Multimodal Bioluminescent और Positronic-उत्सर्जन टोमोग्राफी/Xenografts चूहों में एकाधिक मायलोमा अस्थि मज्जा नोग की गणना टोमोग्राफी इमेजिंग

Cancer Research

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Summary

यहां हम bioluminescent, एक्स-रे का उपयोग करें, और पोजीट्रान-उत्सर्जन टोमोग्राफी/गणना टोमोग्राफी इमेजिंग कैसे बाधा mTOR गतिविधि प्रभावों अस्थि मज्जा-engrafted मायलोमा ट्यूमर एक xenograft मॉडल में अध्ययन करने के लिए । यह शारीरिक रूप से प्रासंगिक, गैर इनवेसिव के लिए अनुमति देता है, और विरोधी के multimodal विश्लेषण के उपचार के मायलोमा प्रभाव अस्थि मज्जा लक्ष्यीकरण-engrafted vivo मेंमायलोमा ट्यूमर ।

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Gastelum, G., Chang, E. Y., Shackleford, D., Bernthal, N., Kraut, J., Francis, K., Smutko, V., Frost, P. Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice. J. Vis. Exp. (143), e58056, doi:10.3791/58056 (2019).

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Abstract

एकाधिक मायलोमा (मिमी) ट्यूमर अस्थि मज्जा (बीएम) में engraft और उनके अस्तित्व और प्रगति जटिल आणविक और सेलुलर बातचीत है कि इस microenvironment के भीतर मौजूद पर निर्भर हैं । अभी तक बीएम microenvironment आसानी से इनविट्रो, जो संभवतः में कई इन विट्रो और पूर्व vivo प्रयोगात्मक मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता सीमा को दोहराया नहीं जा सकता । इन मुद्दों में एक xenograft मॉडल का उपयोग करके दूर किया जा सकता है जिसमें luciferase (ल्यूक)-transfected ८२२६ मिमी कोशिकाओं को विशेष रूप से माउस कंकाल में engraft जाएगा. जब इन चूहों उपयुक्त सब्सट्रेट, डी-luciferin दिया जाता है, ट्यूमर विकास और अस्तित्व पर चिकित्सा के प्रभाव vivo मेंट्यूमर द्वारा उत्पादित bioluminescent छवियों (BLI) में परिवर्तन को मापने के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । यह BLI डेटा positronic-उत्सर्जन टोमोग्राफी/गणना टोमोग्राफी (पीईटी/सीटी-deoxy-2-(18एफ) fluoro-डी-ग्लूकोज (18एफ-FDG) का उपयोग कर विश्लेषण के साथ संयुक्त समय पर ट्यूमर चयापचय में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इन इमेजिंग प्लेटफार्मों ट्यूमर के भीतर एकाधिक इनवेसिव माप के लिए अनुमति/

Introduction

मिमी एक लाइलाज रोग है घातक प्लाज्मा बी कोशिकाओं से बना है कि बीएम घुसपैठ और अस्थि विनाश, एनीमिया, गुर्दे हानि, और संक्रमण का कारण है । मिमी 10% अप करता है-सभी रक्त द्रोह1 का 15% और कंकाल2शामिल करने के लिए सबसे अधिक बार कैंसर है. मिमी का विकास लंबे समय तक रहने वाले प्लाज्मा कोशिकाओं है कि लसीकावत् ऊतकों के कीटाणु केन्द्रों में स्थापित कर रहे हैं अंततः बीएम3के लिए होमिंग के oncogenic परिवर्तन से उपजा है । बीएम अत्यधिक विषम niches की विशेषता है; सहित विविध और महत्वपूर्ण सेलुलर घटकों, कम पीओ2 के क्षेत्रों (हाइपोक्सिया), व्यापक vascularization, जटिल extracellular मैट्रिक्स, और cytokine और विकास फैक्टर नेटवर्क, जो सभी मिमी tumorgenesis4में योगदान । इस प्रकार, एक प्रचारित MM xenograft मॉडल है कि सख्ती से बीएम में engrafted है द्वारा विशेषता के विकास के एक बहुत शक्तिशाली और नैदानिक प्रासंगिक vivo5,6में MM पैथोलॉजी अध्ययन उपकरण होगा । हालांकि, कई तकनीकी बाधाओं सबसे xenograft मॉडल की प्रभावशीलता को सीमित कर सकते हैं, उंहें महंगा है और लागू करने के लिए मुश्किल बना । इसमें बीएम आला के भीतर सुसंगत और reproducible ट्यूमर engraftment के साथ जुड़े समस्याओं, ट्यूमर के विकास के लिए एक लंबे समय तक, और सीमाओं को सीधे निरीक्षण और ट्यूमर के विकास के परिवर्तन को मापने की क्षमता में शामिल/ प्रयोग के दौरान चूहों को त्यागें7,8.

