Isolando a maligna e as células B não-maligna do lck:eGFP Zebrafish

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Summary

Zebrafish transgênicos lck:eGFP express GFP altamente em linfócitos T e têm sido usados para estudar o desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda. Esta linha pode ser usado para células de estudo B, que expressam lck em níveis inferiores. Este protocolo descreve a purificação das malignas e não-malignas de células B de lck:eGFP zebrafish.

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Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish. J. Vis. Exp. (144), e59191, doi:10.3791/59191 (2019).

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Abstract

Peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento de linfócitos. Como mamíferos, d. rerio possuem um sistema imune adaptativo que inclui linfócitos B e T. Estudos de zebrafish linfopoiese são difíceis porque os anticorpos reconhecendo d. rerio marcadores de superfície celular geralmente não estão disponíveis, complicando o isolamento e caracterização de populações de linfócitos diferentes, incluindo B-linhagem células. Linhas transgénicas com linhagem específicas fluoróforo expressão são frequentemente utilizadas para contornar esse desafio. A linha de transgênicos lck:eGFP tem sido usada para estudar o desenvolvimento de células T d. rerio e também tem sido utilizada para o modelo de desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Embora lck:eGFP peixe têm sido amplamente utilizados para analisar a linhagem T-, eles não foram usados para estudar as células B. Recentemente, descobrimos que muitos zebrafish B células também expressam lck, embora em níveis inferiores. Consequentemente, lck:eGFP B células da mesma forma expressam níveis baixos de GFP. Baseado nesta constatação, desenvolvemos um protocolo para purificar as células B-linhagem de lck:eGFP zebrafish, que relatamos aqui. Nosso método descreve como utilizar um classificador fluorescente-ativado da pilha (FACS) para purificar as células B de peixe lck:eGFP ou linhas relacionadas, tais como double-transgénicos, rag2:hMYC; lck:eGFP peixe. Nestas linhas, células B, as células B particularmente imaturas, GFP expresso em níveis baixos, mas detectáveis, permitindo que eles sejam distintos de células T, que expressam a GFP altamente. As células B podem ser isoladas da medula, timo, baço, sangue ou outros tecidos. Este protocolo fornece um novo método para purificar as células B d. rerio , permitindo estudos focados em temas como o desenvolvimento de células B e linfócitos B malignidades.

Introduction

Zebrafish oferecer atributos poderosos, como manipulability genética, alta fecundidade, translucidez óptico e desenvolvimento rápido que facilitam o desenvolvimento de vertebrados estudando usando abordagens genéticas. Estas vantagens, juntamente com os recursos compartilhados de teleósteos e mamíferos hematopoiese, fazem d. rerio ideal para análises in vivo da função linfopoiese e linfócitos, de sua aparência mais antiga em larvas em toda a idade adulta. Desenvolvimento de sangue no zebrafish assenta bem conservados processos genéticos que são compartilhados com mamíferos, e estes se prolongam para o sistema imune adaptativo. Além disso, os mecanismos moleculares que regem o desenvolvimento linfoide são notavelmente conservados entre zebrafish e mamíferos1.

Nas últimas 2 décadas, transgénicos d. rerio linhas que linhagens de sangue específico de rótulo e linhas mutantes deficientes nestas linhagens foram criadas2,3,4,5. Um destes, a lck:eGFP linha de transgénicos, usa o promotor zebrafish linfócito proteína tirosina quinase (lck) para direcionar a GFP expressão6. Este gene, que é altamente expressa por ambos precursores de T-linhagem e linfócitos T maduros, permite em vivo, monitoramento do desenvolvimento do timo de células T e ex vivo da purificação de células T-linhagem por FACS7. Anteriormente, usamos esta linha em uma tela de mutagénese ENU para diante-genética para identificar germline mutantes propensos a T-ALL e estudar adquiridas somaticamente genéticos eventos ligados à célula T mixomas8,9.

