Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Cancer Research

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Summary

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H. G., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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Abstract

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par l’expansion des clones de cellules malignes de B et représente la leucémie la plus courante dans les pays occidentaux. La majorité des patients atteints de LLC montrent une lente évolution de la maladie ainsi qu’un phénotype anergiques de leurs cellules de la leucémie, se référant à un récepteur des cellules B ne répond pas à une stimulation externe. Nous avons récemment démontré que le facteur de transcription NFAT2 est un régulateur crucial d’anergie à CLL. Un défi majeur dans l’analyse du rôle d’un facteur de transcription dans différentes maladies est l’identification de ses gènes cibles spécifiques. Il s’agit d’une grande importance pour l’élucidation des mécanismes pathogéniques et interventions thérapeutiques potentielles. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique classique pour démontrer les interactions protéine-ADN et, par conséquent, permet d’identifier les gènes de la cible directe de facteurs de transcription dans des cellules de mammifères. Ici, ChIP a été utilisée pour identifier LCK comme un gène cible directe des NFAT2 dans les cellules humaines de CLL. L’ADN et protéines associées sont réticulés à l’aide de formaldéhyde et cisaillement par la suite par sonication dans des fragments d’ADN d’environ 200 à 500 paires de bases (bp). Des fragments d’ADN réticulés associés à NFAT2 sont ensuite sélectivement immunoprécipitée des débris de cellules à l’aide d’un anticorps αNFAT2. Après purification, les fragments d’ADN associées sont détectés par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Des séquences d’ADN avec évident enrichissement représentent des régions du génome qui sont ciblées par les NFAT2 en vivo. Tonte appropriée de l’ADN et la sélection de l’anticorps requis sont particulièrement crucial pour l’application de cette méthode. Ce protocole est idéal pour la démonstration des interactions directes de NFAT2 avec des gènes cibles. Sa principale limitation est la difficulté d’employer la puce lors d’essais à grande échelle, analysant les gènes cibles de plusieurs facteurs de transcription dans les organismes intacts.

Introduction

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) représente la leucémie plus courante chez les adultes dans les pays occidentaux, présentant une accumulation distincte de CD19, CD5 et CD23 exprimant B mature cellules1. La plupart des patients présentent une évolution de la maladie indolente, qui ne nécessite pas de traitement spécifique pendant de nombreuses années. En revanche, certains patients montrent une progression rapide nécessitant des interventions thérapeutiques immédiates avec immunitaire-chimiothérapie ou autres thérapies ciblées2,3. Facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) est une famille de facteurs de transcription contrôlant divers du développement et processus d’activation de nombreuses cellules types4,5,6. Nous avons démontré récemment surexpression et activation constitutionnelle de NFAT2 dans les cellules CLL de patients atteints de maladie indolente7. Ici, il règle un État ne répondant pas à la stimulation des récepteurs de cellules de B appelé anergie7. Pour démontrer que les NFAT2 se lie au promoteur lymphocytes spécifiques protéine tyrosine kinase (LCK) et régule l’expression LCK dans les cellules humaines du CLL, une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine spécifiques (ChIP) a été développée et utilisée.

Puce est une des plusieurs techniques pour enquêter sur le rôle des facteurs de transcription à l' expression de gène8. L’expression des gènes est bien orchestrée de façon très complexe par plusieurs organismes de réglementation présentant des facteurs de transcription, en tenant un rôle irremplaçable dans ce processus9,10,11,12. Facteurs de transcription régulant l’expression de gène dans un contexte spatial et temporel ont été identifiés chez de nombreuses espèces (par exemple, pour le développement et la différenciation)13,14,15, 16,17,18. Erreurs dans les mécanismes de contrôle complexes faisant intervenir des facteurs de transcription peuvent conduire à une variété de processus pathologiques, y compris le cancer19,20. Par conséquent, identification des facteurs de transcription et de leurs cibles respectives peut-être offrir nouvelles avenues thérapeutiques21,22. Afin d’étudier ce domaine fascinant, plusieurs méthodes sont disponibles comme puce, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), différents dosages d’ADN déroulants et journaliste-essais8,11,12, 23 , 24.

Pour démontrer qu’un certain facteur de transcription interagit avec certaines régions du génome, in vivo, ChIP est une technique idéale de25. À cet effet, ADN et protéines associées dans les cellules vivantes sont réticulées en utilisant l’irradiation UV ou formaldéhyde (puce réticulé, XChIP). Cette étape est omise pour obtenir le meilleur ADN et récupération de protéines dans la dite native de puce (NChIP)26. Par la suite, les complexes de protéines et l’ADN sont cisaillés par sonication en fragments d’environ 200 à 500 paires de bases (PB) et immunoprécipitée des débris cellulaires à l’aide d’un anticorps spécifique contre le facteur de transcription d’intérêt. Les fragments d’ADN associées sont ensuite purifiées et caractérisées par PCR, clonage et séquençage. Techniques alternatives utilisent des puces à ADN (ChIP-on-Chip) ou le séquençage de prochaine génération (ChIP-Seq) pour analyser l’ADN d’immunoprécipitée.