इस प्रोटोकॉल एक संशोधित xenograft मॉडल है कि शुरू में Miyakawa एट अल द्वारा विकसित किया गया था का उपयोग करता है । 9, जिसमें एक नसों में (IV) मायलोमा कोशिकाओं के परिणाम के साथ चुनौती "प्रसार" ट्यूमर है कि लगातार और reproducibly engraft के बीएम में मंजूरी/SCID/IL-2γ (अशक्त) (नोग) चूहों10। इन ट्यूमर का सीटू दृश्य में एक ल्यूक एलील के साथ ८२२६ मानव मिमी सेल लाइन के स्थिर अभिकर्मक द्वारा हासिल की है और प्रश्नपत्र इन engrafted ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित BLI में परिवर्तन को मापने6. महत्वपूर्ण बात, इस मॉडल के लिए विभिंन अंय ल्यूक-व्यक्त मानव मिमी सेल लाइनों (जैसे, U266 और OPM2) का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से नोग चूहों के कंकाल में engraft के लिए एक समान प्रवृत्ति के साथ विस्तारित किया जा सकता है । चूहों की bioluminescent इमेजिंग द्वारा ट्यूमर की पहचान radiopharmaceutical जांच (जैसे कि 18F-FDG के रूप में) के तेज को मापने के द्वारा पीछा किया जाता है पीईटी/एक साथ, यह महत्वपूर्ण जैव रसायन के अतिरिक्त लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है रास्ते (यानी, चयापचय में परिवर्तन, हाइपोक्सिया में बदलाव, और apoptosis की प्रेरण) ट्यूमर के भीतर/बीएम microenvironment । इस मॉडल की प्रमुख ताकत radiolabeled, bioluminescent और फ्लोरोसेंट जांच और मार्करों कि vivo मेंमिमी प्रगति और विकृति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की एक विस्तृत श्रृंखला की उपलब्धता से प्रकाश डाला जा सकता है ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं के नीचे वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और अधिक लॉस एंजिल्स VA स्वास्थ्य प्रणाली के उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया और बाँझ और रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया ।

1. Luciferase-एक्सप्रेस ८२२६ कोशिकाओं की तैयारी (८२२६-ल्यूक)

  1. RPMI में मानव मिमी सेल लाइन, ८२२६, बनाए रखने-१६४० मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक और एक humidified वातावरण में ३७ ° c पर 1% पेनिसिलिन-streptomycin ९५% हवा और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) युक्त.
  2. जनरेट स्थिर ल्यूक-एक्सप्रेस रिपोर्टर ८२२६ कक्षों द्वारा transfecting 1 x 106 ८२२६ कक्षों के साथ एक luciferase रिपोर्टर वेक्टर के साथ एक चयन द्वारा पीछा किया hygromycin (१००-३५० mg/एमएल) के रूप में पहले वर्णित6
  3. 2-3 सप्ताह के लिए मानक बाँझ संवर्धन शर्तों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने, मध्यम हर दूसरे दिन बदल रहा है, जब तक एक छुरा transfected ८२२६ सेल लाइन की स्थापना उत्पन्न किया गया है.
  4. की पुष्टि करें इन विट्रो luciferase गतिविधि 1 x 106 transfected कोशिकाओं में/100 µ एल के फास्फेट बफर खारा (पंजाबियों) luciferase सब्सट्रेट, डी-luciferin (१५० µ g/mL जोड़ने के द्वारा गरम संस्कृति माध्यम में समाधान काम कर), और मापने एक परीक्षण ट्यूब या ९६ में कोशिकाओं के bioluminescence-अच्छी तरह से एक luminometer6का उपयोग कर प्लेट ।

