Bruke Caenorhabditis elegans for å studere trans-og multi-generasjons effekter av toxicants

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Trans-og multi-generasjons effekter av vedvarende kjemikalier er avgjørende for å bedømme sine langsiktige konsekvenser i miljøet og på den menneskelige helse. Vi gir romanen detaljerte metoder for å studere trans-og multi-generasjons effekter ved hjelp av fri-levende nematode Caenorhabditis elegans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Informasjon om toksisitet av kjemikalier er viktig i deres anvendelse og avfallshåndtering. For kjemikalier ved lave konsentrasjoner, er de langsiktige virkningene svært viktig for å bedømme deres konsekvenser i miljøet og på menneskers helse. Ved å demonstrere langsiktige påvirkninger, gir virkningene av kjemikalier over generasjoner i nyere studier ny innsikt. Her beskriver vi protokoller for å studere effekter av kjemikalier over flere generasjoner ved hjelp av fritt levende nematode Caenorhabditis elegans. To aspekter er presentert: (1) trans-generasjons (TG) og (2) multi-generasjons effekt studier, hvorav sistnevnte er separert til multi-generasjons eksponering (MGE) og multi-generasjons rest (MGR) effekt studier. TG effekt studien er robust med en enkel hensikt å avgjøre om kjemisk eksponering for foreldre kan føre til eventuelle gjenværende konsekvenser for avkom. Etter at effektene er målt på foreldre, er natrium natriumhypokloritt løsninger brukes til å drepe foreldrene og holde avkom for å lette effekten måling på avkom. TG-effekten brukes til å avgjøre om avkommet påvirkes når forelderen utsettes for forurensende stoffer. MGE og MGR effekt studien er systematisk brukes til å avgjøre om kontinuerlig generasjonsskifte eksponering kan føre til adaptive responser i avkom over generasjoner. Nøye henting og overføring brukes til å skille generasjoner for å lette effekten måling på hver generasjon. Vi kombinerte også protokoller for å måle bevegelse atferd, reproduksjon, levetid, biokjemiske og genuttrykk endringer. Noen eksempel eksperimenter er også presentert for å illustrere trans-og multi-generasjons effekt studier.

Introduction

Anvendelsen og avfallshåndtering av kjemikalier er svært avhengig av informasjon om deres virkninger ved visse konsentrasjoner. Tid er spesielt et vesentlig element mellom effekter og konsentrasjoner. Det vil si, kjemikalier, spesielt de ved lave konsentrasjoner i de faktiske miljøer, trenger tid til å provosere målbare effekter1. Derfor, forskere arrangere ulike lengder av eksponeringen varighet i dyre eksperimenter, og til og med dekke hele livssyklusen. For eksempel ble mus eksponert for nikotin for 30, 90 eller 180 dager for å studere dens toksiske effekter 2. Likevel, slik eksponering varigheter er fortsatt ikke nok til å belyse de langsiktige virkningene av forurensende stoffer (f. eks, vedvarende organiske forurensninger [POPs]) som kan vare over generasjoner av organismer i miljøet. Derfor er studier på effekter over generasjoner stadig mer og mer oppmerksomhet.

Det er to hoved aspekter i generasjonsskifte effekt studier. Den første er den Trans-generasjons (TG) effekt studie som kan robust teste om kjemisk eksponering for foreldre kan resultere i noen konsekvenser på avkom3. Den andre er en multi-generasjons effekt studie som er mer systematisk med hensyn i både eksponering og gjenværende effekter. På den ene siden, multi-generasjons eksponering (MGE) effekter brukes til å illustrere adaptive responser i dyrene til de langsiktige utfordrende miljøer. På den annen side, den multi-generasjons rest (MGR) effekter brukes til å demonstrere de langsiktige gjenværende konsekvenser etter eksponering, siden mors eksponering er ledsaget med embryo eksponering for den første avkom og bakterie-linje eksponering til andre avkom som gjør den tredje avkom som første generasjon helt ut av eksponering4.

Selv om pattedyr (for eksempel mus) er modell organismer i toksisitet studier spesielt i forhold til mennesker, er deres anvendelse i å studere generasjonsskifte effekter ganske tidkrevende, dyrt og etisk om 5. Følgelig, organismer inkludert skalldyr daphnia Magna6, insekt Drosophila melanogaster7 og sebrafisk Danio rerio8, gir alternative valg. Likevel, disse organismer enten mangler likheter med mennesker, eller krever spesifikt utstyr i studier.

Caenorhabditis elegans er en liten fri-levende nematode (ca 1 mm i lengde) med en kort livssyklus (ca 84 h ved 20 ° c)9. Dette nematode aksjer mange biologiske veier konservative til mennesker, og derfor har det vært mye brukt til å illustrere effekter av ulike påkjenninger eller toxicants10. 99,5% av nematoder er hermafroditter å gjøre denne organismer ekstremt egnet i å studere generasjonsskifte effekter, for eksempel TG effekter av tungmetaller og Sulfonamider3,11, MGE effekter av gull nanopartikler og tunge metaller12 og temperatur13, Mgr effekter av sulfonamide14, og både MGE og MGR effekter av gamma bestråling15 og lindan4. Videre ble det funnet sammenlignbare resultater mellom virkningene av kjemikalier (f.eks. zearalenone) om utvikling og reproduksjon av mus og C. elegans16,17, som ville gi en fordel å ekstrapolere virkninger fra denne liten dyr å Human vesener.

Både TG og MG effekt studier er tidkrevende og trenger forsiktig design og ytelse. Spesielt, forskjeller eksisterte i livet-scenen valg, eksponerings forhold og generasjon separasjon metoder i de nevnte studiene. Slike forskjeller hindret direkte sammenligning mellom resultatene og hemmet ytterligere tolkning av resultatene. Derfor er det viktig å etablere ensartede protokoller for å veilede TG og MG effekt studier, og også å gi et større bilde for å avdekke lignende mønstre av ulike toxicants eller forurensende stoffer i langsiktige konsekvenser. De over målet med dagens protokoller vil demonstrere klare operasjons prosesser i å studere trans-og multi-generasjons effekter med C. elegans. Protokollene vil være til nytte for forskere som er interessert i å studere de langsiktige virkningene av toxicants eller forurensende stoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kultur E. coli OP50

  1. Forbered 1 M natriumhydroksid løsning ved å oppløse 4 g natriumhydroksid i 100 mL vann.
  2. Forbered lysogeny buljong (LB) medium ved oppløsning 10 g tryptone, 5 g gjærekstrakt og 10 g natriumklorid med 1 L av ultrarent vann i en 1 L konisk kolbe. Juster pH til 7,0 med 1 M natriumhydroksid løsning.
  3. Alikvot LB flytende medium fra trinn 1.2 til 20 koniske flasker (maksimalt tillatte volum: 100 mL) med 50 mL medium i hver. Dekk de koniske flaskene med kraft papir.
  4. Sterilisere LB flytende medium ved 121 ° c og 0,105 MPa i 20 min. Avkjøl LB medium ned til romtemperatur.
  5. Pipetter 200 μL fra bakteriell suspensjoner (se trinn 1,8) eller velg en liten koloni fra agars (i trinn 2,14) ved hjelp av en vaksinere sløyfe, Legg den i LB medium.
  6. Ruge LB medium med risting ved 150 RPM ved 37 ° c for 24-48 h. LB medium vil endre fra en brun gjennomsiktig væske til grumsete khaki-farget suspensjon.
  7. Bruk bakteriell suspensjoner fra 80% av totale kanner å gi E. coli OP50 som nematode mat som skal brukes i trinn 2,11.
  8. Oppbevar resten av flaskene som inneholder bakterielle suspensjoner i et kjøleskap ved 4 ° c. Pipetter 200 μL av LB suspensjoner på øvre side av fersk LB medium (trinn 1,4) og gjenta trinn 1.6 for påfølgende inkubasjons.