Puce a été introduite par Gilmour et Lis en 1984 quand ils ont utilisé des UV lumière de façon covalente de réticulation ADN et lié des protéines dans la vie des bactéries27. Lors de la lyse cellulaire et immunoprécipitation de la polymérase de l’ARN, des sondes spécifiques de gènes connus ont été utilisés pour cartographier la in vivo la distribution et la densité de l’ARN polymérase. La méthode a été par la suite utilisée par les mêmes chercheurs pour analyser la distribution des eucaryote ARN polymérase II sur les gènes de protéines de choc thermique dans la drosophile28. Le test de XChIP a été affiné par Varshavsky et collègues de travail qui a d’abord été utilisé formaldéhyde de réticulation pour étudier l’association de l’histone H4 avec heat shock protéines gènes29,30. L’approche NChIP, qui comporte l’avantage d’une meilleure récupération de l’ADN et des protéines en raison des épitopes naturellement intactes et, par conséquent, une plus grande spécificité de l’anticorps, a été décrite par Hebbes et collègues 198831.

L’avantage de la puce par rapport à d’autres techniques pour analyser les interactions ADN-protéines est en fait, que l’interaction réelle d’un facteur de transcription peut être étudié in vivo et aucune des sondes ou des conditions artificielles créées par des tampons ou des gels sont employait8,11,12. En combinant puce avec le séquençage de nouvelle génération, plusieurs cibles peuvent être identifiés en même temps.

Les principales limites de cette technique sont son applicabilité limitée aux essais à grande échelle dans les organismes intact25. L’analyse des modèles d’expression différentielle des gènes peut être aussi difficile à l’aide de techniques de puce si les protéines respectifs sont exprimés uniquement à des niveaux bas ou pendant les fenêtres de temps étroit. Un autre facteur potentiellement limitant est la disponibilité d’un anticorps approprié adapté pour puce11.

Le protocole de puce présenté ici peut être employé pour identifier des gènes de cible d’un facteur de transcription in vivo par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Plus précisément, l’objectif était d’identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2 en CLL. Puce a été choisi en raison de son potentiel de démontrer directement la liaison de la NFAT2 pour les régions promotrices des gènes cibles différents dans des conditions naturelles dans des cellules humaines CLL patients.

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Protocol

Toutes les expériences menées avec le matériel humain ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Tübingen et consentement éclairé a été obtenu de tous les patients qui ont contribué à cette étude, les échantillons.

1. isolement et Stimulation de Jurkat cellules

Remarque : Pour optimiser le protocole, utilisez la lignée Jurkat dont on sait qu’expriment des niveaux élevés de NFAT2. Toutes les mesures sont effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer 50 mL du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine par ce réchauffement à 37 ° C dans un bain d’eau.
  2. Culture de cellules Jurkat pour 1-2 jours dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 dans 20 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine à une densité d’environ 2 x 106 cellules/mL (cellules sont comptées avec Trypan coloration bleue et un Chambre de Neubauer au microscope) et leur capture par centrifugation pendant 5 min à 200 x g.
  3. Retirez le surnageant avec une pipette et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine. Par la suite, compter les cellules avec une coloration bleu de trypan conventionnels et d’une chambre de Neubauer sous le microscope.
  4. Centrifuger les cellules de l’étape 1.3 pendant 5 min à 200 x g et éliminer le surnageant par aspiration. Ensuite, remettre en suspension les cellules à une densité de 2 x 107 cellules/mL dans le RPMI 1640 additionné de 10 % FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine et transfert 1 mL dans un nouveau tube conventionnel 5 mL de pipetage.
  5. Stimuler les cellules en ajoutant 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 µM ionomycine. Puis incuber les cellules pendant 16 h à 37 ° C et 5 % de CO2 avec le couvercle du tube ouvert (pour éviter toute contamination, un film d’étanchéité perméable à l’air peut être utilisé).