2. Orthotopic Xenograft मॉडल

  1. एक उपयुक्त पशु देखभाल सुविधा में बाँझ/रोगज़नक़-मुक्त शर्तों के तहत नोग चूहों (4-6 सप्ताह पुराना, पुरुष या महिला) बनाए रखें ।
  2. प्रयोग के दिन पर नोग चूहों (~ 5 x 106 कोशिकाओं/माउस) में आईवी इंजेक्शन के लिए ८२२६ ल्यूक-transfected कोशिकाओं को तैयार करें । बर्फ ठंडा पंजाबियों में 3x कोशिकाओं धो लो, उंहें गिनती, और उंहें बर्फ ठंडा पंजाब में (ऋण एंटीबायोटिक दवाओं और FBS) 5 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता में resuspend/एक बाँझ परीक्षण ट्यूब में पंजाब के 200 µ एल । बर्फ पर कोशिकाओं रखें और जितनी जल्दी हो सके चूहों को चुनौती (30-120 मिनट के भीतर).
  3. Anesthetize माउस (isoflurane के साथ, 1%-०.५ में हवा में 3%-1 L/मिनट) और जगह का सामना करना पड़ सिर के साथ एक हीटिंग पैड पर एक लापरवाह स्थिति में पशु । पाँव में चुटकी भरकर anesthetization के स्तर की जाँच करें. आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें ।
  4. एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज और एक 26-जी सुई का उपयोग कर पूंछ नस (२०० µ l/इंजेक्शन) के माध्यम से चूहों में ८२२६-ल्यूक कोशिकाओं इंजेक्षन.
    नोट: एक गर्मी दीपक पूंछ गर्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे नस फैली और इंजेक्शन की प्रभावकारिता में वृद्धि.
  5. उनके घर पिंजरे में पशु लौटें और जानवरों की निगरानी जब तक वे पूरी तरह से बरामद किया है ।
  6. anesthetized चूहों में BLI को मापने के द्वारा माउस कंकाल में ८२२६-ल्यूक कोशिकाओं के engraftment की पुष्टि करें (नीचे वर्णित और चित्र 1aमें दिखाया गया है).
    नोट: बीएम exudates भी मानव CD45 अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry (आंकड़ा 1b) या फसल की हड्डी (चित्रा 1C) के immunohistochemistry द्वारा उपयोग के लिए दाग हो सकता है ।

3. Vivo में BLI का माप

नोट: आमतौर पर, चूहों में engrafted ट्यूमर से मापने योग्य BLI 10-20 दिन postchallenge के बीच पहली बार देखा जा सकता है, लेकिन यह प्रयोग करने के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है.

  1. Anesthetize माउस (isoflurane के साथ, 1%-०.५ में हवा में 3%-1 L/मिनट) और पैर की अंगुली चुटकी द्वारा anesthetization के स्तर की जांच करें । अपनी आंखों में नेत्र मरहम लागू करें ।
  2. पशु एक आईपी इंजेक्शन (२०० µ एल इंजेक्शन) की "vivo मेंग्रेड" डी-luciferin सब्सट्रेट (30 मिलीग्राम/एमएल बाँझ खारा में पतला) दे ।
  3. 5-10 मिनट के भीतर BLI उपाय, luciferin सब्सट्रेट के इंजेक्शन के बाद (हालांकि BLI गतिविधि ४५-६० मिनट तक के लिए चूहों में चौकसी की जा सकती है), एक छोटे जानवर इमेजिंग प्रणाली में एक लापरवाह स्थिति में anesthetized जानवर रखकर (चित्रा 2 ). luminescent और एक्स-रे विश्लेषण का चयन करें और छवियों को प्राप्त (चित्रा 3) ।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 4) का उपयोग कर ब्याज (ROIs) के चयनित क्षेत्रों में औसत चमक (फोटॉनों/s/cm2/steradian) को मापने ।
    2. अपने घर पिंजरे में पशु लौटें और इसे मॉनिटर जब तक यह पूरी तरह से (लगभग 15-20 मिनट) बरामद किया है ।