2. kultur C. elegans

Merk: kultur C. elegans bruke som per trinn 2,1 til 2,11 basert på standard metoder18.

  1. Løs opp 22,8 g av K2HPO4• 3h2O i 100 ml sterilt destillert vann.
  2. Løs opp 6,8 g av KH2PO4 i 50 ml sterilt destillert vann.
  3. Bland løsninger fra trinn 2,1 og 2,2 for å klargjøre 1 M K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 6,0, 150 ml totalt).
  4. Forbered 1,0 M MgSO4 ved å oppløse 1,232 g av MgSO4• 7H2O i 5 ml sterilt destillert vann, og sterilisere det ved å filtrere løsningen gjennom et steril en gangs membran filter på 0,22 μm til en steril beholder.
  5. Forbered 1 M CaCl2 ved å oppløse 0,554 g av CaCl2 i 5 ml sterilt destillert vann, og sterilisere det ved å filtrere løsningene gjennom et 0,22 μm sterilt en gangs membran filter til en steril beholder.
  6. Forbered 1 M kolesterol løsning ved å oppløse 0,025 g av kolesterol i 5 mL absolutt etanol, og sterilisere det ved å filtrere løsningen gjennom et 0,22 μm sterilt en gangs membran filter i en steril beholder.
  7. Forbered nematode vekstmedium (NGM) agar ved å legge 17 g av agar pulver, 2,5 g peptone og 3 g natriumklorid til en 1 L konisk kolbe som inneholder 1 L av ultrarent vann. Legg til 25 mL av K2HPO4-KH2PO4 løsning fra trinn 2,3.
  8. Sterilisere NGM agar fra trinn 2,7 ved 121 ° c med 0,105 MPa i 20 min.
  9. Avkjøle det NGM agar å om 50 ° c, sammenlegge 1 mL av 1 M MgSO4, 1 m CaCl2, og 5 mg/ml kolesterol-etanol løsning fra skritt 2,4 å 2,6 inn i medium og blande seg grundig.
  10. Hell ~ 10 mL NGM agar medium per tallerken i 100 sterile Petri retter (6,0 cm diameter). Cool mediet i Petri retter til romtemperatur for å danne solid agar.
  11. Pipetter 170 μL av bakteriell suspensjoner fra trinn 1,7 på den nevnte NGM agar ved hjelp av en steril spiss. Rist NGM agar litt å distribuere LB medium jevnt over NGM agar overflaten.
  12. Vaksinere NGM agar med toppen side opp ved 37 ° c for 8-12 h å danne en bakteriell plen.
  13. Bruk mesteparten av agar med bakterielle plener fra trinn 2,12 til kultur nematoder i trinn 2,15 eller 2,19.
  14. Lagre 1 eller 2 agars opp-side ned for å unngå vann fordampning og forurensning i kjøleskap ved 4 ° c for å opprettholde bakteriene i forurensning.
  15. Når det er mindre enn 2 000 nematoder på strømpe NGM agars (fra tidligere eksperimenter eller begavet fra andre laboratorier), kuttet en sjette av NGM agar som inneholder C. elegans med en steril spiss og overføre den til nylig utarbeidet NGM agars med bakteriell på plenen (fra trinn 2,13). Hold NGM agars opp-ned i en inkubator på 22 ° c for den påfølgende kulturen.
  16. Når det er mer enn 2 000 nematoder på strømpe NGM agar, skyll nematoder av NGM agar med 2 mL sterilt vann i sentrifugerør. Inngangen på 2 mL vann vil resultere i en ca. 1,5 mL effekt.
  17. La nematoder til å bosette seg i sentrifuge rørene fra i 30 min. kast 1 mL av supernatanter ved pipettering og tilsett 1 mL sterilt vann i hvert rør for å vaske pellets (dvs. nematoder).
  18. Slå ned nematoder i sentrifuge rørene i 30 min. kast 1 mL av supernatanter ved pipettering. Tilsett 1 mL sterilt vann i hvert rør for å resuspend nematoder.
  19. Distribuer nematode suspensjoner (ca. 1,5 mL totalt) ved pipettering 150 μL til hver nye NGM agar med bakteriell plen (fra trinn 2,13), noe som gjør 8-10 nye NGM-agars totalt.
  20. Hold NGM agars fra trinn 2,19 opp i en 20 ° c inkubator over natten og deretter opp-ned for den påfølgende kulturen.
  21. Gjenta trinn 2,15 eller trinn 2.16-2.20 hver tredje dag.

3. Forbered synkroniserte egg og L3 larver av C. elegans

  1. Skyll av gravid nematoder og nylig produserte egg fra NGM agars i sterile sentrifugerør, med 2 mL sterilt vann på hver NGM agar som resulterer i ca 1,5 mL av produksjonen.
  2. Bosette seg nematoder i sentrifuge rørene i 30 min, og deretter forkaste 85% av supernatanter ved pipettering.
  3. Forbered natrium natriumhypokloritt løsninger ved å oppløse 0,6 g NaOH og 5 mL NaOCl (4-6% aktive graderinger, se tabell over materialer for detaljer) med 25 ml vann for å bringe NaOH til 0,5 M og NaOCl til 1%.
  4. Bland pellets fra trinn 3,2 (Merk volumet som V0) med 7-fold V0 av natrium natriumhypokloritt løsninger fra (trinn 3,3, dvs. Volumforholdet 1:7)19.
  5. Rist sentrifuge rørene hver 2 min for 10-15 min til lyse larvene og voksen nematoder; fargen på nematode suspensjoner vil slå fra grumsete å fjerne.
  6. Sentrifuger rørene ved 700 x g i 3 min ved 20 ° c, og kast deretter supernatanter ved pipettering.
  7. Resuspend pellets i 5-fold V0 av sterilt vann å vaske alder-synkroniserte egg. Sentrifuger ved 700 x g for 3 min ved 20 ° c, og kast deretter supernatanter.
  8. Gjenta trinn 3,7 to ganger.
  9. Tilsett 1-fold V0 av sterilt vann inn i rørene for å resuspend de alder-synkroniserte egg.
  10. Distribuer eggene suspensjoner av pipettering 50 μL på hver nye NGM agars med bakteriell plen fra trinn 2,13. Hold NGM agars oppe i en 20 ° c inkubator i 30 min, slik at vannet kan fordampe eller bli adsorberes av den bakterielle plenen. Deretter gjør NGM agars opp-side ned for den påfølgende kulturen. Merk tiden som egget tid (Tegg).
  11. Forbered K-medium ved å oppløse 3 g av NaCl og 2,36 g KCl i 1 L vann. Sterilisere mediet ved 121 ° c og 0,105 MPa i 20 min og Avkjøl det ned til romtemperatur.
  12. Når tiden når 36 h etter Tegg, vil nematoder nå L3 larver scenen (L3 nematoder)20. Skyll nematoder av NGM-agars i sentrifugerør, med 2 mL sterilt vann på hver NGM agar som resulterer i omtrent 1,5 mL effekt.
  13. Etter en bosetting i 30 min, erstatte 85% av supernatanter (av pipettering) med K-medium fra 2 t for å fordøye maten i guts3.
  14. Kast supernatanter. Bruk K-medium (fra trinn 3,11) for å justere nematode suspensjoner til ca. 200 nematoder per 100 μL for påfølgende eksperimenter.

