilføje 0,8 mL koldt isopropanol til den vandige fase, og der inkuberes prøver i 2-3 timer ved 20 ° C. Centrifugeres prøver for 35 min på 16.500 x g og 4 ° C. Supernatanten.
    6. Vaske RNA pellet ved at tilføje 500 µL koldt 70% ethanol (Bland ikke).
    7. Der centrifugeres prøver på 16.500 x g i 10 min. til at fjerne ethanolen. Opsug løsningen og tørt i en centrifugal koncentrator.
    8. Når tørret, resuspend pellets i 100 µL DNase/RNase gratis vand.
      Bemærk: Prøverne skal behandles to gange med DNases til at fjerne DNA forurenende stoffer ifølge fabrikantens anbefalinger.
    9. Vurdere RNA integritet på en agarosegel og bekræfte ved at måle RNA integritet nummer (RIN) og ribosomale forholdet med en chip-baserede kapillær elektroforese metode.
      Bemærk: RIN tager hele elektroforese sporingen hensyn. RIN software algoritme giver mulighed for klassificering af total RNA, baseret på et nummersystem fra 1 til 10, med 1 er den mest nedbrudte profil og 10 er den mest intakte. For at fortsætte med cDNA bibliotek forberedelse, skal Aani over 8 og de ribosomale forholdet [28S/18S] så højt som muligt, den ideelle værdi at være 2, afhængigt af skadegøreren og dens særpræg.
    10. Gemme RNA prøver på-80 ° C indtil forberedelse af cDNA bibliotek til sekvensering.
  3. Forberedelse af cDNA bibliotek
    1. For at fortsætte med biblioteket forberedelse, bruge en kommercielt tilgængelig cDNA syntese kit (Table of Materials) ved hjælp af producentens protokol.
    2. Kontrollere biblioteket for koncentrationen og kvaliteten på en DNA-Chip.
      Bemærk: Mere præcis og nøjagtig kvantificering kan udføres med følsomme fluorescerende-baserede kvantitering assays.
  4. Biblioteket sekventering
    1. Normalisere prøver til 2 nM og gå videre til multiplexing ifølge flow celle organisation.
    2. Denaturere prøver i en koncentration på 1 nM med 0,1 N NaOH i 5 min på RT.
    3. Fortynd prøver 10 kl. Indlæse hver prøve på cellen flow kl 10.
    4. Fortsætte med sekventering med en høj overførselshastighed sekventering system, der giver mulighed for omfattende genomforskning. Her flugt var en SRM run (SR: enkelt Læs, PE: parret ende læser, M: multipleksede prøver) 51 cykler med 7 indeks baser læse.
    5. Vurdere kvaliteten af sekventering med den eksterne FastQC program13.
    6. Efter trimning af adapter sekvenser, fortsætte med Læs alignments mod en reference genom. Juster mod den eukaryote celle genom at vurdere prøve forurening og om nødvendigt fortsætte med trimning af ikke-bakterielle læser.
  5. Statistisk analyse
    1. Bruge flere softwareprogrammer til rådighed online til at definere sæt af varierende udtrykte gener: R software, Bioconductor pakker herunder DESeq2 og den PF2tools pakke (version 1.2.12) udviklet på platformen "transkriptom et Epigénome" (Pasteur Institut, Paris).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

M. abscessus har evnen til at modstå og undslippe de baktericide svar af makrofager og miljømæssige protozoer såsom amøber. M. abscessus udtrykker virulens faktorer når der dyrkes i kontakt med amøber, hvilket gør det mere virulente i mus4. Det første mål med disse metoder var at identificere de gener, der er til stede i M. abscessus tillader dens overlevelse og formering i amøber.

For dette, en mutant bibliotek af M. abscessus subsp. massiliense, fremstillet af Tn levering9, blev screenet efter fælles kultur i overværelse af amøber, til at identificere mutanter med svækkede vækst i det intracellulære miljø (figur 1). Funktionsmåden for de samme mutanter var også evalueret efter fælles kultur med makrofager at analysere, om denne vækst dæmpning blev bevaret i mus makrofager.