4. लक्षित थेरेपी के साथ चूहों का उपचार

  1. आधारभूत BLI को मापने और उपचार समूहों (4-8 चूहों/समूह) में जानवरों यादृच्छिक ।
  2. temsirolimus के एक आईपी इंजेक्शन (२०० µ l/इंजेक्शन) के साथ चूहों का इलाज (०.२-४० मिलीग्राम/पांच दैनिक आईपी इंजेक्शन के एक आहार का उपयोग कर आराम के 2 दिन और एक अतिरिक्त पांच दैनिक इंजेक्शन11द्वारा पीछा किया ।
  3. खंड 3 में वर्णित के रूप में luciferase गतिविधि (फोटॉनों/s/cm2/steradian) 2x प्रति सप्ताह उपाय और समय के साथ BLI के परिवर्तन साजिश । ट्यूमर BLI में परिवर्तन चूहों (चित्रा 5B) के धारावाहिक छवियों के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है ।
    नोट: यह अनुशंसित है कि पशुओं की दैनिक निगरानी जब तक वे निंनलिखित लक्षण मौजूद (आमतौर पर ४५-६० प्रारंभिक चुनौती के दिनों के भीतर): वजन घटाने (प्रत्यारोपण से पहले वजन के सापेक्ष 10% से अधिक की हानि) और/ अंग पक्षाघात, जिस पर समय वे एक सह2 गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के बाद चैंबर का उपयोग euthanized होना चाहिए ।

5. पीईटी/सीटी विश्लेषण का उपयोग 18एफ-FDG ट्यूमर चयापचय में परिवर्तन को मापने के लिए

  1. तेजी से अपने घर पिंजरे में जानवरों को 24 एच के लिए अपने भोजन को हटाने से प्रयोग करने से पहले अतिरिक्त गैर 18एफ-FDG के विशेष तेज से बचने के लिए ।
  2. 18एफ तैयार radiolabeled FDG पालतू जांच (५०-१०० µ ci/इंजेक्शन बाँझ खारा में) प्रयोग के दिन । एक खुराक औजार के साथ 18एफ FDG जांच के समय और गतिविधि रिकॉर्ड ।
    नोट: क्योंकि 18एफ एक अपेक्षाकृत कम आधा जीवन (~ 2 एच), एक सावधान तैयारी और इन जांच के उपयोग के लिए योजना स्थापित किया जाना चाहिए है ।
  3. Anesthetize पशु (isoflurane के साथ, 1%-०.५ में हवा में 3%-1 L/मिनट) और यह दूर का सामना करना पड़ सिर के साथ एक हीटिंग पैड पर एक लापरवाह स्थिति में जगह है । पाँव में चुटकी भरकर anesthetization के स्तर की जाँच करें. अपनी आंखों में नेत्र मरहम लागू करें ।
  4. पूंछ नस (१०० µ एल इंजेक्शन) के माध्यम से जांच सुई एक ढाल 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज और एक 26-जी सुई का उपयोग कर ।
    नोट: एक गर्मी दीपक पूंछ गर्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे नस फैली और इंजेक्शन की प्रभावकारिता में वृद्धि.
  5. एक खुराक औजार में सुई/सिरिंज में अवशिष्ट रेडियोधर्मिता को मापने और गतिविधि और समय पर ध्यान दें.
    नोट: माउस मशीन के मानकीकरण, खुराक, और समय डेटा reproducibility और तुलना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है.
  6. संज्ञाहरण के तहत चूहों को बनाए रखने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर जांच की पूरी अवधि के दौरान एक हीटिंग पैड का उपयोग (~ ४५-९० मिनट) ।
    नोट: यह चूहों quiescent और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रहने के लिए जांच के गैर विशिष्ट तेज से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  7. 18F-FDG जांच के इंजेक्शन लगभग 20-करने के लिए 30-ंयूनतम अंतराल पर होने के लिए चूहों में समान लेबलिंग समय सुनिश्चित करें ।
    नोट: उचित कार्यप्रवाह और जांच इंजेक्शन के समय इष्टतम और reproducible इमेजिंग शर्तों में परिणाम होगा ।
  8. engrafted ट्यूमर (चित्रा 6) के अनुरूप है कि ब्याज के चयनित क्षेत्रों में एक पालतू/सीटी छोटे पशु इमेजिंग प्रणाली में 18एफ-FDG गतिविधि को मापने.
    ध्यान दें: शुरू में, एक 10-ंयूनतम स्थैतिक पालतू निवेश और एक 2-ंयूनतम सीटी एक्सपोजर की सिफारिश की है, लेकिन सटीक जोखिम समय के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  9. अपने घर पिंजरों के लिए जानवरों को वापस और उन्हें पूरी तरह से बरामद तक निगरानी । 24 एच के लिए एक समर्पित वापसी कमरे में चूहों घर जबकि जांच पृष्ठभूमि के स्तर तक क्षय ।
    नोट: क्योंकि छोटे आधे के जीवन 18एफ, एकाधिक माप एक ताजा जांच का उपयोग कर के रूप में अक्सर प्रति सप्ताह 2x के रूप में किया जा सकता है ।