Recentemente, nosso laboratório alargado a utilidade do lck:eGFP zebrafish. Em duplo-transgênicos rag2:hMYC (MYC humana), lck:eGFP D. rerio que são conhecidos por desenvolver T-tudo 10, descobrimos que B-linhagem todos também ocorrem11. Ao contrário de T-tudo neste modelo, que fluorescem brilhantemente devido a alta expressão de GFP, B-ALL são palidamente fluorescentes devido aos baixos níveis GFP, permitindo peixe com B-tudo a ser distinguida grosseiramente aqueles com T-ALL por microscopia fluorescente. Esta expressão diferencial de GFP também permite a separação de GFPEis B-todas as células de GFPOi células T-ALL usando FACS11. Além disso, baixa lck expressão não é exclusivo do zebrafish B-ALL, como humanos B-ALL também expressam os baixos níveis de LCK11,12. Da mesma forma, as células normais de B-linhagem de d. rerio, camundongos e humanos também expressam níveis baixos de lck/Lck/LCK, com as células B imaturas, tendo a mais alta expressão11,13. Em uma base por célula, as células B-linhagem em linhas de zebrafish ou derivado de lckeGFP expressam 1-10% tanto GFP como linfócitos T. Estes GFPEis células expressa característica mRNAs de células B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze outros e podem ser purificado a partir da medula, timo, baço ou periférico sangue,11. Portanto, ambos linhagem B - e T-células podem ser isolado de lckeGFP zebrafish e no caso de rag2hMYC, lckeGFP animais, células B e T-tudo bem como11.

Aqui, apresentamos nosso protocolo para eficientemente FACS-purificar não-malignas células B de lck:eGFP zebrafish e não-malignas ou malignas de células B de rag2hMYC; lck:eGFP peixe, usando vários tecidos de origem. Tais células da mesma forma podem ser quantificadas por citometria de fluxo, sem isolamento de FACS, se desejado. Descoberta de baixo lck expressão- e consequentemente, baixa expressão de GFP-por B células abre novas portas de possibilidades experimentais para lckeGFP zebrafish, tais como estudos do desenvolvimento de células vivo em B. Assim, esta linha de transgénica, relatada pela primeira vez em 2004, tem vida nova como buscamos para utilizá-lo para recolher ideias frescas relativa imunidade adaptativa zebrafish.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo zebrafish foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) no centro de Ciências da saúde Universidade de Oklahoma.

1. isolando B não-malignas e linfócitos T do transgênico lck:eGFP peixe

  1. Anestesia o peixe usando metanosulfonato de 0,02% (MS-222) no sistema de água de peixes.
  2. Examine o peixe de 2-6 meses de idade para thymi fluorescente, que estão localizados no aspecto dorsomedial da cavidade branquial de zebrafish e outros teleósteos14. Use um microscópio de epifluorescência (470/40 de comprimento de onda de excitação e emissão de 525/50 filtro) para detectar as boas práticas agrícolas.
  3. Prepare com antecedência 50 mL de filtro-esterilizados 1 x Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) contendo 1% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina (classificação de mídia). Mídia de classificação não utilizadas pode ser armazenadas a 4 ° C por até 2 meses.
  4. Eutanásia o peixe, colocando-o em um béquer contendo 0,2% tricaina por aproximadamente 5 min, seguido por imersão de banho de gelo. Confirme morte com a cessação do movimento de odontódios (peixe).
  5. Coloque o peixe euthanized em uma placa de Petri e dissecar órgãos linfoides de interesse, usando o microscópio fluorescente para dissecar o GFP+ thymi14e configurações de microscopia de campo claro para dissecar o rim para a medula e o baço15. Os resultados aqui apresentados foram obtidos usando a 3 meses de peixes. Proporções de linfócitos e números absolutos variam de acordo com a idade e genótipo (veja a discussão para mais detalhes).
  6. Coloque cada órgão dissecado em um tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l de frio a classificação de meios de comunicação.
  7. Homogeneizar o tecido no gelo usando um homogeneizador de microtubo de pilão.
  8. Passe o tecido homogeneizado através de um filtro de malha de 35 µm para gerar uma suspensão de célula única. Manter as células no gelo até análise.

2. isolar linfócitos malignos de duplo-transgênicos rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafish

  1. Começando em 2-4 meses, microscopicamente a tela rag2:hMYC; lck:eGFP peixe por padrões anormais de GFP.
    Nota:
    as células B são GFPEis no fundo lck:eGFP , B-ALL requer prática para reconhecer; T-tudo é óbvio, porque as células T são GFPOi. Consequentemente, a rag2:hMYC, lck:eGFP linha dual-transgênicos tem dois fenótipos: brilhantemente-fluorescente T-ALL, que geralmente surgem a partir do Timo e estender para o corpo e palidamente fluorescente B-ALL.
    1. Usando um microscópio fluorescente, tela o peixe usando as configurações de "baixa exposição" (200 ms, ganho x 2,4) para identificar brilhante T-ALL (figura 1A) e "alta exposição" (1,5 s, ganho x 3,4) para identificar dim B-ALL (figura 1A). Controles WT e pre-leucêmicas peixes têm GFP localizada apenas no timo (figura 1B).
  2. Anestesia e examinar o peixe como descrito nos passos 1.1-1.2.
  3. Categorize os peixes baseados-se na medida da fluorescência de GFP, usando um simples sistema de categoria de três:
    Nota: Nível 1: Fluorescência aparece como um tumor do Timo com apenas limitada difusão local.
    Nível 2: Fluorescência aparece além do timo, envolvendo < 50% do corpo.
    Nível 3: Fluorescência ultrapassa 50% do corpo.
  4. Separe o peixe com todos do que aqueles sem câncer. Monitore pre-leucêmicas peixe (ou seja, sem tumores GFP+ ) uma vez mensal para o desenvolvimento do novo tudo. Por ~ 9 meses, todos os rag2:hMYC, lck:eGFP peixe desenvolve T-ALL, B-ALL, ou ambos.
  5. Para isolamento de células B ou T --todos, selecione o peixes de nível 3 (todos envolvendo > 50% do corpo), que rende mais de 2 x 106 todas as células e geralmente muitos mais.
  6. Eutanásia o peixe como na etapa 1.4.
    Nota: Existem dois métodos para obter todas as células: corpo inteiro homogeneização e uma técnica de lavagem peritoneal16. Os métodos diferem no número absoluto de células coletadas para classificação, e assim, os montantes de FACS tempo necessário e custo (veja a discussão para mais detalhes).
  7. Para qualquer método, primeiro coloque o peixe euthanized em uma placa de Petri e usando uma lâmina de barbear, retire a cabeça, incluindo a região do timo. Isto pode ser processado separadamente, se desejado, ou usado para coloração histológica.
  8. Método de lavagem peritoneal
    1. Usando uma pipeta P1000, lave a cavidade peritoneal de peixe com 500 µ l de frio classificação mídia, coletando as células e a mídia em um tubo de 5 mL.
    2. Utilize uma ponta de pipeta fresco, injete um μl 200 – 300 adicionais de classificação criogênicos na cavidade do corpo. Em seguida, usando a ponta da pipeta, aplique uma pressão suave para o corpo do peixe para expulsar as células fora da cavidade do corpo. Recolher esta mídia e adicionar ao tubo de 5 mL.
    3. Repita a etapa 2.8.2 2 – 3 vezes. Manter as células coletadas na classificação de mídia no gelo.
    4. Filtre a suspensão de células, apesar de uma malha de 35 µm filtro antes da citometria de fluxo/FACS e manter as células no gelo até análise.
  9. Homogeneização de corpo inteiro
    1. Depois de retirar a cabeça do peixe, coloca o corpo em um tubo de 1,5 mL contendo 200 µ l de classificação de meios de comunicação.
    2. Homogeneizar o corpo usando um homogeneizador de microtubo de pilão.
    3. Adicione um adicionais 300 μL de frio a classificação de meios de comunicação. Filtre a suspensão de células, apesar de um filtro de malha de 35 µm. Adicione mídia classificação conforme necessário para lavar todas as células através do filtro, até que apenas os restos de tecido permanecem no filtro. Manter as células no gelo até análise.