Denne blinde transposon bibliotek screening tilgang, bekræftede en defekt replikering fænotype for 47 af 6.000 mutanter, der havde en overlevelse på 50% eller mindre i amøber og/eller makrofager, i forhold til kontrollerer10. For at udelukke blev mutanter med svækkede intracellulære overlevelse, der kan skyldes en iboende vækst defekt af mycobacterium, væksten kurver i alle de valgte Tn mutanter evalueret i en in vitro- flydende beriget næringssubstratet (1% glukose - 7 H 9). In vitro vækst af alle mutanter blev overvåget af efter OD600 af kulturer hver 2 dage. De forskellige mutanter, der vises en in vitro- vækst defekt i forhold til den tilsvarende vildtype stamme blev udelukket fra undersøgelsen.

Det var meget vigtigt for denne blinde test at gengives hver dag bruger nøjagtig den samme protokol. Begrænsning af denne teknik var på den første visuelle screening, fotografier er taget af hver CFU at give et præcist billede for reference. I denne gruppe af mutanter, blev 12 M. abscessus mutanter (inkluderet dubletter) identificeret som transposon blev indsat i gener tilhører ESX-4 locus af typen VII sekretion system, der understreger dens betydning for den intracellulære vækst af M. abscessus10.

Indtil nu baseret analyse af M. abscessus virulens hovedsagelig på en sammenlignende analyse af genomet af M. abscessus med der af M. chelonae, en mycobacterium tilhører den samme gruppe, men forårsager kun infektioner af huden hos mennesker. Formålet var at få et katalog af gener udtrykt under forskellige co dyrkningsbetingelserne for bedre at forstå tilpasning og potentielt virulens mekanismer involveret i fælles kultur i overværelse af miljømæssige professional fagocytter. Analyse af denne forøget virulence gennem en omfattende tilgang af samlede sekventering messenger RNA'er af M. abscessus, blev udført for at afsløre RNA'er induceret eller undertrykt under amøbe Co kulturer i forhold til RNA'er transskriberet under in vitro- betingelser. Det differentierede udtryk af disse RNA'er kan overdrage til M. abscessus en forbedret "virulens" forklarer kolonisering af de øvre luftveje hos mennesker.

Disse fælles kulturer blev igen foretaget på et minimum medium (ingen kilde af kulstof eller nitrogen) som beskrevet ovenfor, for at forhindre M. abscessus ekstracellulære vækst og at være repræsentant for de miljøforhold, som disse står over for mykobakterier og under pres fra udvælgelsen af et antibiotikum hele varigheden af fælles kultur at vælge intracellulære mykobakterier.

Derfor, en teknik blev udviklet for at isolere RNA fra intracellulære mykobakterier. Den største vanskelighed med denne udvinding af mykobakterielle RNA var at undgå forurening med amoebal RNA (Eukaryote type). For at undgå dette, blev lysering af amoeba udført på forskellige tidspunkter post Co kultur, ved hjælp af guanidinium kaliumthiocyanat (GTC); da intracellulære mykobakterier er resistente. Efter dette trin, var en mekanisk udsugning af mykobakterielle RNA'er udføres ved hjælp af en celle-homogeniseringsapparat i nærværelse af zirconium perler. Denne teknik tilladt os at opnå mykobakterielle RNA af god kvalitet, med en RIN antallet af høj kvalitet, afgørende for at forbedre evnen til at foretage en komplet analyse af transkriptom M. abscessus ved hjælp af messenger RNA-sekventering (mRNA) teknik (figur 2). Dette er aldrig blevet gjort før og gav os en grundlæggende vision af genet familier induceret eller undertrykt, ved at gruppere dem ifølge deres rolle: M. abscessus svar til et miljø, der er begrænset i sin kilde til næringsstoffer og mineraler, at et hypoksiske eller Sure miljø og modstand af M. abscessus mod oxidative og nitrosative stress, og endelig udtryk af virulens i M. abscessus i miljømæssige amøbe.