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Representative Results

प्रारंभिक पायलट अध्ययन में, ८२२६-ल्यूक कोशिकाओं के IV इंजेक्शन मंजूरी/SCID चूहों में बीएम-engrafted mm ट्यूमर विकसित नहीं किया था, हालांकि स्क्वैमस mm ट्यूमर आसानी से बनते थे (१००% सफलता दर) । इसके विपरीत, नोग चूहों में ८२२६ कोशिकाओं के साथ चतुर्थ चुनौतियों (15-25 दिनों के भीतर) कंकाल में ट्यूमर उत्पन्न (और केवल शायद ही कभी गैर-कंकाल ऊतक, जैसे जिगर या तिल्ली के रूप में ट्यूमर का गठन). कंकाल में ट्यूमर नेत्रहीन जानवरों की जांच शारीरिक रूप से पुष्टि नहीं किया जा सकता है के बाद से, अन्य तरीकों को सफल ट्यूमर engraftment और बी एम (चित्रा 1) के भीतर ट्यूमर के स्थान की पुष्टि करने के लिए विचार किया जाना था । Miyakawa एट अल द्वारा रिपोर्टों के समान । 9, मानव आईजीजी, ८२२६ कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, चुनौती दी नोग के सीरम में पाया जा सकता है एलिसा का उपयोग चूहों (डेटा नहीं दिखाया गया है), हालांकि इन आंकड़ों केवल engraftment और नहीं स्थान या ट्यूमर की सीमा की पुष्टि की । एकाधिक जानवरों के धारावाहिक इमेजिंग बीएम-engrafted MM ट्यूमर (चित्रा 4) के वितरण से पता चलता है । इन engrafted ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित BLI तो प्रश्नपत्र और गैर इनवेसिव mTOR अवरोधक temsirolimus (चित्रा 5) के साथ इलाज चूहों में ट्यूमर के विकास और अस्तित्व में परिवर्तन का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है । अंत में, पीईटी/ट्यूमर में 18एफ-FDG के ऊपर के लिए विश्लेषण, ग्लूकोज चयापचय में temsirolimus मध्यस्थता परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और यह ट्यूमर वृद्धि (चित्रा 6) में परिवर्तन के साथ संबंधित. हालांकि, एक luciferase एलील के साथ छुरा transfecting ८२२६ कोशिकाओं द्वारा एक ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में/एक्स-रे विश्लेषण, सटीक स्थान और माउस कंकाल में MM ट्यूमर के वितरण जल्दी और गैर इनवेसिव निर्धारित किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: माउस कंकाल में ८२२६-ल्यूक कक्षों की engraftment की पुष्टि । () नोग चूहों 5 x 106 ८२२६-LUC2 कोशिकाओं चतुर्थ (बाईं तरफ माउस) या खारा के साथ (सही पर माउस) के साथ चुनौती दी गई । 15 दिनों के बाद, चूहों डी-luciferin सब्सट्रेट के एक आईपी इंजेक्शन दिया और एक छोटे जानवर इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर छवि थे. () जिन चूहों की बलि दी गई थी, femurs एकत्र किए गए थे, और बीएम सेलुलर रिसाव को काटा गया था । मानव CD45 की अभिव्यक्ति एक पे-संयुग्मित एंटी-ह्यूमन CD45 एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित की गई थी । () इस पैनल के माउस femurs के धारावाहिक वर्गों के एक immunohistochemistry से पता चलता है हाइपोक्सिया का उपयोग pimonidazole (शीर्ष पैनलों) या चूहों में मानव CD45 (नीचे पैनलों) ८२२६ (सही पैनलों) या खारा (नियंत्रण; बाएं पैनलों) के साथ चुनौती दी । तारक धारावाहिक वर्गों में एक बड़े रक्त वाहिनियों के स्थान को इंगित करता है । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: Anesthetized नोग चूहों अस्थि मज्जा से BLI संकेत को मापने के लिए पहले इमेजिंग प्रणाली में स्थिति दिखा-engrafted MM ट्यूमर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ऑप्टिकल इमेजिंग और नोग चूहों से एकत्र bioluminescent संकेत के एक्स-रे विश्लेषण के सेट अप. एक बार जानवरों को सफलतापूर्वक चुनौती दी गई है और बीएम में ट्यूमर की engraftment पुष्टि की गई है, चूहों के उपचार समूहों में यादृच्छिक किया जा सकता है । प्रयोग के दौरान विभिन्न समयों पर BLI में बदलाव के लिए जानवरों पर नजर रखी जा सकती है । क्योंकि प्रक्रिया आक्रामक है, निगरानी की आवृत्ति ट्यूमर की उंमीद की वृद्धि को प्रतिबिंबित करने के लिए बदला जा सकता है, साथ ही कैंसर की कोशिकाओं को कैसे जल्दी से चिकित्सा का जवाब होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: कई अस्थि मज्जा का वितरण दिखा जानवरों के सीरियल इमेजिंग-engrafted MM ट्यूमर । प्रत्येक माउस के लिए