3. Cytometric Analysis dos linfócitos B Normal ou maligno

  1. Conjunto de análise de fluxo cytometric e/ou parâmetros de FACS, de acordo com o guia do fabricante.
  2. Adquira o número desejado de eventos inicialmente caracterizar a amostra. Analise a 1 x 104 a 5 x 104 eventos antes da classificação para determinar a portas específicas para as etapas subsequentes de classificação.
    1. Determinar os portões: definir linfócitos e progenitoras portões de célula usando forward scatter (FSC) e parâmetros de dispersão (CCD) de lado, excluindo os restos celulares (Fig. 2A-C)17. FSC e CCD correspondem a célula tamanho/diâmetro e granularidade, respectivamente.
      Nota: GFP, GFPEise GFPOi células diferem 10-para-100-fold em termos de sua intensidade de fluorescência de GFP, tornando a separação destas populações simples (figuras 2-5). Discriminação de morto-vivo pode ser avaliada neste ponto usando iodo propidium (PI) ou 7-aminoactinomycin D (7-Agostinho) viabilidade coloração. Experiências anteriores com PI geralmente demonstram > 95% de viabilidade de células GFP+ após FACS.
    2. Exclua as parelhas de célula, de acordo com os parâmetros da máquina FACS sendo usado.
    3. Dentro dos portões linfoides e/ou precursor, determine o número e a percentagem de células GFP+ .
  3. Use ficoeritrina (PE) e intensidades GFP, definir portão de GFP vs GFPEis vsOi células GFP.
    Nota: As células B apresentam fluorescência ofuscante de GFP e células T mostram GFP brilhante nas linhas de lck:eGFP . Muitos órgãos linfoides ou tumor amostras contêm ambas as populações GFP+ . B-linhagem células/B-todos são GFPEis e T-linhagem de células/T-ALL são GFPOi. Definir portas para distinguir entre GFP, GFPEiseOi células GFP e coletar estas populações separadamente (Fig. 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A e Figura 5a).
  4. Classificar cada população de células em tubos de polipropileno de diferentes 15 mL contendo 2 mL de classificação de meios de comunicação, ou diretamente em tubos de diferentes 1,5 mL, contendo um amortecedor apropriado para análises mais adicionais (por exemplo, RNA, DNA ou extração da proteína, allo-transplante, etc.).
  5. Manter células purificadas no gelo antes de novas análises.

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Representative Results

Nós usamos a citometria de fluxo para analisar e FACS para isolar a GFPEis e GFPOi células do timo, medula renal e baço de lck:eGFP zebrafish transgênicos. Análise de peixe 3 meses revelou que o Timo contida principalmente os linfócitos GFP+ . Células GFP+ em grande parte estavam confinadas ao portão linfoide anteriormente descrito pelo Traver et al.17. Duas populações distintas de GFP+ , GFPEise GFPOi,pode ser observado no timo. Oi linfócitos GFP representado uma percentagem mais elevada, ~ 60%, enquantoo GFP células eram menos abundantes, representando ~ 40% do total do Timo linfócitos (tabela 1). Ao contrário dos mamíferos, peixes hematopoéticas medula é localizada dentro do rim, em vez de dentro do osso. Determinamos as células B, que reside no rim medula também expressam os baixos níveis de GFP (Figura 2B e Figura 3B). GFPEis células na medula eram abundantes, enquantoOi células GFP eram escassas (Figura 2B e Figura 3B)), indicando que somente uma pequena porcentagem de linfócitos T estavam presentes na medula com 3 meses de idade. Esplênica amostras da mesma forma mostrou o maior percentual do GFPEis que GFPOi células (Figura 2 e Figura 3). Analisamos também não-malignas linfócitos do timo, medula e o baço de zebrafish transgênicos-duplo lck:eGFP; rag2:hMYC , que são propensas a ambos B e T-todo11. Em peixes que não tinham ainda desenvolvido tudo, resultados do timo, baço e medula foram semelhantes para single-transgênicos lck:eGFP peixe. No entanto, os números de linfócitos por órgão foram aumentados (Figura 3), presumivelmente devido a MYC-impulsionado a expansão das populações B e células T imaturas, onde o promotor rag2 é ativo.