2. isolement et Stimulation des cellules primaires CLL de Patients humains

Remarque : Des échantillons de patients ont été acquis et stimulés comme décrit précédemment7. Toutes les mesures sont effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer le matériel nécessaire pour prélever du sang de patients et d’effectuer une séparation de gradient de densité : 21-G aiguilles, garrot, NH4-héparine-sang seringues de collection (par exemple, monovettes-S), 1 x PBS et milieu de gradient de densité (densité 1,077 g/mL) .
  2. Après ponction veineuse, tirer le sang de patients atteints de LLC (ca. 40 mL de sang par patient) dans les seringues. Alors transférer le sang dans les tubes coniques de 50 mL. Lavez la seringue 10 ml de PBS et mettre en commun la sang-PBS-suspension dans les tubes de 50 mL (ajuster le nombre de tubes pour le volume de sang).
  3. Préparer 15 mL du milieu de gradient de densité dans un tube conique frais 50 mL. Par la suite, la couche 35 mL de sang-PBS-suspension soigneusement sur le milieu de gradient de densité. Pour ce faire, tenir le tube à un angle plat et Pipetter lentement la sang-PBS-suspension contre le mur du fond du tube conique 50 mL. Comme plus de la suspension-PBS-sang s’accumule dans le tube conique de 50 mL, augmenter l’angle du tube jusqu'à un angle droit. Répétez cette étape selon le volume de sang-PBS-suspension.
  4. Effectuer la centrifugation à 560 x g pendant 20 min (sans frein), puis l’extraire de la phase de cellules mononucléées contenant les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC). Pour ce faire, recueillir l’interphase blanc de la séparation de gradient de densité avec une pipette sérologique de 5 mL et le transférer dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  5. Remplir la cellule en suspension dans 50 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 360 x g. Retirez le surnageant par aspiration. Répétez cette étape avec centrifugation pendant 5 min à 275 x g. Ensuite, mettre en commun les cellules d’un patient en 5-10 mL de PBS dans un tube conique de 50 mL.
  6. Compter les cellules comme décrit au point 1.3.
    Remarque : Cela dépend de la proportion de cellules CLL dans les PBMC isolés, si les cellules peuvent être utilisés directement pour cette procédure ou un isolement des cellules de B doit être effectué, par exemple, par l’intermédiaire de cellules magnétiques tri (MACS). L’isolement de cellules B est recommandé, mais peut être omis si la proportion de cellules CLL est supérieure à 95 % des lymphocytes totaux (déterminées par cytométrie en flux). Sang du CLL patients est fixe et lysées selon les instructions du fabricant. Puis un marquage avec des anticorps CD19-FITC et CD5-PE est effectué selon les instructions du fabricant et les cellules sont analysés par cytométrie en flux. Un patient exemplaire est illustré à la Figure 1, dans lequel la proportion de cellules CLL est 89.03 %. Ainsi, un isolement de cellules de B doit être effectué chez cette patiente. La proportion de cellules de B physiologiques est négligeable (3,72 % dans l’exemple).
  7. Laver les cellules avec 10 mL de pré chauffé (37 ° C) RPMI 1640 complétée avec FCS de 10 %, 1 % pénicilline/streptomycine, 100 mM des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM et 50 mM β-mercaptoéthanol pendant 5 min à 200 x g et éliminer le surnageant par aspiration.
  8. Ajuster les cellules à 2 x 107 cellules/mL dans le RPMI 1640 additionné de 10 % FCS, 1 % pénicilline/streptomycine, des acides aminés non essentiels 100 mM, 1 mM sodium pyruvate et 50 mM β-mercaptoéthanol (37 ° C) et remplissage 1 mL de la suspension de cellules dans un tube de 5 mL.
    Remarque : Le β-mercaptoéthanol est employée pour lutter contre le stress oxydatif.
  9. Stimuler les cellules en ajoutant 32,4 nM PMA et 1 µM ionomycine. Puis incuber les cellules pendant 16 h à 37 ° C et 5 % de CO2 avec le couvercle du tube ouvert (pour éviter toute contamination, un film d’étanchéité perméable à l’air peut être utilisé).
    Remarque : Pour réduire le niveau de stress, les cellules peuvent être reposés pendant 1 h à 37 ° C et 5 % de CO2 dans l’incubateur avant le 16 h de stimulation.