ब्याज (ROI) के क्षेत्रों की पहचान की जाती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक विरोधी मिमी चिकित्सकीय आहार के दौरान नोग चूहों में engrafted ट्यूमर के BLI में परिवर्तन. (a) यह पैनल temsirolimus में औसत चमक (p/s/cm2/ser) में परिवर्तन दिखाता है (20 मिलीग्राम/केजी माउस)-इलाज नोग चूहों 5 x 106 कोशिकाओं के साथ चतुर्थ चुनौती दी । एक बार चूहों engrafted ट्यूमर के लिए सकारात्मक होने के लिए मनाया गया, वे विभिन्न उपचार समूहों में यादृच्छिक थे. चूहों दैनिक पांच आईपी इंजेक्शन दिए गए थे, बाकी के 2 दिनों के बाद और, फिर, temsirolimus के एक अतिरिक्त पांच आईपी इंजेक्शन (एक्स-अक्ष पर सलाखों के उपचार के दिनों का संकेत) या वाहन नियंत्रण. विभिन्न दिनों पर, चूहों "vivo मेंग्रेड" डी-luciferin के आईपी इंजेक्शन दिए गए थे, और BLI एक ऑप्टिकल इमेजिंग मंच का उपयोग कर मापा गया था. मान औसत चमक (p/s/cm2/ser) ± एक ९५% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं । () यह कापलान-Meier भूखंड समय के साथ जीवित चूहों के प्रतिशत में परिवर्तन दिखाता है. चूहों कि समापन बिंदु मानदंड तक पहुंच गया था (यानी, > 10% शरीर के वजन या हिंद अंग पक्षाघात का नुकसान) humanely euthanized थे । () इस पैनल ल्यूक गतिविधि में परिवर्तन दिखा 28, ३५, और ४०, दिनों पर लिया चूहों के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: धारावाहिक इमेजिंग और 18एफ में सापेक्ष परिवर्तन-FDG पालतू/ () यह पैनल bioluminescence के लिए एक ही माउस के धारावाहिक इमेजिंग दिखाता है (ऑप्टिकल इमेजिंग/X-ray) इमेजिंग और 18F-FDG के द्वारा । BLI anesthetized चूहों में मापा गया था, और एक ही माउस के पीईटी/सीटी इमेजिंग 24 ज बाद में किया गया था । माउस रात भर तेजी से और, अध्ययन के दिन पर, ५० µ सीआई 18एफ-FDG के एक आईवी इंजेक्शन प्राप्त किया । चूहों जांच के दौरान संज्ञाहरण के तहत बनाए रखा गया था तेज गर्मी (६० मिनट) और, तो, 18एफ के लिए विश्लेषण किया गया FDG पालतू द्वारा तेज/ ट्यूमर (T1 और टी 2) संकेत कर रहे हैं. एच = दिल, कश्मीर = गुर्दे, और बी = मूत्राशय । () इस पैनल के सापेक्ष परिवर्तन (अनुपचारित नियंत्रण ट्यूमर के एक प्रतिशत में) से पता चलता है 18F-FDG में नियंत्रण चूहों में (कोई उपचार) या temsirolimus (20 मिलीग्राम/kg माउस)-इलाज चूहों (दिन में मापा 22, ३५, और ४०). डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (एन = 5 चूहों) ± 1 S.D. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मिमी6,9,11,12,13के नैदानिक xenograft मॉडल की एक किस्म के बावजूद, बीएम microenvironment के भीतर ट्यूमर/बीएम बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता मुश्किल रहता है 14. यहां वर्णित तकनीकों में नोग चूहों के कंकाल में ८२२६-ल्यूक ट्यूमर कोशिकाओं की तेजी और reproducible engraftment के लिए अनुमति देते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में luciferase-एक्सप्रेस एमएम सेल लाइनों की स्थापना और luciferase की एक स्थिर अभिव्यक्ति का सत्यापन इन विट्रो15में शामिल है । एक बार सेल लाइनों की स्थापना की गई है, नोग चूहों आईवी इंजेक्शन द्वारा चुनौती दी है, और कंकाल के लिए ट्यूमर के engraftment vivo में BLI गतिविधि को मापने के द्वारा पुष्टि की है (आमतौर पर 10-20 दिनों के भीतर postchallenge) (आंकड़ा 1a) । नोग चूहों का उपयोग महत्वपूर्ण है क्योंकि अन्य immunodeficient उपभेदों (जैसे मंजूरी/SCID) आम तौर पर बीएम-engrafted ट्यूमर के रूप में नहीं है । आरोपण के अपेक्षाकृत उच्च सफलता दर (> ९०%) और कम अंतराल एक सकारात्मक BLI संकेत का पालन करने के लिए इस मॉडल एक उच्च प्रवाह और अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए आदर्श बनाता है विरोधी मिमी चिकित्सकीय मोडलों (चित्रा 4). इस मॉडल का एक और बहुत महत्वपूर्ण पहलू यह है कि बीएम-engrafted MM सेल लाइंस अपने रूपात्मक और पैरेंट्स सेल लाइंस (जैसे, ८२२६, U266) के immunologic फीचर्स को बनाए रखती हैं; वे लगातार और reproducible वृद्धि पैटर्न और रोगी रोगों के प्रदर्शन विशेषताओं, ऐसे सीरम मानव आईजीजी paraprotein स्तर और हड्डी के घावों के गठन के रूप में है ।