Figure 1
Figur 1 : A. første visuelle skærmen af M. abscessus Tn mutanter i amøbe. (A) store skærm af Tn mutanter på amøber udføres i 96-brønd plader med en tilfældig mangfoldighed af infektion til hurtigt at identificere svækkede mutanter. (B) identifikation af de svækkede Tn mutanter forstyrret gener. TN mutanter genomisk DNA er fragmenteret med Clajeg at klone Tn indsættelsesstedet. M. abscessus genomer havne 2500 Clajeg begrænsning sites som favoriserer opnåelse af korte DNA fragmenter men sænket sandsynligheden for at klone Tn indsættelsesstedet (1/2500). Kloner er markeret med kanamycin, modstand bærer af transposon. Forstyrret genet er identificeret af sekventering med en primer inde Tn kanamycin modstand kassette (sort pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Analyse af mykobakterielle RNA udvinding. (A) RNA udvinding af intracellulære M. abscessus under amøber -M. abscessus Co kultur. Amøber Co kulturer med M. abscessus udføres på en stor mangfoldighed af infektion (dvs. 100), i store mængder, med blid agitation, at favorisere celle til bakterier kontakter. Efter Co kulturer, er celler høstet og mængden med en kombination af GTC og ß-mercaptoethanol. Celle lysate-holdige bakterier er behandlet med GTC igen at svække bakterier cellevæg for at lette bakterier mekaniker lysis før RNA udvinding. (B) RNA kvalitet og integritet vurdering med en bioanalyzer. En elektroforese-gel er givet som rRNA er observeret (23S, 16S og 5S). RIN skal være over 8 fortsætte med biblioteket forberedelse til sekvensering og rRNA nøgletal (23S/16S) så højt som muligt afhængigt af organisme, den ideelle værdi er 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Funktionsmåden for M. abscessus er meget mere ligner funktionen af patogene SGM som M. tuberkulose end nogen andre mykobakterier tilhører RGM2. Det centrale element i SGM patogenicitet er deres evne til at overleve eller endog formere sig i antigen-præsenterer celler, såsom makrofager og dendritiske celler.

M. abscessus har erhvervet visse genomisk fordele, som det fremgår af den samlede sekvens af dens genom14 for at overleve i en eukaryote fagocyterende celler. Genomet af M. abscessus har vist sig at være hurtigt udviklende og meget plastik, med mange nylig introduceret indsættelse sekvenser som prophages og nye gener15. Selv om der er færre data på virulens faktorer i M. abscessus sammenlignet med M. tuberkulose, M. abscessus ser ud til at være i stand til at udvikle sig hurtigt og aktivt hen imod øget virulens. Indtil nu, var analyse af M. abscessus virulens hovedsagelig baseret på en sammenlignende analyse af genomet af M. abscessus med der af M. chelonae, en mycobacterium tilhører den samme gruppe, men forårsager infektioner begrænset til huden hos mennesker. Nogle gener har ikke er til stede i M. chelonae men præsentere i M. abscessus, såsom fosfolipase C, delvist forklares M. abscessus modstand efter fagocytose af miljømæssige amøber4.

Udviklingen af en amøbe Co kultur teknik suppleret med miljøprøver har demonstreret utvetydigt amøbe-mykobakterielle interaktioner16,17. Således mykobakterier kunne isoleres fra lysates Co kulturperler i overværelse af amøber i en vand behandling plante18, og M. massiliense var isoleret fra opspyt af en patient efter fælles kultur med amøber, mens kultur alene ikke gjorde tillade dyrkning af denne mykobakterier8. Amøber er i stigende grad betragtes som en inkubator for mykobakterier4 og Acanthamoebasp. som en naturlig miljømæssig vært for mange ikke-tuberkuløse mykobakterier. Amøbe plus mykobakterier Co kultur systemer er i stigende grad foreslås som enkle og hurtige modeller til at karakterisere faktorer involveret i den intracellulære væksten af mykobakterier19,20,21, 22,23,24.