3. fixation, lyse cellulaire et le cisaillement de la chromatine

Remarque : Les échantillons des patients et des cellules Jurkat sont fixes et lysées avec un kit puce commercialement disponible selon les instructions du fabricant avec modifications comme décrit plus haut7. La fixation est réalisée sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer un tube de 1,5 mL avec 1 mL de 37 % de formaldéhyde, un tube de 1,5 mL avec 1 mL de 1,25 M glycine, un tube de 5 mL avec 4 mL de solution 1 PBS x et une boîte avec de la glace pour la fixation des cellules.
  2. Après la stimulation des cellules pour le temps d’incubation respectifs à l’étape 1.5 ou 2,9, tourner les tubes de 5 mL à 200 x g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS dans les tubes de 5 mL.
  3. Ajoutez le 340 µM formaldéhyde (13,5 µL de 37 % de formaldéhyde) aux cellules. Après avoir mélangé brièvement en pipettant également soigneusement, monter et descendre incuber la suspension pendant 2,5 min (cellules Jurkat) ou 5 min (échantillon) à température ambiante.
    NOTE : Temps de fixation prolongée est nécessaire pour les cellules primaires assurer une tonte optimale.
  4. Ajouter une glycine de 125 mM (57 µL de glycine de 1,25 M) pour arrêter la fixation et incuber pendant un autre 5 min. mettre les cellules sur la glace immédiatement après et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant par aspiration.
  5. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS glacée à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant de chaque fois par aspiration.
    Remarque : Après la fixation, le protocole peut être suspendu. Les cellules fixes doivent être conservés à-80 ° C. Pour vérifier, si l’épitope de l’anticorps destiné à utiliser dans le protocole suivant n’est pas masqué par l’intermédiaire de fixation, échantillons supplémentaires peuvent être utilisés pour l’analyse par électrophorèse SDS-PAGE et Western blot. Ces étapes sont effectuées avec 100 µg de protéines selon les instructions du fabricant. Tous les anticorps αNFAT2 sont utilisés à une dilution de 1/1000, l’anticorps GAPDH à une dilution de 1 : 10000. Une image exemplaire d’échantillons fixes de cellules Jurkat avec anticorps appropriés et inappropriés est illustrée à la Figure 2.
  6. Resuspendre le culot cellulaire dans 5 mL de tampon de lyse commercialement disponible 1 par pipetage de haut en bas. Ensuite, placer les échantillons sur la glace sur un agitateur et les incuber pendant 10 min et en agitant.
    Remarque : Avant de lyse, les cellules peuvent être désintégrées pendant 10 s dans l’azote liquide. Ceci est utile pour les cellules Jurkat mais doit être évitée dans les échantillons de patients primaires. Pour la désintégration, placer les tubes de 5 mL pour 5 s dans 5-10 mL d’azote liquide dans un récipient spécifique. Porter des lunettes de protection et des gants de sécurité qui s’imposent.
  7. Par la suite, centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec soin par pipetage.
  8. Homogénéiser les cellules dans 5 mL de tampon de lyse commercialement disponible 2 par pipetage de haut en bas et incuber pendant 10 min sur glace et en agitant. Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C, puis retirez le surnageant avec soin par pipetage.
  9. Resuspendre le culot dans 500 µL (cellules Jurkat) ou 140 µL (échantillons de patients) de cisaillement tampon 1 contenant 1 x inhibiteur de la protéase (5 µL ou 1,4 µL, respectivement) et incuber le mélange pendant 10 min sur la glace.
  10. Pour la tonte de la chromatine, transférer 140 µL de la suspension de cellules de l’étape 3,9 dans des tubes de sonicateur (éviter les bulles d’air et répéter cette étape si nécessaire en raison du volume de l’échantillon). Placer les tubes dans le sonicateur-ultra ciblée à une température de 7 ° C et de cisaillement pendant 10 min (lignée cellulaire) ou 7,5 min (échantillons de patients) avec une puissance incidente de 9.375 W pour obtenir des fragments d’ADN bp 200-500.
  11. Enfin, centrifuger à 15700 x g pendant 10 min à 4 ° C dans la petite centrifugeuse et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  12. Pour tester les tailles appropriées fragment, analyser 20 µL de la chromatine cisaillée par électrophorèse en gel d’agarose TBE à 1,5 %. Une image exemplaire de la chromatine cisaillée de cellules Jurkat de bonne et de mauvaise qualité est illustrée à la Figure 3. À ce stade, le protocole peut être potentiellement suspendu. La chromatine cisaillée doit être conservée à-80 ° C.

4. immunoprécipitation de la chromatine

Remarque : L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée avec un kit puce commercialement disponible selon les instructions du fabricant avec modifications7.