इस रणनीति का लाभ है इन शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए बार बार जैव रासायनिक और ट्यूमर के आणविक घटकों का अध्ययन/बीएम microenvironment रोग प्रगति के दौरान और विरोधी ट्यूमर चिकित्सा के जवाब में । इस प्रयोग में, हमने पाया कि बीएम-engrafted मायलोमा ट्यूमर के साथ चूहों में mTOR गतिविधि लक्ष्यीकरण bioluminescent माप है कि समय के साथ मनाया जा सकता है में कमी के परिणामस्वरूप । इसके अलावा, हमने पाया है कि इन एक ही ट्यूमर में 18एफ FDG जांच (चित्रा घमण्ड) के तेज में परिवर्तन bioluminescent संकेत (चित्रा 5B) में परिवर्तन करने के लिए संबंधित थे । इस प्रक्रिया का एक और महत्वपूर्ण घटक है कि कई जैव रासायनिक चर समय के साथ ट्यूमर के भीतर मापा जा सकता है । ट्यूमर प्रगति ट्यूमर फिजियोलॉजी और microenvironment विशेषताओं में परिवर्तन की विशेषता एक गतिशील प्रक्रिया है क्योंकि यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, इस प्रक्रिया, क्योंकि अपनी गैर इनवेसिव प्रकृति और अपेक्षाकृत कम आधा जांच के जीवन, चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया में परिवर्तन के कई अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।