4. Bruk C. elegans for Trans-generasjons effekt studie

  1. Forbered kjemiske løsninger med 5 konsentrasjonsnivåer og ett løsemiddel eller absolutt kontroll, det vil si 6 grupper totalt.
  2. Tilsett 100 μL av kontroll eller kjemiske løsninger med 10 brønner som replikerer i hver gruppe (dvs. 60 brønner totalt) i midten av en 96-vel steril mikroplate for å unngå kanteffekter.
  3. Fortynne nematode suspensjoner fra trinn 3,14 med K-medium fra trinn 3,11 med 10-fold. Tilsett 100 μL nematode suspensjoner til hver av de 60 brønnene fra trinn 4,2. Merk klokkeslettet som t0.
  4. Når tiden når 24 h etter t0, telle levende og døde nematoder i brønnene. Beregn median dødelig konsentrasjon (LC50).
  5. Forbered en serie på 5 konsentrasjoner under 10% av LC50 verdier.
  6. Tilsett 100 μL av kontroll eller kjemiske løsninger (fra trinn 4,5) med 10 brønner som replikerer i hver gruppe (dvs. 60 brønner totalt) inn i det midterste området av en 96-vel steril mikroplate for å unngå kanteffekter.
  7. Tilsett 100 μL av K-medium som inneholder ca. 200 L3-nematoder (fra trinn 3,14) til hver av de 60 brønnene fra trinn 4,6. Merk klokkeslettet som T0.
  8. Utfør eksponeringen for 24 til 96 h siden T0.
  9. Etter eksponeringen, samle nematoder fra fem brønner i hver gruppe i 1,5 mL sentrifugerør ved pipettering (dvs. 6 rør totalt).
  10. Bosette nematoder i 30 min, forkaste supernatanter ved pipettering, og resuspend og vask nematoder nederst med 1 mL sterilisert vann.
  11. Utlign nematoder i 30 minutter, kast supernatanter ved pipettering og bruk nematoder nederst for indikator målingene (se pkt. 7) for den eksponerte overordnede generasjonen som er merket som F0.
  12. Samle, bosette og vaske (ved blanding) nematoder fra de resterende fem brønner i hver gruppe i trinn 4,9 i henhold til trinn 4,10.
  13. Utligne nematoder fra trinn 4,12 i 30 min. kast supernatanter ved pipettering og tilsett 100 μL av sterilt vann for å resuspend nematoder. Overfør nematode suspensjoner jevnt på tre nylig forberedte NGM-agars med bakteriell plen fra trinn 2,13.
  14. Ruge nematoder for 36 h til å bli gravid og utføre alder-synkronisering i henhold til trinn 3.1-3.9. Ruge de synkroniserte eggene på respektive NGM agars med bakteriell plen fra trinn 2,13 for 36 h.
  15. Skyll nematoder på NGM-agars fra trinn 4,14 inn i seks sentrifugerør.
  16. Bosette nematoder i 30 min, og forkaste supernatanter ved pipettering. Resuspend og vask pellets med 1 mL sterilisert vann.
  17. Bosette nematoder i 30 min, og forkaste supernatanter ved pipettering. Bruk nematoder nederst for indikator målingene (se pkt. 7) av avkommet-generasjonen merket som T1.

5. Bruk C. elegans for effekt studie med flere generasjons eksponering (MGE)

  1. Bland 99,0 mL NGM agars (fra trinn 2,9) med 1 mL kontroll eller kjemiske løsninger (lave og høye konsentrasjoner i denne protokollen som eksempler, det vil si tre grupper totalt).
  2. Hell ca 10 mL NGM agar medium per tallerken fra trinn 5,1 til 100 sterile Petri retter (6,0 cm diameter). Cool mediet i Petri retter til romtemperatur for å danne solid agar.
  3. Pipetter bakteriell suspensjoner på agar som per trinn 2,11.
  4. Sett til side den øvre lokk av Petri retter og utsette bakteriell plenen til UV-lys (145 μW/cm2) i biosafety kabinett i 15 min.
  5. Plukk en liten koloni ved hjelp av en vaksinere sløyfe, plasserer den i LB medium fra agars i trinn 1,4. Ruge LB medium med risting med en hastighet på 150 RPM ved 37 ° c for 24 h for å bekrefte negligle bakteriell vekst, validere drapet trinn 5,4.
  6. Pipetter de alder-synkroniserte eggene fra trinn 3,9 på agars (fra trinn 5,4). Merk starten på eksponeringen til den overordnede generasjonen F0, og Merk den som dag 0 (D0).
  7. Ruge agars for 3 d ved 20 ° c. Deretter (dvs. på D3), bruk de modne nematoder til å måle effekter i F0 (se avsnitt 7).
  8. Også på D3, plukke F0 modne nematoder på nye NGM agars (fra trinn 5,4) ved hjelp av en glass stang, hvis ende er utstyrt med en menneskeskapte fiber wire bøyd inn i en ring.
  9. På D4 plukker du ut og forkaster de modne F0 nematoder fra NGM agars. Merk den nylig klekket avkom nematoder innen disse 24 h (fra D3 til D4) som F1 for å oppleve andre generasjons eksponering.
  10. På D6, måle indekser (se avsnitt 7) av F1 modne nematoder som har opplevd eksponering i 3 dager.
  11. På D9, Gjenta trinn 5.8-5.10, bruk F1 nematoder å reprodusere F2 ormer og måle effekter på F2 nematoder.
  12. På D12 gjentar du trinn 5,11, bruker F2 nematoder til å reprodusere F3-ormer og måler effekter på F3-nematoder. Gjennom på samme måte, reprodusere avkom og måle MGE effekter på nth avkom generasjon (FN).