  1. Calculer le nombre d’immunoprécipitation (70 µL (cellules Jurkat) ou 15 µL (échantillons de patients) de la chromatine cisaillée plus un anticorps) et préparer 20 µL de perles A enduit protéique par précipitation dans un tube de 1,5 mL. Laver les perles dans 40 µL de 1 x puce mémoire tampon 1 par précipitation de pipetage de haut en bas, laissez les billes reposent dans une grille magnétique pour 1 min et retirer le surnageant de pipetage. Effectuez cette étape quatre fois au total. Par la suite, remettre en suspension les perles dans le volume original avec tampon de puce 1 x 1.
  2. Pour l’immunoprécipitation elle-même, utilisez 10 µg de l’anticorps αNFAT2 (7 a 6) pour capturer NFAT2 avec ses séquences de cible lié. Utiliser 2,5 µg d’un anticorps de type IgG de lapin (DA1E) comme un contrôle des IgG. Préparer les réactions en tubes fraîches 1,5 mL comme indiqué dans le tableau 1.
    Remarque : Il est important d’utiliser un anticorps monoclonal avec une haute affinité dont épitope n’est pas masqué durant la fixation de ce protocole. Des anticorps polyclonaux introduisent un niveau supplémentaire de variation rendant beaucoup plus difficile d’interpréter correctement les résultats acquis.
  3. Incuber le mélange de l’étape 4.2 toute la nuit à 4 ° C sur une roue rotative à 6 tr/min.
  4. Sur la prochaine journée tourner les tubes pendant 5 s au x 7 000 g dans la petite centrifugeuse, les incuber dans un rack magnétique pendant 1 min et retirer le surnageant par aspiration. Laver les billes une fois avec chacune des tampons lavage 1, 2, 3 et 4 consécutivement.
  5. Pour ce faire, remettre en suspension les perles dans 350 µL de tampon de lavage et les incuber pendant 5 min à 4 ° C sur une roue rotative à 6 tr/min.
  6. Par la suite, faire tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse. Ensuite, les placer pendant 1 min dans une grille magnétique, éliminer le surnageant et ajouter le tampon de lavage suivant.
  7. Après le dernier lavage, éliminer le surnageant par pipetage, prendre les perles dans 100 µL de tampon d’élution 1 et les incuber 30 min sur une roue rotative à 6 tr/min.
  8. Faites tourner les tubes peu (5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse) et placez-les dans une grille magnétique pendant 1 min.
  9. Ensuite, transférer le surnageant en pipettant également, dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter 4 µL de tampon d’élution 2.
  10. Pour créer le contrôle d’entrée, mélanger 1 µL de la chromatine cisaillée avec 99 µL d’élution tampon 1 et 4 µL de tampon d’élution 2 (dans cette configuration, il y a trois tubes par patient : une entrée de contrôle, un contrôle des IgG et un échantillon de αNFAT2).
  11. Incuber les échantillons pendant 4 heures à 65 ° C et 1300 tr/min dans un shaker de tube de 1,5 mL. Ajouter 100 µL de 100 % isopropanol, vortex et un essorage les échantillons pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse.
  12. Remettre en suspension les billes magnétiques disponibles au fond de Vortex, ajouter 10 µL des perles à chaque échantillon et incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une roue rotative à 6 tr/min.
  13. Après l’incubation, tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifuger et placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique. Retirez le surnageant par aspiration.
  14. Remettre en suspension les perles dans 100 µL de tampon de lavage 1. Il faut inverser les tubes pour mélanger et laisser incuber 5 min à température ambiante sur une roue rotative à 6 tr/min.
  15. Faites tourner les tubes pendant 5 s au x 7000 g dans la petite centrifugeuse, placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique et éliminer le surnageant de pipetage. Répétez les étapes 4.13-4.14 avec tampon de lavage 2.
  16. Par la suite, retirer le tampon de lavage par aspiration, remettre en suspension les perles dans 55 µL de tampon d’élution et incuber pendant 15 min à température ambiante sur la roue en rotation à 6 tr/min pour éluer l’ADN précipité. Enfin, faites tourner les tubes pendant 5 s au x 7000 g dans la petite centrifugeuse, placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique et transvaser le surnageant dans nouveaux tubes de 1,5 mL.
    NOTE : Ici le protocole peut être potentiellement suspendu. L’ADN éluée doit ensuite être conservé à-20 ° C.

5. détection de gènes cibles NFAT dans les cellules CLL.

  1. Mener la réaction qRT-PCR en double pour chaque échantillon, comme indiqué dans le tableau 2.
    Remarque : Pour la détection des gènes cibles un Real-time PCR quantitative (qRT-PCR) est pratiquée au moyen d’un mélange de qRT-PCR disponibles dans le commerce avec un appareil de PCR en temps réel.
  2. Plaques 96 puits réaction d’utilisation blanc pour les réactions et l’instrument de RT-PCR. Les conditions de cyclisme sont comme suit : 95 ° C pendant 30 s, [95 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 30 s] x 40 cycles.
    Remarque : Une dilution en série de l’entrée (pur ou dilué 01:10, 1/100 et 1/1000 dans de l’eau exempte de nucléase) sert à calculer l’enrichissement relatif. Dans les cellules Jurkat, IL-2 a été utilisé comme un contrôle positif de32. CD40L, un objectif bien connu de NFAT2 dans les cellules de B, a été utilisé comme témoin positif dans les cellules CLL et LCK à titre d’exemple pour un gène de la nouvelle cible de NFAT2 en CLL33,,34. Les amorces pour la région du promoteur CD40L, l’il-2 et LCK sont décrites dans le tableau des réactifs spécifiques et du matériel.

6. normalisation et analyse des données

Remarque : L’enrichissement relatif pour les régions promotrices des intérêts (IL-2, CD40L ou LCK) est calculé en utilisant le contrôle des IgG normalisation.

  1. Tout d’abord, déterminer des valeurs de Ct (cycle seuil) pour la dilution en série d’entrée, IL-2, CD40L et la région du promoteur LCK via le logiciel d’évaluation de données qRT-PCR.
  2. Définir une courbe d’étalonnage pour les concentrations par l’intermédiaire de la dilution en série de l’entrée. Avec cette courbe d’étalonnage, calculer la concentration de l' IL-2, CD40L et la région du promoteur LCK chaque duplicata de chaque échantillon.
  3. Puis, calculez la moyenne des doublons. Ensuite, définissez l’échantillon d’immunoprécipitation IgG comme référence. Qualifier l’enrichissement relatif à cet exemple 1.0 et comparer l’autre échantillon (à partir de l’immunoprécipitation de la NFAT2) à cette référence.
  4. Enfin, calculer l’enrichissement relatif en divisant la concentration des échantillons par la concentration de la référence d’IgG.