I miljøet, er samspillet mellem mykobakterier og amøber dårligt dokumenteret. Den første artikel, der beskriver beviser for en sammenslutning mellem mykobakterier og amøber i feltet kom ud i 2014, og denne undersøgelse fokuserer på en analyse af en drikkevand netværk25.

Til vores viden er dette den første screening beskrevet under en fælles kultur med amøber. Denne undersøgelse tillod os at demonstrere den rolle af miljømæssige fagocytter i erhvervelse af virulens i en opportunistisk patogen, der påvirker mennesker. For at fremhæve de gener, der er nødvendige for den intracellulære overlevelse af M. abscessus, blev en skærm af en mutant bibliotek af gennemførelsen udført i en underart af M. abscessus komplekse og i en klinisk stamme. Denne mutant bibliotek blev screenet med amøber, denne sidste at have påvist som en "uddannelse jorden" for at øge M. abscessus virulens i mus4, ligner observeret med M. avium26. Det store resultat var opdagelsen for første gang i mykobakterier af den vigtige rolle af ESX-4 locus kodning en type VII sekretion system, og stamfader til ESX-1 locus væsentlig for virulens og intracellulære overlevelse af M. tuberkulose Mycobacterium microti og M. marinum27,28,29,30,31.

Det andet mål var at opnå et katalog af gener udtrykt under forskellige co dyrkningsbetingelserne for bedre at forstå tilpasning og potentielle virulens mekanismer involveret i fælles kultur i overværelse af miljømæssige professionelle fagocytter. Analyse af denne forøget virulence gennem en omfattende tilgang af samlede sekventering af messenger RNA'er af M. abscessus, blev udført for at afsløre RNA'er induceret eller undertrykt under amøbe Co kulturer i forhold til RNA'er transskriberet under in vitro- betingelser. Det differentierede udtryk af disse RNA'er kan overdrage til M. abscessus en forbedret "virulens" forklarer kolonisering af de øvre luftveje hos mennesker. Blandt RGM arter er M. abscessus en undtagelse til den ikke-patogene fænotype sammen med M. chelonae. M. abscessus evne til at forårsage lignende patologier at tuberkuløse mykobakterier gør det endnu mere unikt. Mange undersøgelser har rapporteret de intracellulære tilpasninger af M. tuberkulose liv inde i makrofager32,33 , men ingen har fokuseret på M. abscessus tilpasninger i vivo. Transkriptionel reaktion af M. abscessus hypoxi har været beskrevet34 dog fremhæve rollen, mycobactins og dosR regulon som beskrevet i M. tuberkulose. Analyse af M. abscessus transkriptom inde amøber og makrofager giver et indblik i de bakterielle tilpasninger til intracellulære liv i sig selv. En sammenligning af disse transcriptomes tillader vurdering af amøber udløse M. abscessus virulens i mennesker og at decifrere af specifikke tilpasninger af mammale fagocyterende celler rolle. En antagelse blev gjort at det amoebal miljø kan udgøre en uddannelse jorden for M. abscessus før overførsel til humane celler, for at beskrive M. abscessus virulens i form af Evolutionære tilpasninger, gør denne fremgangsmåde oprindelige .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi høj grad anerkende Pr. ej Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) for den dyrebare gave af muterede bibliotek, og Dr. Ben Marshall (Faculty of Medicine, University of Southampton, UK) til rettelser af manuskriptet. Vi anerkender meget fransk patienten Association for cystisk fibrose "Vaincre la Mucoviscidose" og "L'Association Gregory Lemarchal" for deres finansielle støtte (RF20150501377). Vi takker også det nationale agentur for forskning (ANR program DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) og Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) til finansiering af postdoc stipendium til V.L-M. L. L. er Ph.d.-stipendiat fra den "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6, (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2, (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83, (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4, (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170, (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42, (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36, (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60, (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4, (6), 5660 (2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17, (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9, (1), 87834 (2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10, (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7, (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11, (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12, (7), 0181121 (2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8, (1), 3939 (2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48, (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65, (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198, (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14, (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9, (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76, (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198, (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76, (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17, (1), 553 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics