Separando as bactérias por cápsula quantidade usando um gradiente descontínuo de densidade

Genetics
 

Summary

Vamos mostrar o uso de gradientes de densidade descontínuo para separar populações bacterianas baseadas na produção da cápsula. Este método é usado para comparar a quantidade de cápsulas entre culturas, isolar os mutantes com um fenótipo específico da cápsula, ou para identificar os órgãos reguladores da cápsula. Aqui descrito é a otimização e a execução do ensaio.

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Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).

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Abstract

A cápsula é um factor de virulência chave em muitas espécies bacterianas, mediação de evasão imune e resistência a várias tensões físicas. Enquanto muitos métodos estão disponíveis para quantificar e comparar a produção da cápsula entre diferentes cepas ou mutantes, não há nenhum método amplamente usado para classificar bactérias com base na cápsula do quanto que eles produzem. Nós desenvolvemos um método para separar as bactérias por cápsula quantidade, usando um gradiente descontínuo de densidade. Este método é usado para comparar valores cápsula semi-quantitativamente entre culturas, para isolar os mutantes com produção de cápsula alterado e para purificar bactérias capsuladas de amostras complexas. Esse método também pode ser acoplado a sequenciação de transposon-inserção para identificar genes envolvidos no Regulamento da cápsula. Aqui, o método é demonstrado detalhadamente, inclusive como otimizar as condições de gradientes de uma nova espécie bacteriana ou estirpe e como construir e executar o gradiente de densidade.

Introduction

Muitas espécies bacterianas produzem uma cápsula de polissacarídeo, que protege a célula bacteriana de várias tensões físicas e de reconhecimento e matar pelo sistema imunológico. Em Klebsiella pneumoniae, produção da cápsula é uma exigência absoluta de infecção1,2. Cápsula de K. pneumoniae Medeia resistência de peptídeos antimicrobianos, resistência à morte mediada por complemento, prevenção da fagocitose e supressão da resposta imune inata3. Excesso de produção da cápsula está associado com aumento da virulência e infecções adquirida na Comunidade (ao invés de nosocomiais)4.

Uma variedade de testes quantitativos e qualitativos estão disponíveis para investigar a produção da cápsula. Para espécies de Klebsiella , estes incluem a sequência teste5, no qual um palito tocou para uma colônia é puxado para cima e o comprimento da sequência de caracteres produzido medido e o mucoviscosity do ensaio6, que envolve a centrifugação lenta de uma cultura seguida pela medição da densidade óptica do líquido sobrenadante. Esses métodos são simples e rápidos, mas falta sensibilidade quando usado na clássica Klebsiella cepas ao invés de cápsula cepas de sobreprodução. Outro método de quantificação da cápsula é o ensaio de Ácido urónico, que é tecnicamente desafiador e requer o uso de ácido sulfúrico concentrado1. Finalmente, a cápsula é visível diretamente pela microscopia (figura 1A). Esses métodos, apenas microscopia permite ao usuário observar Estados capsulatum diferentes dentro de uma única população, e nenhum desses métodos permite a separação física de bactérias capsuladas e não capsuladas.

Separações com base em densidade por centrifugação gradiente são usadas rotineiramente em biologia celular para purificar a célula eucariótica diferentes tipos7, mas raramente são utilizadas na investigação microbiológica. O ensaio de mucoviscosity para Klebsiella baseia-se na observação de que as bactérias capsuladas altamente demoram mais tempo a pelota por centrifugação, e nós raciocinou que isto pode ser devido a reduzida densidade total de células capsuladas. O método mostrado aqui foi desenvolvido para separar populações de K. pneumoniae fisicamente pelo montante da cápsula, usando centrifugação gradiente de densidade (Figura 1). Esse método foi aplicado com sucesso a Streptococcus pneumoniae, indicando que é aplicável a outras espécies bacterianas. Separação de gradiente de densidade de uma biblioteca de mutante transposon saturada juntamente com sequenciamento de transposon-inserção (densidade-TraDISort) tem sido utilizado para identificar os genes envolvidos na produção e regulação da cápsula8. Da mesma forma, este método foi usado em conjunto com aleatório-prime cadeia da polimerase (PCR) de colônias individuais para isolar não-capsuladas K. pneumoniae mutantes. Esse método também pode ser usado para comparações rápidas da produção da cápsula entre as populações diferentes e condições, ou para purificar bactérias capsuladas de amostras complexas (figura 1B). Finalmente, há a opção para ensaiar outros fenótipos que afetam a densidade, tais como o tamanho da célula ou agregação.

Este manuscrito demonstra como otimizar o processo para uma nova espécie bacteriana ou estirpe e demonstra a construção e exploração de um gradiente descontínuo de densidade para separar bactérias capsuladas-hiper, capsuladas e não capsuladas.

Protocol

Nota: Certifique-se de que quaisquer avaliações de risco aplicáveis para as cepas bacterianas são seguidas quando cultivo e manipulação de amostras. Esteja ciente de que a criação de uma só vez gradientes demais pode levar a perturbações músculo-esqueléticas devido à pressão nas articulações da pipetagem lento envolvidas. Plano de trabalho e tomar precauções para evitar ferimentos.

1. preparação de estirpes bacterianas ou bibliotecas mutantes

  1. Raia para fora as tensões de ser testado em placas de ágar apropriado. Estas são placas de estoque para o experimento.
    1. Incube as placas durante a noite na temperatura desejada para atingir o única colônias. Para este experimento,, cultura K. pneumoniae (cepas NTUH-K2044 e ATCC43816) em ágar de caldo (LB) de Luria a 37 ° C e S. pneumoniae (23F selvagem tipo e 23F Δcps) em gelose de sangue em uma jarra de vela umidificado a 37 ° C.
  2. Escolha uma única colônia de uma placa de estoque (etapa 1.1) para inocular 10 mL de caldo apropriado usando um loop estéril ou palito de cocktail. Para a seleção das bibliotecas mutantes aleatórias, inocule o caldo com 10 µ l do estoque da biblioteca mutante aleatório (TraDIS biblioteca).
    1. Incubar as cepas de K. pneumoniae em baixo sal LB mídia a 37 ° C, com agitação e cepas de S. pneumoniae em meio cérebro coração (BHI) de infusão, estaticamente a 37 ° C.
    2. Transferi a cultura durante a noite para um tubo de 15 mL e centrifugar em uma centrífuga de bancada para 10 min a 3.200 x g em andamento fora baldes com inserções de tubo de 15 mL e tampas apertadas de aerossol.
    3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x.
      Nota: Descarte do sobrenadante através a rota resíduos biológica líquida apropriada no laboratório. O propósito das etapas de centrifugação e ressuspensão (1.2.2 e 1.2.3) é a concentração de bactérias para fácil visualização do gradiente. Culturas bacterianas podem ser carregadas diretamente sobre o gradiente se preferirem. Fortemente capsuladas cepas não podem formar um pellet apertado. Se isso ocorrer, remover o sobrenadante tanto quanto possível sem remover quaisquer células bacterianas, adicionar um volume final de 5 mL 1X PBS e resuspenda o pellet. Continue o protocolo com passo 1.2.5.
    4. Para as cepas não-mucoides, vá para a etapa 2.
    5. Os tubos de centrifuga, conforme descrito na etapa 1.2.2.
    6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2 mL de 1X PBS. As células estão agora prontas para usar.
      Nota: A densidade da suspensão de células bacterianas não é crítica, mas deve ser suficiente para visualização no gradiente. Um mínimo de OD600 (densidade óptica em 600 nm) de 4 é sugerido.

2. preparação de diluições de gradientes e gradiente mini teste

  1. Prepare diluições gradientes.
    Nota: Concentrações exatas de médio gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) necessárias as gradientes de densidade para alcançar boa separação serão diferente dependendo das condições de crescimento e estirpe bacterianas usadas. Mini gradiente testes são realizados em primeiro lugar, para identificar as concentrações que darão a melhor separação. Estas incluem a 500 µ l de uma única diluição em um tubo de 2 mL. Se as bactérias serão extraídas o gradiente e repicagem para aplicações a jusante, estas etapas devem ser executadas sob condições assépticas.
    1. Combine o médio gradiente de densidade com 1X PBS para fazer as diluições de gradiente de densidade. Faça diluições de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% e 80% (por exemplo,, 2 mL de densidade gradiente médio mais 8 mL de 1X PBS = 10 mL de 20% médio gradiente de densidade).
    2. Alíquota 500 µ l da diluição de gradiente de 20% em um tubo de 2 mL para cada tensão a ser testado (por exemplo,, 4 estirpes = 4 tubos contendo 500 µ l da diluição de gradiente de 20%).
    3. Repita a etapa 2.1.2 para o resto de diluições do gradientes.
  2. Aplicam-se as bactérias para o gradiente.
    1. Aplicam-se 100 µ l de células bacterianas, preparado em passos 1.2.3 e 1.2.6 a parte superior de cada diluição gradiente seguindo os passos abaixo.
      1. Ocupam-se 100 µ l de células usando uma pipeta de 200 µ l e coloque a ponta da pipeta no lado do tubo logo abaixo do menisco do gradiente mini.
      2. Aspire as células bacterianas em gradiente extremamente lentamente, para que eles formam uma camada na parte superior do gradiente, sem qualquer mistura de interface.
      3. Repita os passos 2.2.1.1–2.2.1.2 para todas as estirpes a ser testado.
    2. Usando um rotor de ângulo fixo com tampa um aerossol, centrifuga os tubos preparados numa microcentrifuga por 10 min a 8.000 x g.
    3. Após a centrifugação, transferi os tubos a uma cremalheira para visualizar a diluição de gradiente mínima necessária para manter células apenas acima da camada gradient após centrifugação.
    4. Se os resultados não são claros, repita o teste gradiente mini com incrementos de 5% de densidade gradiente médio as diluições acima e abaixo as concentrações definidas no passo 2.1.1 (por exemplo,, 25% e 35% diluições devem ser testadas se o resultado em 30% é ambíguo).
      Nota: Ver Figura 2para resultados típicos numa diluição médio gradiente de densidade simples .
    5. Use os resultados de 2.2.3–2.2.4 passos para determinar as diluições gradientes ideais para usar para separar as células em gradientes descontínuos de larga escala.

3. preparação de células para o experimento principal

  1. Prepare-se fresco durante a noite culturas inocular 10 mL de caldo apropriado conforme descrito na etapa 1.2.
    1. Incube as culturas durante a noite, em condições apropriadas, conforme descrito na etapa 1.2.1.
    2. Pelota a cultura durante a noite, conforme descrito na etapa 1.2.2.
  2. Lave as células conforme descrito na etapa 1.2.3.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de 1X PBS. Se a tensão não pelota facilmente e é mucoides, resuspenda o pellet em até 2 mL de PBS ou mídia residual. As células estão agora prontas para usar.

4. preparação de gradientes de densidade descontínuos

Nota: Um método alternativo de preparação gradiente de fundo (concentrado) ao topo (menos concentrada) utilizando uma pipeta é descrito na etapa 7.

  1. Pipetar 1 mL da diluição de gradiente de densidade mais diluída em um polipropileno de 5 mL redondo tubo inferior para formar a camada superior, mais diluída, do gradiente.
    Nota:
    camadas subsequentes de diluições de gradientes mais concentradas serão adicionadas abaixo desta camada usando uma agulha, para não perturbar as camadas. Um mínimo de dois e máximo de três camadas de gradientes de 1ml cada são recomendados para separação robusta e fácil visualização de bactérias.
    1. Usando uma seringa descartável 1 mL com agulha de 1,5 polegadas, tome a próximo mais concentrado densidade gradiente médio diluição para a seringa de 1 mL. Evite tomar qualquer ar, como bolhas podem prejudicar as camadas de gradientes.
    2. Coloque a extremidade da agulha na parte inferior do tubo que contém a primeira camada. Aspire o conteúdo da seringa lentamente para evitar misturar a interface.
      Nota: A interface de duas diluições se levantará como a diluição mais concentrada de gradiente é adicionada. Observe a interface, segurando-o até a luz ou uma janela exterior. Não se for observada nenhuma interface distinta, descartar o gradiente e inicie novamente.
      1. Remova a agulha gradiente muito suavemente para não perturbar a interface entre as diferentes diluições de gradientes. Coloca o tubo em um rack adequado para mantê-lo ereto.
    3. Se usando três diferentes diluições, repita etapas 4.1.1–4.1.2.1, assim a diluição mais densa na parte inferior. Se a gradiente tiver sido construído com sucesso, haverá três camadas distintas com nenhuma mistura com as interfaces.

5. adicionando células preparadas para gradientes e separação por centrifugação

  1. Adicione 600 µ l de células preparadas da etapa 3.3 na parte superior do gradiente no tubo muito lentamente e sem misturar a interface, conforme descrito no passo 2.2.
  2. Coloque os tubos em adaptadores de tubo e pesar o combinado adaptadores e tubos para garantir que eles são equilibrados.
    1. Coloque os adaptadores de tubo em um rotor de ângulo fixo dentro de uma centrífuga de bancada. Centrífuga para 30 min a 3.000 x g.
    2. Após a centrifugação, Retire cuidadosamente os tubos, colocá-los em um rack adequado e fotografar os resultados como um registro.
  3. Recuperar as frações bacterianas para quantificação de Ácido urónico ou extração de DNA, seguindo passo 6.
    1. Se aplicações a jusante não são necessárias, elimine as amostras/gradientes através a rota resíduos biológica líquida apropriada no laboratório.
      Nota: É importante validar a separação para novas espécies/cepas de bactérias. Frações individuais de gradiente devem ser examinadas por microscopia, por ensaio de Ácido urónico (etapa 8), ou outro ensaio quantitativo adequado para confirmar o fenótipo da cápsula de cada fração. Se o objectivo é separar com base na agregação ou tamanho da célula, independentes ensaios apropriados devem ser usados.

6. recuperação de frações de amostra e consequência opcional passo

  1. Recupere as frações de um gradiente, removendo e descartando qualquer tipo de líquido de diluição superior se não bacteriana fração está presente dentro dessa camada.
    1. Para remover a fração superior, usar uma pipeta P200 e delicadamente passe a ponta da pipeta através do gradiente para a fração e levar até a fração. Coloque a fração em um tubo de 1,5 mL e rotular apropriadamente.
    2. Para recuperar mais fracções, ainda usando a pipeta P200, inserir a ponta suavemente através do gradiente para a fração e recuperar a fração de um tubo 1,5 mL. Remova o excesso gradiente como as frações mais baixo gradiente são acessadas.
    3. Se extração de DNA de uma fração que contêm números de célula muito baixo é necessária (por exemplo, para densidade-TraDISort), subcultura a fração, seguindo o protocolo da etapa 6.2 por consequência opcional obter mais células.
      Nota: Vai haver um baixo nível de reporte de células na parte superior do gradiente em frações inferiores, como frações são removidas de cima para baixo. Minimizar esta trabalhando com cuidado para não misturar o gradiente, usando uma agulha para remover frações inferiores e através da realização de re-purificação de amostras muito baixa abundância onde reportes podem afetar os resultados.
  2. Células de transferência da baixo-abundância fracção recuperado em etapas 6.1.1–6.1.2 em 5 mL de meio líquido adequado. Coloque em uma incubadora e crescer durante 2 h a 37 ° C.
    1. Depois de 2h de crescimento ou em que a amostra atingiu uma OD600 de 1, transferi a cultura para um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo por 10 min a 3.200 x g em uma centrífuga com swing baldes e tampas apertadas de aerossol. Descartar o sobrenadante
    2. Ressuspender as células em 1 mL de 1X PBS.
  3. Prepare um gradiente novo single-concentração de densidade em um tubo de polipropileno de 5 mL. Use a gradiente concentração de logo acima a localização da fração no gradiente original (por exemplo, para a purificação do mutanteslyA Δ mostrado na Figura 2D, 15% médio gradiente de densidade seria usado).
    Nota:
    esta etapa de re-purificação é opcional.
    1. Aplicam-se as células à parte superior do gradiente e centrífuga, conforme descrito nas etapas 2.2 e 5.1.
    2. Retirar os tubos de centrífuga e coloc em uma cremalheira apropriada. Fotografar o gradiente e recuperar a fração para extração de DNA, conforme descrito em 6.1 – 6.1.2.
      Nota: A amostra está agora pronta para extração de DNA ou outras aplicações a jusante.

7. alternativo método para preparação de gradiente de fundo (concentrado) para cima (menos concentrada) usando uma pipeta

  1. Use as diluições gradientes determinadas na etapa 2.2.3. Usando uma pipeta de 1.000 µ l, adicione 1 mL da diluição gradiente mais densa para um tubo de 5 mL.
    1. Utilizando uma pipeta de 200 µ l, adicione 200 µ l da diluição gradiente densa próxima muito lentamente para o topo da camada no tubo, para não misturar a interface. Adicione outro 200 µ l e depois o final 600 µ l. adicionando vários volumes menores dá mais controle sobre a velocidade de pipetagem e impede a mistura da interface. Se a interface mistura, descartar e começar de novo.
    2. Repita a etapa 7.1.1 com a terceira, menos densa concentração de gradiente se três diluições estão sendo usadas. Agora, o tubo deve ter gradientes de 2ml ou 3 mL dependendo dos resultados da etapa 2.2.3.
    3. Vá para a etapa 5 do protocolo para adicionar células e continuar o experimento.