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Representative Results

La figure 1 montre une analyse en cytométrie en flux exemplaire d’un patient CLL effectué après le marquage avec des anticorps CD19-FITC et CD5-PE. Figure 1 a montre le blocage des lymphocytes, représentant la majorité des cellules dans le sang des patients atteints de LLC. Figure 1 b montre la proportion de CD19+/CD5+ CLL cellules, qui représentent 89.03 % des lymphocytes dans cet exemple. La proportion de CD19+/CD5 B cellules est 3,72 % chez le patient respectif.

Figure 2 montre des exemples de performances d’anticorps dans les cellules Jurkat fixées pour différentes périodes tel qu’évalué par SDS-PAGE et Western Blot. Types d’anticorps provenant de fabricants différents ont été analysés. Figure 2 a montre la performance de le αNFAT2-anticorps (clone 7 a 6) provenant de fabricants différents détectés avec l’anticorps anti-souris vert fluorescent. L’anticorps du fabricant 1 a montré contraignant à l’épitope sans fixation (tranche A) et même quand les cellules Jurkat ont été résolus pour 2,5 ou 5 min (bande B ou C, respectivement). Le αNFAT2-anticorps (clone 7 a 6) fabricant 2, en revanche, a montré une performance plus faible, ne pas même dans les cellules Jurkat fixe (groupe D). Lors de la fixation, l’anticorps de ce fabricant a obtenu des résultats encore plus faibles (tranches E (2,5 min fixation) et F (fixation de 5 min)). Figure 2 b montre la performance de le αNFAT2-anticorps (clone D15F1) d’un autre fabricant détecté avec un anticorps de anti-lapin fluorescent rouge. Cet anticorps effectué également faiblement dans les échantillons non fixées (tranche A) et l’absence d’une bande indique le masquage de l’épitope de la fixation (tranches B (2,5 min fixation) et C (5 min fixation)).

Figure 3 montre des exemples de chromatine cisaillée de cellules Jurkat obtenus après que différentes de fixation et le cisaillement fois de bonne et de mauvaise qualité, tel qu’évalué par électrophorèse sur gel. Tranches A et B (0 min fixation ou fixation 2,5 min, respectivement) Voir la bonne qualité cisaillé la chromatine, qui se caractérise par une taille de fragment d’ADN de 200-500 PB qui peut être détectées sur gel d’agarose comme un frottis typique. Cisaillé la chromatine de mauvaise qualité, en revanche, se distingue par l’absence presque complète ou complète d’un frottis d’ADN attendu (bande C) ainsi qu’un frottis dans un plus grand ou plus petit que la gamme de taille de fragment attendus (bandes de D-F). L’absence totale d’un frottis indique l’utilisation de quantités insuffisantes de matière première. La détection de l’ADN de plus petit fragments de conseils à excessive ADN cisaillement (bande E) tout en plus grand soupçon de fragments ADN cisaillement insuffisante.

La figure 4 montre les résultats d’une expérience typique avec des cellules Jurkat. LCK a été analysée comme une cible potentielle de la NFAT2. IL-2 qui est un gène cible bien défini de NFAT2 dans les cellules T a été utilisée comme témoin positif. Un anticorps IgG-control a été utilisé pour la normalisation. Figure 4 a montre une expérience avec des résultats optimaux, documentées par un enrichissement significatif du contrôle positif IL-2 . De cette expérience, on peut conclure qu’il y a un enrichissement significatif de LCK séquences de l’ADN précipité démontrant que LCK est une cible directe de NFAT2 dans les cellules Jurkat. Figure 4 b montre une expérience effectuée avec mauvaise qualité ADN par manque de fixation ou une procédure de cisaillement sous-optimale provoquant un faible degré d’enrichissement dans le contrôle positif de IL-2 .

La figure 5 montre les résultats d’une expérience effectuée avec des cellules humaines primaires de CLL. CD40L qui est une cible de NFAT2 connue dans les cellules de B a été contrôle positif et LCK a été analysée comme la cible expérimentale. Figure 5 a montre une expérience avec un niveau d’enrichissement du CD40L ADN considérable dans le contrôle positif. L’enrichissement LCK ADN encore plus forte, on pourrait conclure que LCK est également une cible directe de NFAT2 dans les cellules humaines primaires de CLL. Figure 5 b montre une expérience effectuée avec mauvaise qualité ADN très probablement en raison de l’insuffisante de cisaillement. Aucun enrichissement substantiel de CD40L ADN ne pu être détectée dans le contrôle positif rendu les données expérimentales dénuée de sens.