Analisamos também peixe transgénicos-duplo com B e / ou T-tudo que tinha desenvolvido cancros fluorescentes por 6 meses. Previsivelmente, peixe B-ALL com cânceres palidamente-fluorescente contido principalmente GFPEis células (Figura 4A). Em contraste, brilhantemente fluorescente peixe pode abrigar ou T-todos isolados ou misturados populações de GFPEis B-ALL e GFPOi células T-ALL (Figura 5). Um exemplo de misturado tudo, que contém distinta B e T-todo, é mostrado aqui (Figura 5). Para confirmar as identidades de GFPEis eOi células GFP como B - e T-linhagem, respectivamente, analisamos as transcrições de B e T-celular-específica por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Nossos resultados mostram GFPEis células expressam níveis mais elevados de células B transcrições e GFPOi células expressam níveis mais elevados de genes de células T (Figura 2D, Figura3D, Figura4B e Figura 5B). Além disso, a expressão de lck e GFP em GFPEis todos correspondem a ofuscante na vivo GFP fluorescência do B-ALL (Figura 2D, Figura3D, Figura4B e Figura5B; qRT-PCR primers e condições sequências previamente descritas por Borga et al.) 11.

Figure 1
Figura 1: Padrões de fluorescência distintas em peixes transgênicos lck:eGFP . Imagens de microscopia fluorescente (A) de rag2:hMYC; lck:eGFP peixe com brilhantemente-fluorescente T-ALL (à esquerda) ou palidamente fluorescente B-ALL (à direita). T-tudo é visível com as configurações de exposição baixa; B-tudo só pode ser visto usando altas exposições. (B) ajustes de alta exposição mostram fraca fluorescência do timo (círculos amarelos) em selvagem-tipo lck:eGFP peixes (à esquerda) e rag2:hMYC; lck:eGFP duplo-transgênicos sem todos (direita). Escala de barras = 20 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Populações de linfócitos no zebrafish lck:eGFP . Imagens no topo mostram um 3 meses WT, lck:eGFP de peixe com ajustes de alta exposição ou computador-realce (para facilitar a visualização). Escala de barras = 20 mm. fluxo cytometric análises de timo (A), medula (B) e baço (C). Painéis esquerdos mostram FSC (eixo x) e SSC (eixo y), com ovais pretos indicando portões de linfócitos. Painéis de média retratam baseada em fluorescência gating com GFP (eixo x) e PE (eixo y). GFPOi (retângulo azul), GFPEis (retângulo verde) e populações de GFP (ovais preto) são mostradas. Painéis de direito exibem histogramas de GFPOi eEis células GFP. Linhas tracejadas indicam critérios associados em painéis de médios. (D) WT lck:eGFP thymi classificado para GFPOi (azul) e GFPEis (verde). Expressão do gene de célula B (pax5), genes de T (cd4) célula específica)lck e GFP. Os resultados são normalizados para genes de limpeza (β-actina e eef1a1l1) e mostrado como dobra-mudança ± erro padrão (samarone). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: As populações de linfócitos no zebrafish pre-leucêmicas rag2:hMYC; lck:eGFP . Imagens no topo mostram um 3-mês -velho rag2:hMYC; lck:eGFP de peixe com exposições de altas e aprimorada por computador. Barra de escala = 20 mm. os painéis de peças A-D são representados em formato idêntico à Figura 2. (D) expressão de cd4 pax5, lcke GFP na FACS-purificado tímico GFPEis (verde) GFPOi (azul) populações de células de lck:eGFP peixe. qRT-PCR os resultados são apresentados como dobra-mudança ± S.E. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise de peixe de transgénicos B-ALL rag2:hMYC; lck:eGFP . Parte superior (A): 6 meses rag2:hMYC; lck:eGFP de peixe com B-ALL, usando a configuração de alta exposição. Fluxo cytometric análises de células de tumor isoladas do corpo de peixe são formato idêntico à Figura 2. (B) expressão gênica em GFP T-ALLOi células (portão azul em Figura 5A, rag2:hMYC; lck:eGFP GFPOi timócitos (portão azul na Figura 3A) e B-ALL GFPEis células (portão verde na Figura 4A) ). Expressão de genes de células específicas de T (cd4) e B (pax5, cd79a), lcke GFP. Os resultados são normalizados para genes de limpeza (β-actina e eef1a1l1) e mostrado como dobra-mudança ± S.E. escala barra = 20 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise de misturado todos os rag2:hMYC; lck:eGFP peixe transgénicos. Parte superior (A): 6 meses rag2:hMYC; lck:eGFP peixe com tudo misturado usando configuração de alta exposição. Fluxo cytometric análises de células de tumor isoladas do corpo de peixe são formato idêntico à Figura 2. (B) GFPOi (azul) e GFPEis (verde) FACS gates. Expressão de genes de células específicas de T (cd4) e B (pax5, cd79a), lcke GFP. Os resultados são normalizados para genes de limpeza (β-actina e eef1a1l1) e mostrado como dobra-mudança ± S.E. escala barra = 20 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Desenvolvemos e fornecer um protocolo para isolar as células B de lck:eGFP zebrafish transgênicos, adicionando isso para outros modelos de d. rerio com B-linhagem rótulos3,4. Surpreendentemente, a identificação de GFPEis B células nesta linha passou despercebida desde sua descrição em 2004. Geralmente, lck é considerado de células T específicas6, mas os estudos recentes encontraram expressão inesperada lck pelo assassino natural e mieloide células, bem como em células B, como mostrado aqui18,19. De acordo com a nossa descoberta que zebrafish B células GFPEis, pre-B, ingênuo e amadurecem B células em seres humanos também expressam níveis baixos de LCK11,13.

Devido aos diferentes níveis GFP em células B e T destes peixes, células de ambas as linhagens agora podem ser isoladas desta linha. Embora estes animais classicamente têm sido usados para estudar, acompanhamento e desenvolvimento do Timo linfócitos T, demonstramos que estudos semelhantes também são possíveis com as células B. Para este fim, conseguimos identificar células B no timo, baço e medula renal aqui e no sangue periférico e em outros lugares em trabalhos anteriores11.

Reconhecendo o B-ALL em rag2:hMYC; lck:eGFP peixe requer um olho afiado, mas com a prática, é simples. Em seguida, escolher qual método usar para purificar de todas as células é fundamental. Aqui, apresentamos dois métodos: lavagem peritoneal e homogeneização de corpo inteiro. Lavagem peritoneal produz um número muito menor de células totais, mas uma percentagem muito elevada de células GFP+ . Consequentemente, é necessário, minimizando o custo pouco tempo de FACS. Para aplicações a jusante, onde o rendimento total é menos importante (por exemplo, qRT-PCR), isso é mais eficiente. Alternativamente, homogeneização de todo o corpo resulta em maiores suspensões única célula, que contém muitos mais células, mas uma menor percentagem de células será GFP+. Assim, é necessário para recolher o mesmo número de células GFP+ com lavagem peritoneal, mas milhões mais células podem ser purificadas para mais tempo de FACS. Para estudos a jusante, onde o alto rendimento é importante (por exemplo, borrão ocidental), isto pode compensar o custo adicional. Além disso, em todos os estudos, homogeneização total do corpo capta a diversidade das células cancerosas presentes, mais precisamente que representam a heterogeneidade do tumor. Embora não esteja listado em nosso protocolo, também é viável para dissecar única GFP+ regiões/órgãos do corpo do peixe com todos para homogeneização de picar a carne em um prato de Petri, diminuindo assim o total FACS tempo e custo, semelhante à lavagem peritoneal.

Expressão de GFP tímico no peixe lck:eGFP mostrou que a GFP é detectável logo em 5 dpf6. Nossos estudos aqui foram realizados em peixes adultos, 3 meses de idade ou mais velhos e mostram que nessa idade, as células B são abundantes na medula renal e baço, mas as células T são raras. Estudos posteriores com peixes de diferentes idades serão necessários para determinar se as células T são mais prevalentes em pontos diferentes do tempo. Da mesma forma, em 3 meses, as células T são enriquecidas no timo, mas um número considerável de células do timo de B também está presente. Se essas populações de linfócitos variam em diferentes idades é atualmente desconhecido, mas globalmente, tímica fluorescência se desvanece em lck:eGFP peixe começando na maturidade sexual (~ 3 meses), então é provável que o número de células T diminui com o aumento da idade, e as células B podem também. Da mesma forma, quandoEis B células GFP colonizam o Timo zebrafish é atualmente desconhecido. Usando lck:eGFP peixe, agora é possível acompanhar o desenvolvimento de B e células T do timo, influxo, efluxo e a cinética específica desses eventos. Além disso, tais perguntas são igualmente pertinentes para outros sítios anatômicos onde residem as células B, tais como a medula renal, baço, sangue e intestino (dados não mostrados).

Além de estudos do desenvolvimento de células B, encontramos recentemente B-ALL em lck:eGFP; RAG2:hMYC duplo-transgénico peixe11. Transgénico rag2:hMYC era conhecida por induzir T-ALL10 mas B-tudo tinha ido não reconhecido. Devido a alta penetrância deste oncogene, ambos os tipos de todos são predominantes nestes peixes, e muitos peixes na verdade ambos desenvolvem todos os tipos, simultaneamente,11. Desde que todos os B são GFPEis, enquanto T-todos são GFPOi, variando a expressão GFP permite que estas duas entidades ser isolado, FACS, mesmo quando ocorrem no mesmo animal (Figura 5A). Crucialmente, os linfócitos normais e malignos, qRT-PCRresults demonstrar que GFPEis eOi células GFP consistentemente correspondem para a B - e T-linhagens, respectivamente (Figura 2 e Figura 3).

O potencial inexplorado de peixe de lck:eGFP foi fundamental para este trabalho, destacando o fato de que muitas linhas transgénicas pré-existente provavelmente têm utilidade para além de sua finalidade. Aqui, apresentamos um protocolo romance para isolar as células B e T de d. rerio com transgênicos lck:eGFP, abrindo as portas para novas vias de investigação relativamente normais e malignos de linfócitos B. Os resultados desses estudos serão, sem dúvida, revitalizar o que já tem sido um recurso valioso para a hematopoiese, linfopoiese e campos de biologia do câncer.

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Disclosures

Os autores declaram não há conflito de interesses.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Megan Malone-Perez para cuidados de zebrafish e o núcleo de citometria de fluxo OUHSC. Este trabalho foi financiado por doações de Hyundai Hope sobre rodas, o centro de Oklahoma para o avanço da ciência e tecnologia (HRP-067), um prêmio de projeto piloto de NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detém o E.L. & Thelma Gaylord dotado cadeira em Hematologia-Oncologia Pediátrica da Fundação do Hospital de crianças.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 µm mesh Sefar Filter technology 7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap Falcon Corning Brand 352235
50 mL conical tube VWR international 525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope Nikon
Cytoflex Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 Sigma E-10521
FACSJazz BD Biosciences
Fetal bovine Serum Thermo Fisher 10437028
FlowJo v10.2 FlowJo, LLC
lck:eGFP See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software Nikon Version 4.13
Penicilin-Streptomycin Sigma P4333
Pestle micro-tube homogenizers Electron Microscopy Sciences 64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x Life Technologies 11835-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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