8. medida da quantidade de cápsulas por Ácido urónico ensaio

  1. Ajuste o OD600 de cada fração recuperada para 4.0 por diluição com PBS. Prossiga com a quantificação de ácidos urônicos como anteriormente publicados1.

Representative Results

Resultados representativos são mostrados na Figura 2. O resultado exato para esperar dependerá da espécie bacteriana, a afinação dos gradientes de densidade, e se o usuário está examinando uma cepa única ou um pool de mutantes. Maioria das cepas migrará para um único local dentro de um gradiente, como mostrado na Figura 2A e 2D. Aplicação do método em uma biblioteca de mutante bacteriana dará origem a uma grande banda acima de gradiente, uma banda menos densa, distribuído através da camada superior do gradiente e uma fração menor acapsular na parte inferior (Figura 2B). Estas frações diferem na quantidade de cápsula como mostrado por um ensaio para ácidos urônicos (Figura 2B). Sequenciamento de inserção Transposon de frações individuais resulta em clara localização dos mutantes específicos dentro de diferentes frações de gradientes, como mostrado para o locus de biossíntese da cápsula de ATCC43816 de K. pneumoniae (Figura 2C). Resultados representativos para culturas puras de K. pneumoniae NTUH-K2044 e S. pneumoniaee biossíntese de cápsulas diferente ou regulamentares mutantes, são mostrados na Figura 2,D.

Figure 1
Figura 1 : Esquemático do método de centrifugação de densidade para separar as bactérias com base na cápsula e suas aplicações. Célula do (A), uma imagem de microscopia eletrônica de um capsuladas Klebsiella pneumoniae . A cápsula é visível como uma camada densa do lado de fora da célula. (B) aplicações de centrifugação de densidade para o estudo das bactérias capsuladas. (Bi) Separação de densidade pode ser usada para gerar alta - baixa- e não-cápsula fracções de uma biblioteca de transposon mutant e seguida por sequenciamento de inserção transposon definir genes que influenciam a produção da cápsula. (Bii) Purificação de bactérias capsuladas de uma amostra complexa. (Bill) Uso de separação baseado em densidade para comparações rápidas de cápsula quantidade entre as amostras. Este método também permite a visualização da produção da cápsula heterogênea em populações bacterianas, como mostrado em (Biii). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Resultados representativos. (A) exemplo da saída de gradiente mini testes. Dois diferentes cepas de K. pneumoniae foram centrifugadas em 1 mL de meio gradiente de densidade de 15%. A estirpe NTUH-K2044 hypermucoviscous mantidos acima da camada Médio gradiente de densidade, enquanto ATCC43816 (que faz menos cápsula) migra para o fundo da camada. (Bi) Utilização de um gradiente de densidade para separar uma biblioteca mutante transposon em três fracções. Observe que a fração inferior contém uma baixa proporção de mutantes e não é visível nesta foto. (Bii) Validação de quantidades diferentes de cápsulas no topo, meio e frações de fundo usando um ensaio de ácidos urônicos. Células do fundo superior, médio e Superdimensonada frações foram isoladas e resuspended em PBS para uma OD600 de 4, então cápsula de polissacarídeos extraídos e ácidos urônicos medida1. (C) resultados de densidade-TraDISort exemplo. Locais de mutação identificadas são mostrados por linhas azuis acima o diagrama do cromossomo. Mutantes sem cápsula podem ser identificados como aquelas que estão presentes na biblioteca de entrada mas estão esgotadas na fração superior enquanto sendo enriquecido na fração inferior, como mostrado aqui para a biossíntese de cápsula locus8. (D) um exemplo do uso de centrifugação gradiente de densidade para comparar a quantidade de cápsulas entre tipo selvagem e mutantes cepas de K. pneumoniae NTUH-K2044 e S. pneumoniae 23F. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A cápsula é um factor de virulência importante em muitas espécies bacterianas incluindo K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, Acinetobacter10e Neisseria11 espécies. Embora existem vários métodos para quantificação e visualização de cápsulas bacterianas, neste momento, há nenhum método amplamente utilizado para separar fisicamente as células capsuladas e não capsuladas. Neste artigo, temos demonstrado um método robusto para separação baseada em cápsula de populações bacterianas, com múltiplas aplicações potenciais em conjunto com diferentes protocolos de upstream ou downstream.