6. Bruk C. elegans for multi-generasjons rest (Mgr) effekt studie

  1. Gjenta trinn 5.1-5.7. På D3, plukke F0 eldre nematoder på nye NGM agars uten tilsatt kjemikalier (fra trinn 2,13).
  2. På D4 plukker du ut og forkaster de modne F0 nematoder. Merk den nylig klekket avkom nematoder innenfor disse 24 h som T1 nematoder.
  3. På D6, måle indekser (se pkt. 7) av T1 modne nematoder som har vokst i 3 dager.
  4. På D9 gjentar du trinn 6.2-6.3, bruker T1-nematoder til å reprodusere T2-nematoder og måler effekter i T1-nematoder.
  5. På D12 gjentar du trinn 6,4, bruker T2 nematoder til å reprodusere T3-nematoder og måler effekter i T2-nematoder. Gjennom på samme måte, reprodusere avkom og måle MGR effekter på nth avkom generasjon (TN) nematoder av F0, eller nth avkom (TN ') nematoder av FN fra trinn 5,12.

7. måleindikatorer

  1. Måle bevegelse atferd.
    1. Skyll nematoder av NGM-agars med sterilt vann og samle dem i sentrifugerør. Bosette nematoder i 30 min, forkaste supernatanter og bruke nematoder i pellets for effekt måling.
    2. Resuspend nematoder i pellets med 1 mL sterilt vann og Pipetter dem til NGM agars uten bakteriell plen fra trinn 2,10.
    3. Bruk et dissekere mikroskop for å score nematoder for (antall) Body bøye frekvens (BBF) som refererer til ganger den bakre pære av svelget endrer retning langs den vertikale retning av den omreisende banen innenfor et 60 s intervall.
    4. Bruk dissekere mikroskop for å score reversering bevegelse (RM) som refererer til de gangene den reiser retning endres over 90 ° inkludert bakover svinger og Omega sving (OT) i et intervall på 60 s. Den OT refererer til bevegelsen når leder av nematode berører eller nesten berører halen gjør nematode form som den greske bokstaven Omega (Ω).
      Merk: minst 6 nematoder ble undersøkt for hver behandling i hver eksperimentelle replikere.
Eksempler for MGE (F0 til F3) effekter på reproduksjon og levetid med 3 grupper (én kontroll og to eksponerings behandlinger).
Dag NGM agar nummer for MGE studie Forklaring
Levetid Reproduksjon
0 30 (F0 eksponering) 10 replikerer for hver gruppe, merket som F0-1-1-0 til F0-3-10-0, med det siste sifferet for å vise overlevelse dager.
1 30 (F0 overleve 1 d) F0-1-1-0 til F0-3-10-0 bør endres til F0-1-1-1 til F0-3-10-1.
2 30 (F0 overleve 2 d) F0-1-1-1 til F0-3-10-1 bør endres til F0-1-1-2 til F0-3-10-2.
Du trenger ikke å overføre F0 nematoder før 3 d.
3 30 (F0 overleve 3 d, ryddet etter nematoder overføring og samling) Etter 3 d, F0 nematoder er modne og 36 nye NGM agars (med 2 nematoder på hver agar) brukes til å observere deres overlevelse og reproduksjon.
36 (F0-1-1-3 til F0-3-12-3) Foreløpige eksperimenter bør utføres for å arrangere antall F0 nematoder, sikre minst 200 avkom for å lykkes multi-generasjons operasjoner.
Spesielt hvis MGR-effekter blir studert, bør F0-nematoder overføres til klare NGM-agars uten kjemisk eksponering, og det bør bemerkes som T1 start.
De fleste av F0 nematoder er samlet for å måle kjemiske og genetiske indekser og de 30 agars i F0 er ryddet.
4 36 (F0-1-1-4 til F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 til F1-3-12-1) Måling på levetid og reproduksjon krever overføring hver dag.
Parent nematoder på F0-1-1-3 til F0-3-12-3 er plukket på nye NGM agars merket som F0-1-1-4 til F0-3-12-4.
De resterende avkom nematoder (dvs. F1 i MGE, eller T1 i MGR) i F0-1-1-3 til F0-3-12-3 agars har vokst for 1 d, og markørene er endret til F1-1-1-1 til F1-3-12-1. Disse agars brukes også til å overvåke levetiden til F1 med daglig overføring.
5 36 (F0-1-1-5 til F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 til F1-3-12-2) Nematoder på F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agars har vokst for 2 d og blir lett synlig og nematoder telles, og markørene er endret til F1-1-1-2 til F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 til F0-3-12-4) Avkommet nematoder i F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agars har vokst for 1 d.
6 36 (F0-1-1-6 til F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 til F0-3-12-4, fjernet etter opptelling) Nematoder på F1-1-1-2 til F1-3-12-2 agars har vokst for 3 d og markørene er endret til F1-1-1-3 til F1-3-12-3. Spesielt, F1 nematoder begynner å reprodusere F2 på denne dagen, F1 nematoder bør overføres til nye NGM agars gjør F2-1-1-0 til F1-3-12-0. For MGR studier, T2 start i dag.
36 (F1-1-1-3 til F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 til F0-3-12-5) Dette kan bli forsinket av kjemisk eksponering, og derfor bør fleksible endringer utføres i hvert eksperiment for å sikre nok nematoder for påfølgende generasjoner.
36 (F2-1-1-0 til F1-3-12-0) Avkommet nematoder på F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
Avkommet nematoder på F0-1-1-5 til F0-3-12-5 agars har vokst for 1 d.
7 36 (F0-1-1-7 til F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 til F0-3-12-5, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder på F0-1-1-5 til F0-3-12-5 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-4 til F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 til F0-3-12-6) Det totale nematode tallet i F1-1-1-1 til F1-3-12-1-agars, F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agars og F0-1-1-5 til F0-3-12-5, brukes til å beregne den første gjengivelsen av F0.
36 (F2-1-1-1 til F2-3-12-1) Avkommet nematoder på F0-1-1-6 til F0-3-12-6 agars har vokst for 1 d.
Den F2 nematoder på F2-1-1-0 til F1-3-12-0 har vokst for 1 d og deres markører er endret til F2-1-1-1 til F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 til F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 til F0-3-12-6, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder på F0-1-1-6 til F0-3-12-6 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-5 til F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 til F0-3-12-7) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-7 til F0-3-12-7 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-2 til F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 til F1-3-12-4) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-4 til F1-3-12-4 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-1 til F2-3-12-1, endret til F2-1-1-2 til F2-3-12-2 etter opptelling) Den F2 nematoder på F2-1-1-1 til F2-3-12-1 har vokst for 2 d, nematoder telles og deres markører er endret til F2-1-1-2 til F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 til F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 til F0-3-12-7, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-7 til F0-3-12-7 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-6 til F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 til F1-3-12-4, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-4 til F1-3-12-4 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-3 til F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 til F0-3-12-8) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-8 til F0-3-12-8 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-0 til F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 til F1-3-12-5) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-5 til F1-3-12-5 agars har vokst for 1 d.
Den F2 nematoder på F2-1-1-2 til F2-3-12-2 har vokst i 3 dager og deres markører er endret til F2-1-1-3 til F2-3-12-3. F2-nematoder begynner å reprodusere i dag, og de overføres til 36 nye NGM agars er nødvendig og merket som F3-1-1-0 til F3-3-12-0. For MGR studier, T3 start i dag.
10 36 (F0-1-1-10 til F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 til F0-3-12-8, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-8 til F0-3-12-8 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-7 til F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 til F1-3-12-5, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-5 til F1-3-12-5 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-4 til F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 til F0-3-12-9) Det totale nematode tallet i F2-1-1-1 til F2-3-12-1, F1-1-1-4 til F1-3-12-4-agars og F1-1-1-5 til F1-3-12-5 brukes til å beregne den første gjengivelsen av F1.