तकनीक माहिर के बाद, तकनीक के भविष्य अनुप्रयोगों लचीलापन का एक बड़ा सौदा मौजूद । उदाहरण के लिए, अंय bioluminescent या फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करें (जैसे, फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी) भी उपयोग किया जा सकता है, के रूप में विभिंन अंय 18च लेबल जांच और radiopharmaceutical यौगिकों के लिए विशिष्ट जैव रासायनिक अध्ययन सकताहै रास्ते या ट्यूमर में प्रक्रियाओं/बीएम microenvironment । इन radionucleotides के कई के छोटे आधे जीवन की वजह से, एक विशिष्ट प्रयोग के पाठ्यक्रम के दौरान कई धारावाहिक माप बनाया जा सकता है दवा के लिए, वितरण, कैनेटीक्स, और क्षय का अध्ययन । इस xenograft मॉडल का उपयोग करना, मिमी की क्षमता अन्य जांच का उपयोग करके anaerobic glycolysis और अन्य चयापचय मार्ग (यानी, फैटी एसिड संश्लेषण) उपयोग करने के लिए (जैसे,18f-fluoro-2deoxyglucose [18f-FDG] और 18 F-fluoro-4-थिया-palmitate [FTP])16,17, साथ ही एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जांच का उपयोग कर उपचार के विरोधी प्रफलन प्रभाव को मापने की क्षमता (यानी, 3 '-deoxy-3 '-[18F] fluorothymidine [ 18F-FLT]) को प्रायोगिक डिजाइनों में शामिल किया जा सकता है । इसके अलावा, vivo18में apoptosis को मापने के लिए 18F-Annexin B1 का उपयोग करके सीधे कोशिका मृत्यु को मापने के लिए संभव हो सकता है । इन यौगिकों के कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।

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Disclosures

लेखक केविन फ्रांसिस Perkin-Elmer के एक कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

यह काम पीएफ करने के लिए दिग्गजों मामलों जैव चिकित्सा प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास सेवा (BLRDS) के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग से एक va योग्यता grant1I01BX001532 द्वारा समर्थित किया गया था, और ईसी VA नैदानिक विज्ञान आर & डी सेवा से समर्थन स्वीकार करता है ( मेरिट अवार्ड I01CX001388) तथा VA रिहैबिलिटेशन आर & डी सेवा (मेरिट अवार्ड I01RX002604) । इसके अलावा समर्थन एक UCLA संकाय बीज अनुदान से आया जे rowling इन सामग्रियों के दिग्गजों मामलों या अमेरिकी सरकार के अमेरिकी विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व करना जरूरी नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8226 human myeloma cell line ATCC CCL-155
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) Jackson Labs 5557
VivoGlo Luciferin substrate Promega P1041
Hypoxyprobe-1Kit HPL HP1-100
PE-CD45 (clone H130) BD Biosciences 555483 Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate
rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) Cell Signaling Technology 70527 Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone
Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) ABCAM ab205718 Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
pGL4.5 Luciferase Reporter Vector Promega E1310
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Sofie G8 PET/CT Imaging System Perkin Elmer

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References

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