A presença de uma cápsula de superfície pode reduzir a densidade de célula bacteriana, que permite a separação por centrifugação de gradiente de densidade (Figura 2D). Podemos ter validado esse método em K. pneumoniae NTUH-K204412 e ATCC4381613 , bem como em 23F de Streptococcus pneumoniae 14 e seu mutante decps Δ15. Esse método usa Percoll16 como o principal constituinte do gradiente de densidade, que é uma suspensão de partículas de sílica coloidal revestidas com baixa viscosidade e nenhuma toxicidade para bactérias - em princípio, outras substâncias que satisfazem estes critérios pode ser usado para estabelecer o gradiente de densidade.

Isso pode ser um desafio para garantir que camadas de densidade diferente não se misturam ao construir gradientes de densidade, e se mistura ocorrer, o método de separação não dará resultados limpos. Apresentamos a seguir dois métodos alternativos para despejar os gradientes, usando uma agulha ou uma pipeta — ambos são eficazes, e qual método usar é simplesmente uma questão de preferência. Para todas as etapas que envolvem a pipetagem de uma substância (uma suspensão bacteriana, ou uma camada de gradiente mais diluída) acima de uma camada de gradiente, pipetagem várias alíquotas de volumes menores pode tornar mais fácil para conseguir uma interface afiada sem qualquer mistura de camadas.

Uma limitação do presente protocolo é que seu desempenho com outras espécies bacterianas não pode ser garantido. Portanto, é fundamental ao examinar uma nova espécie bacteriana ou tensão para validar a separação baseada na densidade usando um método de quantificação da cápsula adicional, independente. Visualizando as bactérias presentes em cada fração pela microscopia com manchas de cápsula adequadas é um método confiável para os quais protocolos detalhados estão disponíveis17. Alternativamente, cápsulas contendo ácidos urônicos (tais como aqueles de Escherichia coli e K. pneumoniae) podem ser quantificadas por um ensaio específico, conforme mostrado na Figura 2B1. O teste de centrifugação-baseado mucoviscosity não é apropriado como um método de validação independente, como este ensaio também depende da densidade das células bacterianas.

Outra limitação desse método é que a produção da cápsula é muito sensível às condições de cultura e mesmo as pequenas alterações ao meio de crescimento, temperatura, ou aeração pode afetar os resultados deste teste. Para minimizar esse problema, pesquisadores podem usar um meio de crescimento definido ou um meio complexo consistente com o lote, manter todos os outros parâmetros de crescimento idênticas entre experiências e incluem estirpes de controlo adequadas para permitir a interpretação dos resultados inesperados . Algumas cápsulas bacterianas são frágeis e podem distorcer longe da célula quando culturas são pipetadas. Para evitar o corte de cápsulas, culturas devem ser centrifugadas e resuspended não mais que duas vezes durante a preparação para o carregamento do gradiente. Se a perda da cápsula durante a concentração das culturas permanece problemática, culturas bacterianas podem ser aplicadas a um gradiente de densidade diretamente, com um volume maior de suspensão bacteriana adicionado se necessário para visualização.

Futuras aplicações deste método são a aplicá-la a outras espécies bacterianas e usar esta separação em conjunto com diferentes tecnologias de upstream e downstream. Além da densidade-TraDISort8, sugerimos que separação gradiente de densidade de bactérias capsuladas poderia ser utilizada para isolamento de mutantes com cápsula alterada, para a purificação de células capsuladas de culturas mistas ou amostras complexas e para rápida criação de perfil de produção da cápsula em múltiplas variedades. Finalmente, esta tecnologia poderia ser usada para examinar outros fenótipos bacterianos como agregação.

Disclosures

Os autores têm sem interesses financeiros para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Wang Jin-cidade e Susannah Salter para fornecimento das estirpes e membros do grupo Parkhill para debates úteis. Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Sanger Wellcome (Wellcome grant 206194) e por uma bolsa de pós-doutorado de Sir Henry Wellcome para F.L.S. (concessão 106063/A/14/Z). M.J.D. é suportado por um Wellcome Sanger Institute PhD Studentship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2 mL tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1 mL disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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