36 (F3-1-1-1 til F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 til F1-3-12-6) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-9 til F0-3-12-9 agars har vokst for 1 d.
Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-6 til F1-3-12-6 agars har vokst for 1 d.
Avkommet nematode på F3-1-1-0 til F3-3-12-0 agars har vokst for 1 d og markørene endres til F3-1-1-1 til F3-3-12-1.
Spesielt vil gjengivelsen av F0 nematoder betydelig reduseres etter de første dagene. Derfor er nematode overføringen ikke strengt nødvendig å være daglig etter D10 og kan utføres hver 2 dager. Likevel krever overlevelse fortsatt daglig observasjon.
Den samme regelen gjelder også i F1 (T1, T1 '), F2 (T2, T2 ') og F3 (T3, T3).
11 36 (F0-1-1-11 til F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 til F0-3-12-9, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-9 til F0-3-12-9 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-8 til F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 til F1-3-12-6, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-6 til F1-3-12-6 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-5 til F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 til F0-3-12-10) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-10 til F0-3-12-10 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-2 til F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 til F1-3-12-7) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-7 til F1-3-12-7 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-4 til F2-3-12-4) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-4 til F2-3-12-4 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-1 til F3-3-12-1, endret til F3-1-1-2 til F3-3-12-2 etter telling) Nematoder på F3-1-1-1 til F3-3-12-1-agars har vokst for 2 d, nematoder telles og indikatorene endres til F3-1-1-2 til F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 til F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 til F0-3-12-10, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-10 til F0-3-12-10 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-9 til F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 til F1-3-12-7, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-7 til F1-3-12-7 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-6 til F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 til F2-3-12-4, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-4 til F2-3-12-4 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-3 til F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 til F0-3-12-11) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-11 til F0-3-12-11 agars har vokst for 1 d.
36 (F4-1-1-0 til F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 til F1-3-12-8) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-8 til F1-3-12-8 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-5 til F2-3-12-5) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-5 til F2-3-12-5 agars har vokst for 1 d.
Nematoder på F3-1-1-2 til F3-3-12-2-agars har vokst for 3 d, og markørene endres til F3-1-1-3 til F3-3-12-3. Det F3 nematoder begynne å reprodusere dags dato og de er forflyttet å 36 ny NGM agars er behøvde og fair idet F4-1-1-0 å F4-3-12-0. For MGR-studier starter avkom av F3 (dvs. T1) i dag.
13 36 (F0-1-1-13 til F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 til F0-3-12-11, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-11 til F0-3-12-11 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-10 til F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 til F1-3-12-8, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-8 til F1-3-12-8 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-7 til F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 til F2-3-12-5, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-5 til F2-3-12-5 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-4 til F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 til F0-3-12-12) Det totale nematode tallet i F3-1-1-1 til F3-3-12-1, F2-1-1-4 til F2-3-12-4 agars og F2-1-1-5 til F2-3-12-5 brukes til å beregne den første gjengivelsen av F2.
36 (F4-1-1-1 til F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 til F1-3-12-9) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-12 til F0-3-12-12 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-6 til F2-3-12-6) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-9 til F1-3-12-9 agars har vokst for 1 d.
Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-6 til F2-3-12-6 agars har vokst for 1 d.
Avkom nematoder av F3 på F4-1-1-0 til F4-3-12-0 har vokst for 1 d, og markører er endret til F4-1-1-1 til F4-3-12-1.
14 36 (F0-1-1-14 til F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 til F0-3-12-12, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-12 til F0-3-12-12 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-11 til F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 til F1-3-12-9, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-9 til F1-3-12-9 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-8 til F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 til F2-3-12-6, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-6 til F2-3-12-6 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-5 til F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 til F4-3-12-1, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F3 på F4-1-1-1 til F4-3-12-1 har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles. For MGR studier, T1 ' nematoder har vokst for 2 d, og vil begynne å reprodusere T2 ' på neste dag (D15), og T2 ' vil begynne å reprodusere T3 ' på D18. Levetiden av vill type C. elegans er exampled som 15 dager. Deretter vil avslutningen av T3 ' levetid være på D33.
36 (F0-1-1-13 til F0-3-12-13) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-13 til F0-3-12-13 agars har vokst for 1 d.
36 (F1-1-1-10 til F1-3-12-10) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-10 til F1-3-12-10 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-7 til F2-3-12-7) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-7 til F2-3-12-7 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-4 til F3-3-12-4) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-4 til F2-3-12-4 agars har vokst for 1 d.
15 36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 til F0-3-12-13, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-13 til F0-3-12-13 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F1-1-1-12 til F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 til F1-3-12-10, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-10 til F1-3-12-10 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-9 til F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 til F2-3-12-7, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-7 til F2-3-12-7 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-6 til F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 til F3-3-12-4, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-4 til F3-3-12-4-agars har vokst for 2D, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F0-1-1-14 til F0-3-12-14) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-14 til F0-3-12-14 agars har vokst for 1 d.
36 (F1-1-1-11 til F1-3-12-11) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-11 til F1-3-12-11 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-8 til F2-3-12-8) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-8 til F2-3-12-8 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-5 til F3-3-12-5) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-5 til F2-3-12-5 agars har vokst for 1 d.
16 36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15, over) 36 (F0-1-1-14 til F0-3-12-14, fjernet etter opptelling) Levetiden av vill type C. elegans er exampled som 15 dager. Derfor bør F0 ha alle døde før dag 16 siden eksponeringen.
36 (F1-1-1-13 til F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 til F1-3-12-11, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-14 til F0-3-12-14 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles.
36 (F2-1-1-10 til F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 til F2-3-12-8, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-11 til F1-3-12-11 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-7 til F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 til F3-3-12-5, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-8 til F2-3-12-8 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-5 til F3-3-12-5-agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F1-1-1-12 til F1-3-12-12) Det generelle nematode tallet i F4-1-1-1 til F4-3-12-1, F3-1-1-4 til F3-3-12-4 agars og F3-1-1-5 til F3-3-12-5 brukes til å beregne den første gjengivelsen av F3.
36 (F2-1-1-9 til F2-3-12-9) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-15 til F0-3-12-15 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-6 til F3-3-12-6) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-12 til F1-3-12-12 agars har vokst for 1 d.
Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-9 til F2-3-12-9 agars har vokst for 1 d.
Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-6 til F2-3-12-6 agars har vokst for 1 d.
17 36 (F1-1-1-14 til F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15, fjernet etter opptelling, over) Avkommet nematoder av F0 på F0-1-1-15 til F0-3-12-15 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter at nematoder telles. Det blir ikke mer F0 avkom.
36 (F2-1-1-11 til F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 til F1-3-12-12, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-12 til F1-3-12-12 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-8 til F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 til F2-3-12-9, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-9 til F2-3-12-9 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-6 til F3-3-12-6, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-6 til F3-3-12-6-agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F1-1-1-13 til F1-3-12-13) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-13 til F1-3-12-13 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-10 til F2-3-12-10) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-10 til F2-3-12-10 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-7 til F3-3-12-7) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-7 til F2-3-12-7 agars har vokst for 1 d.
18 36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 til F1-3-12-13, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-13 til F1-3-12-13 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-12 til F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 til F2-3-12-10, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-10 til F2-3-12-10 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-9 til F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 til F3-3-12-7, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-7 til F3-3-12-7-agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F1-1-1-14 til F1-3-12-14) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-14 til F1-3-12-14 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-11 til F2-3-12-11) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-11 til F2-3-12-11 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-8 til F3-3-12-8) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-8 til F2-3-12-8 agars har vokst for 1 d.
I MGR studier, T2 ' vil begynne å reprodusere T3 ' i dag. Levetiden av vill type C. elegans er exampled som 15 dager. Deretter vil avslutningen av T3 ' levetid være på D33.
19 36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15, over) 36 (F1-1-1-14 til F1-3-12-14, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-14 til F1-3-12-14 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-13 til F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 til F2-3-12-11, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-11 til F2-3-12-11 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-10 til F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 til F3-3-12-8, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-8 til F3-3-12-8-agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15) Avkommet nematoder av F1 på F1-1-1-15 til F1-3-12-15 agars har vokst for 1 d.
36 (F2-1-1-12 til F2-3-12-12) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-12 til F2-3-12-12 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-9 til F3-3-12-9) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-9 til F2-3-12-9 agars har vokst for 1 d.
20 36 (F2-1-1-14 til F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F1 på F1-1-1-14 til F1-3-12-14 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter nematoder telles. Det vil ikke mer F1 avkom.
36 (F3-1-1-11 til F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 til F2-3-12-12, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-12 til F2-3-12-12 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-9 til F3-3-12-9, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-9 til F3-3-12-9-agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F2-1-1-13 til F2-3-12-13) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-13 til F2-3-12-13 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-10 til F3-3-12-10) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-10 til F2-3-12-10 agars har vokst for 1 d.
21 36 (F2-1-1-15 til F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 til F2-3-12-13, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-13 til F2-3-12-13 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-12 til F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 til F3-3-12-10, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-10 til F3-3-12-10 agars har vokst for 2 d, og agars tømmes etter nematoder telles.
36 (F2-1-1-14 til F2-3-12-14) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-14 til F2-3-12-14 agars har vokst for 1 d.
36 (F3-1-1-11 til F3-3-12-11) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-11 til F2-3-12-11 agars har vokst for 1 d.
22 36 (F2-1-1-15 til F2-3-12-15, over) 36 (F2-1-1-14 til F2-3-12-14, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-14 til F2-3-12-14 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles.
36 (F3-1-1-13 til F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 til F3-3-12-11, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-11 til F3-3-12-11 agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F3-1-1-12 til F3-3-12-12) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-12 til F2-3-12-12 agars har vokst for 1 d.
23 36 (F3-1-1-14 til F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 til F2-3-12-15, fjernet etter opptelling) Avkommet nematoder av F2 på F2-1-1-15 til F2-3-12-15 agars har vokst for 2 d, og agars er ryddet etter nematoder telles. Det blir ikke mer F2 avkom.
36 (F3-1-1-12 til F3-3-12-12, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-12 til F3-3-12-12 agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F3-1-1-13 til F3-3-12-13) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-13 til F2-3-12-13 agars har vokst for 1 d.
24 36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 til F3-3-12-13, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-13 til F3-3-12-13 agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F3-1-1-14 til F3-3-12-14) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-14 til F2-3-12-14 agars har vokst for 1 d.
25 36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15, over) 36 (F3-1-1-14 til F3-3-12-14, fjernet etter opptelling) Avkom-nematoder på F3 på F3-1-1-14 til F3-3-12-14 agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15) Avkommet nematoder av F3 på F3-1-1-15 til F2-3-12-15 agars har vokst for 1 d.
26 36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15, fjernet etter opptelling) Avkom nematoder av F3 på F3-1-1-15 til F3-3-12-15 agars har vokst for 2 d, og agars fjernes etter at nematoder er talt.
I MGR-studiene ville den første ikke-eksponerte avkom av F3 (dvs. T3 ') bli født på D18. Levetiden av vill type C. elegans er exampled som 15 dager. Deretter vil avslutningen av T3 ' levetid være på D33.
Både MGE-og MGR-studiene vil dekke flere dager når nematode levetid er lengre.