Figure 1
Figure 1 : exemplaire Flow cytometry analyse de patients atteints de LLC. (a) des échantillons de patients atteints de LLC ont été analysés par cytométrie en flux après coloration avec CD19-FITC et CD5-PE des anticorps et les lymphocytes ont été bloquées. (b) par la suite, la proportion de CD19+/CD5+ CLL cellules et CD19+/CD5 B cellules ont été déterminées. Ici, CD19+/CD5+ CLL cellules 89.03 % de lymphocytes, tandis que CD19+/CD5 B cellules représentent 3,72 % de lymphocytes. Un patient exemplaire est indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : exemples de performance d’anticorps dans les cellules Jurkat fixes évalué par SDS-PAGE et Western-Blot. (a) les cellules Jurkat ont été résolus pour 0 min (groupes A et D), 2,5 min (groupes B et E), ou 5 min (C et F) et les anticorps αNFAT2 (clone 7 a 6) provenant de différents fabricants (bandes de A-C = fabricant 1, bandes D-F = fabricant 2) a été comparé. L’anticorps du fabricant 1 a montré une meilleure performance globale, liaison avec l’affinité plus élevée même pour les échantillons fixes (comparer les bandes A-C et bandes D-F). (b) le αNFAT2-anticorps (clone D15F1) d’un fabricant différent a été utilisé. Cet anticorps a montré seulement une mauvaise performance dans les échantillons non fixées (tranche A) et l’épitope a été masqué lors de la fixation. Par conséquent, aucune liaison de l’anticorps ne pourrait être détectée après fixation (tranches B et C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : exemples de la chromatine de bonne et mauvaise qualité de cisaillement des cellules Jurkat évaluées par électrophorèse sur gel. Les cellules Jurkat ont été fixés et cisaillés pour différentes périodes. La fixation a été fait pour 0 min (groupes A et D), 2,5 min (groupes B et E), ou 5 min (C et F). Cisaillement a été effectué pendant 10 min (groupes A-C) ou 20 min (bandes de D-F). La chromatine de cisaillement de bonne qualité se caractérise par une taille de fragment d’ADN de 200-500 PB qui peut être détectés comme un frottis dans la région respective (tranches A et B). La chromatine de mauvaise qualité peut être reconnue que soit par une absence presque complète ou complète de l’ADN de diffamation en raison de la quantité de matériel utilisé (bande C) de départ ou par un frottis dans une taille plus petite ou plus grande région en raison inappropriée (cisaillement) conditions bandes de D-F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : puce de cellules Jurkat évalué par qRT-PCR. (a) NFAT2 se lie à LCK et le promoteur de la IL-2 dans les cellules Jurkat. L’enrichissement relatif des régions promotrices LCK et IL-2 précipité avec l’anticorps NFAT2 est montré tel qu’analysé par qRT-PCR. Trois expériences de puce indépendantes sont montrées comme moyenne ± SEM (test t de Student, * P < 0,05 ; ** P < 0,01 *** P < 0,001). (b) l’ADN provenant d’échantillons avec mauvaise qualité cisaillée la chromatine a été utilisé. Aucune liaison pertinente de NFAT2 aux séquences cibles ne puisse être détecté. Un tableau similaire peut être détecté si il n’y avait aucune fixation ou le temps d’incubation avec l’anticorps NFAT2 était insuffisant. Trois expériences de puce indépendantes sont montrées comme moyenne ± SEM (test t de Student, * P < 0,05 ; ** P < 0,01 *** P < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : puce de cellules humaines primaires de CLL évalué par qRT-PCR. (a) NFAT2 se lie spécifiquement aux promoteurs LCK et CD40L dans des cellules humaines primaires de CLL provenant de patients avec une lente évolution de la maladie. Le diagramme montre l’enrichissement relatif des régions promotrices LCK et CD40L précipité avec l’anticorps NFAT2 tel qu’analysé par qRT-PCR. Trois expériences de puce indépendantes sont montrées comme moyenne ± SEM (test t de Student, * P < 0,05 ; ** P < 0,01 *** P < 0,001). (b) l’ADN d’échantillons de patients avec mauvaise qualité cisaillée la chromatine a été utilisé. Aucune liaison de NFAT2 aux séquences cibles respectifs a ne pu être observée. Trois expériences de puce indépendantes sont montrées comme moyenne ± SEM (test t de Student, * P < 0,05 ; ** P < 0,01 *** P < 0,001) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

ordre du jour volume (µL) par IP
5 % DE BSA 6
100 x inhibiteur de protéase 3
5 x tampon puce 1 56
chromatine cisaillée x (15 µL ou 70 µL)
Protéine A enduit des billes magnétiques 20
Puce seq eau de qualité 185-x-y
anticorps (IgG-contrôle ou αNFAT2) y (1,09 µL ou 1 µL)
total 270

Tableau 1 : calendrier de pipetage l’immunoprécipitation de la chromatine. L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée en préparant les réactions comme indiqué dans le tableau.

ordre du jour volume (µL) par qRT-PCR
immunoprécipitée ADN 9
qRT-PCR Mix 10
Primer avant (LCK/CD40L/IL-2) 0,5
apprêt inverse (LCK/CD40L/IL-2) 0,5
total 20

Tableau 2 : calendrier de pipetage le qRT-PCR. Le qRT-PCR a été réalisée en préparant les réactions comme indiqué dans le tableau.

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Discussion

Les étapes cruciales d’effectuer une analyse réussie de la puce sont la sélection d’un anticorps approprié et l’optimisation de la chromatine processus25de cisaillement. La sélection de l’anticorps αNFAT2 s’est avérée particulièrement difficile lors de l’élaboration du présent protocole. Bien qu’il existe plusieurs anticorps αNFAT2 disponibles dans le commerce et la majorité de ces oeuvres fines pour éponger occidental et d’autres applications, clone 7 a 6 a été le seul anticorps qui pourraient être utilisées avec succès pour puce7. Même soi-disant identiques 7 a 6 anticorps provenant de fabricants différents ont montré des différences significatives en ce qui concerne leurs performances dans la puce. Un défi majeur est la perturbation potentielle des épitopes des protéines cibles par le procédé de fixation utilisé dans les protocoles de XChIP25.

La chromatine procédure de cisaillement est également essentielle pour l’obtention des résultats appropriés au XChIP. Une taille de fragment de 200-500 PB tel qu’évalué par électrophorèse sur gel d’agarose s’est avérée pour être optimale dans cette puce NFAT2 protocole no7. Mauvaises conditions cisaillement, ce qui entraîne une pénurie de l’ADN à partir de matériel ou fragments d’ADN de taille plus petite ou plue généralement conduisent à des résultats sous-optimaux lorsque vous effectuez ce test. Cisaillement sous-optimale observa aussi lorsque vous utilisez congelés et rethawed PBMC. c’est pourquoi, dégel des PBMC conduit à un rendement inférieur de l’ADN des cellules, mais aussi une augmentation excessive de cisaillement des fragments d’ADN.

La disponibilité d’une large variété de kits de puce et anticorps ChIP-grade est difficile, mais offre également la possibilité d’utiliser la technique dans un contexte large. Ainsi, une diversité de facteurs de transcription peut être étudiée dans différents types de cellules. Par exemple, les autres membres de la famille NFAT (NFAT1 et NFAT4) ont été étudiées récemment à l’aide de puce35,36,37.

Le kit de la puce utilisé ici devait aussi être modifié en fonction de nos besoins. Tout d’abord, le temps de fixation a été ajusté pour éviter le masquage de l’épitope reconnu par l’anticorps utilisé et permettre une tonte optimale. Le volume des tampons utilisés pour la lyse et le cisaillement a également été modifié pour réduire la perte de cellules au cours des étapes de lavage différents. En outre, les conditions de cisaillement ont été optimisées pour obtenir des fragments d’ADN de l’ordre de 200-500 PB. L’inhibiteur de la protéase et les anticorps IgG-témoins ont été échangées avec d’autres réactifs disponibles dans le commerce comme ils ont prouvé à être comparable et plus rentable. L’étape impliquant le transporteur fourni par le fabricant a été omise car il a interféré avec la précipitation de l’ADN. En fin de compte, la quantité de mémoire tampon utilisée pour éluer l’ADN a été adaptée pour produire un volume suffisant pour être utilisé dans le qRT-PCR.

Il y a plusieurs autres kits disponibles provenant de diverses entreprises et il y a aussi la possibilité d’effectuer la puce sans un kit. Cependant, essais et mise en place sont très difficiles, qu’il sont a plusieurs facteurs à considérer, comme la compatibilité des protéines et des cellules analysées avec différentes de fixation et le cisaillement des méthodes. Le kit mentionné a été utilisé tel qu’il était bien établie dans notre laboratoire.

Une restriction majeure de cette méthode est son applicabilité limitée aux enquêtes à grande échelle dans les organismes modèles intact parce que les anticorps appropriés doivent être identifiés ou généré pour chaque facteur de transcription individuels. L’analyse des gènes qui sont exprimés uniquement à des niveaux faibles, dans un petit nombre de cellules ou pendant une fenêtre de temps restreint peut aussi être difficile à l’aide de la puce.

Alors que la puce est l’étalon-or pour démontrer une interaction directe d’un facteur de transcription donnée avec ses gènes cibles respectifs dans les cellules eucaryotes intactes25, il y a un certain nombre d’autres techniques pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN . L’AESM est une méthode utile pour détecter les protéines de liaison faible abondance ADN dans la cellule lystates24. Il peut également être utilisé pour caractériser l’affinité de liaison d’une protéine particulière grâce à une analyse mutationnelle de sonde ADN systématique. Un avantage majeur de l’AESM en comparaison de la puce est le fait qu’il est généralement beaucoup moins de temps pour établir le dosage respectif. Dosages d’ADN déroulant, microplaque capture et tests de détection et dosages de journaliste sont d’autres techniques pour analyser les interactions de protéine-ADN23.

Développements plus récents ont permis d’appliquer l’analyse de puce aux approches du génome par sa combinaison avec microréseau technologie (ChIP-on-chip)38,39,40 ou séquençage de prochaine génération (ChIP-Seq ),du4142,43.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la DFG accorder MU 3340/1-1 et la Deutsche Krebshilfe accordent 111134 (tous deux attribués à M.R.M.). Nous remercions Elke Malenke excellente assistance technique).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5 BD Biosciences 555353 Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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References

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