Tabell 1: liste over markører og definisjonene deres.

  1. Mål reproduksjon og levetid i MGE effekt studier.
    1. På D0 gjentar du trinn 5,6. Merk agars (3 grupper med 10 replikeres i hver) som Fx-a-b-c, der x refererer til genererings nummer , refererer til gruppenummeret (1 for kontroll, 2 for den lave konsentrasjonen og 3 for den høye konsentrasjonen ); b refererer til replikere fra 1 til 10; og c refererer til eksponerings varigheten (0 indikerer Start). For D0 merker du agars som F0-1-1-0 til F0-3-10-0. Lesere kan referere til tabell 1 for detaljert informasjon.
    2. På D1, sjekk nematode vekst på agars, og endre markører fra F0-1-1-0 til F0-3-10-0 til F0-1-1-1 til F0-3-10-1.
    3. På D2, sjekk nematode vekst på agars, og endre markører F0-1-1-2 til F0-3-10-2.
    4. Opp på D3, hakke 24 F0 nematoder fra hver gruppe onto 12 ny NGM agars med to NGM agar fra steg 5,4. Merk agars som F0-1-1-3 til F0-3-12-3.
    5. På D4 overfører du de to overordnede nematoder fra F0-1-1-3 til F0-3-12-3 ved å plukke inn nye NGM-agars fra trinn 5,4. Merk den nye NGM agars som F0-1-1-4 til F0-3-12-4. Endre markører for F0-1-1-3 til F0-3-12-3 til F1-1-1-1 til F1-3-12-1 for å representere avkom av F0 (dvs. F1) innen den første dagen siden F0 begynner å reprodusere.
    6. På D5 bruker du et dissekere mikroskop til å telle nematoder på F1-1-1-1 til F1-3-12-1-agars der nematoder har vokst 2 dager. Tillat F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agars å reprodusere F2 for etterfølgende generasjoner.
    7. Overfør de to overordnede nematoder fra F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agars ved å plukke inn nye NGM-agars fra trinn 5,4. Merk NGM agars som F0-1-1-5 til F0-3-12-5. Endre merker av F0-1-1-4 til F0-3-12-4 til F1-1-1-2 til F1-3-12-2 for å representere avkom av F0 (dvs. F1) innen den andre dagen siden F0 begynner å reprodusere.
    8. På D6, Tell nematoder på F1-1-1-2 til F1-3-12-2 agars. Overfør den overordnede nematoder fra F0-1-1-5 til F0-3-12-5 agars til F0-1-1-6 til F0-3-12-6. Endre markører for F0-1-1-5 til F0-3-12-5 til F1-1-1-3 til F1-3-12-3 for å representere avkom av F0 (dvs. F1) innen den tredje dagen siden F0 begynner å reprodusere.
    9. Nematoder på F1-1-1-1 til F1-3-12-1-agars har vokst i 3 dager. Bruk dem til å reprodusere F2 i etterfølgende MGE effekt studier. På samme måte bruker du F2-nematoder til å reprodusere F3 for å fortsette MGE.
    10. Gjennom samme måte, overføre de to foreldre nematoder daglig og telle avkom nematoder neste dag, inntil den overordnede nematoder i 6 NGM agars (dvs. halvparten av den totale agars i hver gruppe) stoppe reproduksjon.
    11. Beregn totalt avkom tall over hele reproduksjon varighet som totalt kullstørrelse. Bruk avkom nummer innen de første 3 dagene til å representere den opprinnelige gjengivelsen av foreldrene.
    12. Bruk dagen når den overordnede nematode gjengivelsen stopper i 6 NGM-agars for å beregne reproduksjons varigheten. Bruk dagene som hver enkelt forelder har overlevd som levetid.
    13. Få den første reproduksjon, reproduksjon varighet, totalt kullstørrelse og levetid på F1 på samme måte som gjort for F0. Tilsvarende, ved å gjenta de nevnte prosedyre, reproduksjon og levetid informasjon av F2 (til FN) kan fås.
  2. Mål reproduksjon og levetid i MGR effekt studier.
    1. Utfør trinn-7.2.4 med NGM-agars fra trinn 5,4 endret til de fra trinn 2,13.
  3. Mål biokjemiske indekser.
    1. Skyll nematoder av NGM-agars med sterilt vann og samle dem i sentrifugerør. Bosette nematoder i 30 min og forkaste supernatanter. Bruk nematoder i pellets for effekt måling.
    2. Tilsett 1 mL iskald fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7,0) i nematoder (pellets) i 1,5 mL sentrifuge rørene for å vaske nematoder.
    3. Sentrifuger på 10 000 x g i 5 min ved 4 ° c, og kast forsiktig supernatanter med en pipette.
    4. Smekk fryse pellets med flytende nitrogen eller i en-80 ° c fryser.
    5. Homogenisere pellets ved hjelp av støtere i et is bad. Bruk 200 μL iskald PBS til å vaske resterende væsker på morter i sentrifuge røret før du tar ut morter.
    6. Sentrifuger på 10 000 x g i 5 min ved 4 ° c igjen, og bruk supernatanter for å bestemme aktivitetene eller mengdene av Biochemicals med de kommersielle settene (se tabell over materialer for detaljer).
    7. Mål mengdene av det totale proteinet (TP) i prøvene, og bruk resultatene som nevner i å representere andre biokjemiske indikatorer, slik at forskjellen mellom nematode tall blant prøvene kan elimineres.
  4. Mål genuttrykk.
    1. Gjenta trinn 7.4.1 til 7.4.4. Isoler den totale RNA-en fra nematode-prøvene ved hjelp av et kommersielt RNA-avsugs sett (se tabell over materialer for detaljer) i henhold til produsentens anvisninger21.
    2. Bruk RNA-en til å syntetisere cDNA i henhold til produsentens anvisninger21.
    3. Analyser cDNA-prøven i sann tids polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) ved hjelp av SYBR Green RT-PCR-sett i henhold til produsentens instruksjoner (se tabell over materialer)21.
    4. Kvantifisere det relative uttrykket nivåer av de valgte genene ved 2-ΔΔCT metode22, og behandle uttrykket nivåer av BNP-2 (eller andre referanse genet) som negativ referanse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi protokoller for å studere effekter av kjemikalier over generasjoner ved hjelp av C. elegans i trans-generasjons (TG), multi-generasjons eksponering (MGE) og multi-generasjons rest (Mgr) effekt studier. Våre egne forskningsresultater presenteres som eksempler. En studie presenterer TG-effektene av tungmetaller på bevegelse adferd3. De to andre studiene presenterer MGE og MGR effekter av sulfomethoxazole og lindan på reproduksjon og biokjemiske og genetiske indekser målinger4,14.

Vs virkninger av tungmetaller på bevegelse av C. elegans

Den TG effekter av kadmium (CD), kobber (Cu), bly (Pb) og sink (Zn) på kroppen bøying frekvens (BBF) ble studert i nematode foreldre (F0) etter mors eksponering og deres avkom (T1)3. Virkningene av metaller på BBF viste at hemninger i T1 var større enn i F0, demonstrere mer alvorlig toksisitet av tungmetaller på bevegelse atferd i fosteret eksponert avkom enn i direkte eksponert forelder. TG-effektene av tungmetaller ved miljømessig realistiske konsentrasjoner viste at mors eksponering kan multiplisere farene ved tungmetall forurensning i etterfølgende generasjoner. Se figur 1.

Figure 1
Figur 1 : Effekten av kadmium (CD), kobber (Cu), bly (Pb) og sink (Zn) på kroppen bøying frekvensen av nematode forelder (F0, blank) etter prenatal eksponering og deres avkom (T1, skyggelagt). Feil linje = standard feil; * = signifikant forskjellig fra kontrollen, p < 0,05; # = signifikant forskjellig fra den nedre konsentrasjon, p < 0,05; + innebærer signifikant forskjellige effekter i F1 enn i F0, p < 0,05. Dette tallet har blitt modifisert fra Yu et al.3 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MGR effekter av Sulfamethoxazole (SMX) på nematode levetid og reproduksjon

MGR-virkningene av Sulfamethoxazole (SMX) på nematode levetid og reproduksjon14 ble studert på gestating forelder (F0), embryo eksponert avkom (T1), germline avkom (T2), den første ikke-eksponerte avkom (T3) og de tre følgende generasjoner (T4-T6). Resultatene viste at reproduksjon (totalt kullstørrelse som 49% av kontrollen) ble signifikant påvirket i germline eksponering (T2), og toksisitet fortsatte i ikke-eksponerte generasjoner fra T3 til T6 generasjoner (figur 2). Våre funn hevet nye bekymringer om langsiktige påvirkninger av antibiotika selv foruten deres effekter på antibiotikaresistens.

Figure 2
Figur 2 : Kullstørrelse (i (A), uttrykt i prosent av kontroll) og innledende reproduksjon (i (B)) av C. elegans i eksponert forelder og dens avkom (F0, T1 til T6, fra venstre til høyre ved hver konsentrasjon). Feil linje = standard feil; a = signifikant forskjellig fra kontrollen ved ANOVA (p < 0,05); b = signifikant forskjellig fra kontrollen og fra den tidligere generasjonen ved samme konsentrasjon (p < 0,05); c = signifikant forskjellig fra kontroll og fra den nedre konsentrasjon i samme generasjon (p < 0,05); d = signifikant forskjellig fra kontroll og fra den tidligere generasjonen ved samme konsentrasjon og den nedre konsentrasjon i samme generasjon (p < 0,05); e = signifikant forskjellig fra den tidligere generasjonen ved samme konsentrasjon og den lavere konsentrasjonen i samme generasjon (p < 0,05); f = signifikant forskjellig fra den tidligere generasjonen ved samme konsentrasjon (p < 0,05). Dette tallet har blitt modifisert fra Yu et al.14 med tillatelse.

MGE og MGR effekter av lindan på nematode biokjemiske og genetiske indekser

Den MGE og MGR effekter av lindan (en vedvarende organisk forurensende [POP]) ble studert på viktige Biochemicals i lipid metabolisms og genetiske uttrykket endringer i relaterte insulin-lignende Pathway4. Resultatene viste at lindan viste obesogenic effekter med forstyrrelser i insulin signal reguleringen (Figur 3). Videre, endringene mellom SGK-1 (F0, F3, T1 ' og T3 ') og akt-1 (T1 og T3) signalering indikerte at nematoder fra ulike eksponering generasjoner viste ulike respons strategier for toleranse og unngåelse.

Figure 3
Figur 3 : Endringer i uttrykks nivåer av nøkkel gener i insulin-lignende signal sti i nematoder med ulike eksponerings erfaringer. →: positiv regulering; symbol : negativ regulering; : Expression opp-regulering; : uttrykk ned-regulering. Dette tallet har blitt modifisert fra Chen på Al.4 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å kunne gjennomføre den beskrevne protokollen, bør følgende forslag tas i betraktning. Utfør de generelle eksperimentelle operasjonene i et sterilt miljø. Feilaktig drift kan føre til forurensning av E. coli stammer, f. eks, sopp og midd kan hindre normal vekst av C. elegans og derfor påvirker de eksperimentelle resultater. I avsnittet beskriver dyrking c. elegans, observere vekst skalaen av c. elegans på NGM agars av nakne øyne eller mikroskop. Når skalaen av C. elegans på agar overstiger 75% i området, eller kulturen tiden overstiger en uke, utføre en ny runde med inoculation å unngå over-vekst eller befolkning nedgang på C. elegans. Før prosessen med synkroniseringen, bruk et mikroskop for å observere veksten av C. elegans, og fortsette prosessen når nematode egg er allment distribuert på agar. I tillegg, hvis løsemidler (f.eks. dimethyl sulfoxide [DMSO]) brukes, bør deres konsentrasjoner i lager løsningene være lavere enn 1% for å sikre at deres endelige konsentrasjoner ikke overstiger 0,5% (v/v) for å unngå de negative virkningene av løsemidler selv. I TG effekt studier, varigheten av eksponering over 24 h er nødvendig for å sikre at eksponeringstiden dekker embryo dannelse av neste generasjon, og varigheten skal være innen 96 h til rette for påfølgende generasjon separasjon. Bruk små mengder nematoder (vanligvis innen 20) for måling av levetid og reproduksjon. På den annen side, bruk store mengder nematoder (vanligvis mer enn 500) for å måle biokjemiske og genetisk regulering indekser. Derfor, for å sikre tilstrekkelig antall prøver, utføre foreløpige eksperimenter for å grovt anslå hvor mange avkom de modne F0 nematoder kan reprodusere i løpet av de første 24 h siden de starter reproduksjon. Deretter bestemme antall F0 nematoder kreves for å sikre at det er minst 200 avkom for den fortsetter multi-generasjons studier.

Sammenlignet med tidligere rapporter om TG-studier med C. elegans, var den nåværende eksperimentelle protokollen mer hensynsfull over valg av livs fase. I C. elegans, sperms dannes på L4 scenen for å gjødsle den senere dannet oocytter23. Følgelig vil eksponeringen som dekker spermiogenesis og oocytogenesis perioden gi et bestemt vindu for å studere TG-effektene på avkommet. Den alder-synkroniserte egg brukes for multi-generasjons effekt studier for å sikre at eksponeringen dekker den totale perioden fra begynnelsen av hver livssyklus. Sammenlignet med tidligere multi-generasjons studier, den nåværende eksperimentelle protokollen muliggjort måling av effekter over flere generasjoner i stedet for bare 1-2 generasjoner. I tillegg vurderte den nåværende protokollen både MGE-og MGR-effekter, som er mer systematiske enn tidligere studier som bare målte MGE-eller MGR-effekter.

Spesielt er det fortsatt noen problemer som skal vurderes i dagens eksperimentelle protokollen. Den nåværende protokollen bruker vill-type C. elegans hvis generasjonstid er rundt 60 h og levetid er 20 dager. Dette gjør den totale varigheten av eksperimentet ganske lang (f. eks, MGE effekter studie på levetid over 3 generasjoner krever minst 30 dager). For å forkorte tiden, kan forskerne velge mutant C. elegans, slik som kortvarig mutant nematoder. Et annet problem er drapet behandling på bakterier, er live status som er nødvendig for å holde nematoder sunn 24. Også, UV-drapet prosessen kan innføre endringer i kjemikaliene25. Derfor bør andre behandlinger på bakteriene vurderes, og nøye overvåking av kjemiske endringer i løpet av forberedelsene eller eksponerings prosessen kan være nødvendig, spesielt for ustabile forbindelser. På samme tid, det er begrensninger i å studere sex forskjellene i toksiske effekter fordi det meste av det faktum at C. elegans er Hermafroditt. Ytterligere forbedringer for å undersøke sex bidraget i TG-, MGE-eller MGR-effektene er nødvendig. Oppsummert forventer vi at den foreslåtte protokollen vil være stor betydning for bruk av C. elegans for å studere TG, MGE og MGR effekter av toxicants.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne er takknemlige for de økonomiske støtte av National Science and Technology Major Project for vannforurensning kontroll og behandling (2017ZX07201004), og International Science & Technology samarbeid program of China (no. 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53, (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106, (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23, (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11, (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89, (3), 1574-1582 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics