Fabrikasjon og implementering av en referanse-fri traction Force mikroskopi plattform

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen gir instruksjoner for gjennomføring multiphoton litografi å dikte tredimensjonale arrays av fluorescerende fiducial markører innebygd i Poly (etylen glykol)-basert hydrogeler for bruk som referanse-fri, traction Force mikroskopi Plattformer. Ved hjelp av disse instruksjonene, måling av 3D-materiale belastning og beregning av cellulære tractions er forenklet for å fremme høy gjennomstrømming traction Force målinger.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantifisere celle-indusert materiale deformasjon gir nyttig informasjon om hvordan cellene forstand og svare på de fysiske egenskapene til deres mikromiljøet. Mens mange tilnærminger finnes for å måle celle-indusert materiale belastning, her gir vi en metodikk for overvåking stamme med sub-mikron oppløsning i en referanse-fri måte. Ved hjelp av en to-Foton aktivert photolithographic mønstre prosess, viser vi hvordan å generere mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske underlag som inneholder innebygde arrays av fluorescerende fiducial markører for enkelt å måle tredimensjonale ( 3D) materiale deformasjon profiler som svar på overflaten tractions. Ved hjelp av disse underlag, kan celle spennings profiler tilordnes ved hjelp av et enkelt 3D-bilde stabel av en celle av interesse. Vårt mål med denne metodikken er å gjøre traction Force mikroskopi en mer tilgjengelig og enklere å implementere verktøy for forskere som studerer cellulære mechanotransduction prosesser, spesielt nykommere til feltet.

Introduction

Traction Force mikroskopi (TFM) er prosessen med tilnærme mobilnettet tractions bruker interpolert forskyvning felt av fiducial markører generert av en tilhenger og kontraktile celle. Ved hjelp av TFM, påvirkning av mekaniske stikkordene i ekstracellulære miljø på viktige cellulære prosesser som spredning, differensiering, og migrasjon kan undersøkes1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Dessverre, mange eksisterende tilnærminger kan være vanskelig å gjennomføre eller krever kjennskap til høyt spesialiserte analytiske og beregningsorientert verktøy gjør TFM vanskelig for uerfarne forskere å bruke. Vi beskriver en metodikk for å generere en TFM-plattform som eliminerer noen av vanskelighetene i analysen, samtidig som det gir datainnhenting med høy gjennomstrømming.

Av de eksisterende TFM tilnærminger, den mest brukte for kvantifisere materielle belastningen innebærer inkorporering av små fluorescerende markører (vanligvis nano-eller mikrometer-sized fluorescerende perler) i en deformerbare hydrogel, for eksempel polyakrylamid (PAA) eller Poly (etylen glykol) diacrylate (PEGDA)13,14,15. Disse perle-baserte tilnærminger gir muligheten til tett klynge fiducial markører rundt en celle av interesse for å maksimere forskyvning prøvetaking. Dessverre kan fordelingen av perlene i hele hydrogel ikke styres direkte, slik at den romlige organisasjonen er tilfeldig. Denne tilfeldige plassering fører til problemer som perler som er for nær hverandre for å nøyaktig løse, eller så spredt at flekker av underlaget gir lav kvalitet data. Manglende evne til å forutsi hvor fiducial markører ligger i fravær av celler skaper også en begrensning som, for hvert samlet sett av celle trekkraft data, en ekstra referanse bilde av de underliggende markører i en avslappet tilstand må også fanges. Referansen bildet er nødvendig slik at forskyvning i stresset bildet kan anslås som forskjellen mellom stresset og trykklette bilder. For å oppnå en avslappet tilstand, cellene som måles er enten kjemisk avslappet eller helt fjernet. Denne prosessen hindrer ofte anskaffelse av ytterligere eksperimentelle målinger, hemmer langsiktige celle studier, og begrenser gjennomstrømming. En referanse bildet krever også bilde registrering teknikker for å imøtekomme for drift som kan ha skjedd under eksperimentering, ofte fører til tungvint manuell Matching av stress tilstand bilder til referanse bilder.

Andre TFM metoder anses referanse-fri, implementere noen form for kontroll over fordelingen av fiducial markører, enten ved høy oppløsning litografi, microcontact utskrift, eller micromolding16,17,18 ,19,20. Referanse-Free TFM oppnås gjennom antagelsen om at avslappet tilstand for hver fiducial markør kan anslås basert på hvordan markør posisjoner ble foreskrevet under fabrikasjon prosessen. Disse metodene gir mulighet for fullstendig fangst av en celle spennings tilstand innenfor et enkelt bilde fangst der fiducial markør forskyvninger måles i forhold til en underforstått referanse enn det som kan utledes fra fiducial markør geometri. Mens konsistens i markørplassering er vanligvis oppnås ved hjelp av disse plattformene, de vanligvis lider av sine egne svakheter i forhold til de mye brukte perle-baserte tilnærminger inkludert: 1) redusert trekkraft oppløsning; 2) redusert nøyaktigheten av ut-av-flyet forskyvninger (i noen tilfeller en fullstendig manglende evne til å måle); og 3) nedsatt customizability av plattform underlag og materialer (f.eks. ligand presentasjon, mekaniske egenskaper).

For å løse disse svakhetene, utviklet vi en ny referanse-fri TFM-plattform. Plattformen benytter multiphoton aktivert kjemi for å krysskobling et lite volum av en fluoroforen i bestemte 3D steder innenfor hydrogel som fungerer som fiducial markører for å måle materielle belastninger. På denne måten har vi designet en plattform som opererer på samme måte som perle-baserte tilnærminger, men med den betydelige fordelen at fiducial markører er organisert i gridded arrays slik at referanse-fri materiale belastning sporing. Dette referanse-fri eiendom gir mange fordeler. Først og fremst gir det for ikke-påtrengende overvåking av cellulære trekkraft tilstander (dvs. omgår behovet for å slappe av eller fjerne celler for å erverve referanse posisjoner av fordrevne fiducial markører). Dette var vårt primære mål i utformingen av dette systemet, som vi hadde til hensikt å innlemme andre nedstrøms analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskelig med destruktive endepunkt TFM tilnærminger. For det andre, ved hjelp av en underforstått referanse basert på gridded arrays tillater nesten komplett automatisering av forskyvning analyse. Den regularitet av arrays skaper en forutsigbar arbeidsflyt der forekomsten av eksepsjonelle tilfeller (dvs. eksempel celledata som inneholder uventede gjenstander som suboptimal markør avstand eller registrering uoverensstemmelser) kan opprettholdes på et minimum. For det tredje, avkall behovet for å erverve en referanse bilde gir frihet til å overvåke mange celler på en enkelt prøve over lengre perioder av gangen. Dette står i kontrast til tradisjonelle perle-baserte tilnærminger, der, avhengig av troskap til mikroskopet automatiserte etappe bevegelser, feil i posisjonering kan akkumulere og øke vanskeligheten av riktig å registrere referanse bilder til celle spenning Bilder. Overall, forenkler denne plattformen høyere gjennomstrømming i å samle mobilnettet spennings data.

Med denne protokollen, håper vi å bli kjent med leserne med to-Foton, laserskanning litografi teknikk som vi implementert for å generere denne referansen-fri TFM plattform for å måle i-fly og ut-av-flyet trekkraft komponenter generert av celler seeded på overflaten. Ikke dekket i denne protokollen er syntesen av noen av de monomere komponentene. Generelt, disse reaksjonene inkluderer nesten identiske "en-pott" syntese reaksjons ordninger beskrevet tidligere21, og alternativer til disse produktene kan også kjøpes. Vi har også som mål å gjøre leserne kjent med programvarebasert verktøy vi genererte for å fremme bruken av kommersielt tilgjengelige laser-skanning mikroskop som 3D-utskrift verktøy og for å lette analysen av fiducial markør forskyvninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Photopolymerizing en PEGDA base hydrogel

  1. Samle reagenser
    1. Samle Lithium fenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3,4 kDa Poly (etylen) glykol diacrylate (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 merket PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 merket PEGDA (PEG-633), og pegylert RGDS peptid ( PEG-RGDS) fra sine respektive frysere og bringe hver til romtemperatur.
    2. I separate rav mikrosentrifugen rør, måle 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, og 6 mg RGDS peptid.
  2. Utarbeidelse av pre-polymer løsning
    1. Løs opp LAP i 1 mL fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7,4). Bruk 200 μL av den oppløste LAP-løsningen for å oppløse PEGDA. Bruk deretter 200 μL av PEGDA-løsningen for å oppløse PEG-RGDS.
      Merk: Hvis kontroll av celle form er ønskelig, Utelat oppløsning av PEG-RGDS i basen hydrogel pre-polymer løsning, som det vil bli lagt til via to-Foton, laserskanning litografi senere i protokollen.
    2. Bruk 80 μL av PBS til å oppløse PEG-488. Tilsett 2,5 μL av denne løsningen til pre-polymer-løsningen.
      Merk: PEG-488 vil gi den endelige hydrogel et fluorescerende signal som kan brukes til å navigere under mønsteret, og konsentrasjonen kan endres for å endre signal intensiteten.
    3. Filtrer den komplette pre-polymer-løsningen gjennom et polytetrafluoretylen-filter på 0,2 μm (PTFE) for å fjerne partikler som kan være til stede i løsningen. Hvis reaktantene er riktig syntetisert, bør filteret ikke bli tilstoppet.
  3. Photopolymerizing basen hydrogel
    1. Plasser 3 μL av pre-polymer-løsningen på et tynt flatt ark med perfluoroalkoxy alkaner (PFA). Plasser flatt 150 μm tykke Polydimethylsiloxan (PDMS) strimler rundt, men ikke i kontakt med, dråpe pre-polymer løsning. Plasser en akrylat-silanized dekkglass21,22,23,24 på PDMS-med pre-polymer dråpe sentrert under dekkglass-for å flate den pre-polymer dråpe til tykkelsen på PDMS avstandsstykker.
    2. Utsett den klemt pre-polymer-løsningen for UV-lys til en hydrogel er fullt dannet (ca. 1 min ved 14 mW/cm2 av 370-400nm lys).
    3. Forsiktig skille dekkglass fra PDMS avstandsstykker og feste til en åpen-Bottom Petri parabolen ved hjelp av høy ytelse, dobbeltsidig akryl lim. Påfør press på limet kontaktflaten for å skape en komplett forsegling mellom dekkglass, lim, og Petri parabolen-med forsiktighet for ikke å knekke glasset.
    4. Skyll hydrogel i Petri-parabolen med steril-filtrert PBS for å minimere biologiske og partikler forurensninger.
    5. Gjenta trinn 1.3.1-1.3.4 etter behov for å opprette ønsket antall hydrogeler.
    6. Tilsett 8 μL av NVP til de resterende 800 μL av LAP-løsning, og Oppbevar denne løsningen i tillegg til uoppløste PEG-633 til den er klar til å mønstre.
      Merk: LAP-løsningen med NVP er svært følsom for lys og vil polymeres hvis den ikke holdes i mørket. Innpakning røret i aluminiumsfolie kan bidra til å forbedre holdbarheten.

2. lage mønster instruksjoner

  1. Utforme et binært bilde
    1. For å opprette en virtuell maske for forskrivning av fiducial markør matriser, bruk bildebehandlings-eller tegneprogram vare for å lage et bilde med et størrelsesforhold på 100:1 (f.eks. 2000 piksler lang x 20 piksler bredt).
    2. Opprett en rad med 100 med jevnt fordelte hvite bildepunkter på en svart bakgrunn sentrert langs den lange aksen i bildet.
    3. Lagre dette bildet som en *. tif-filtype.
      Merk: Hvis kontroll av celle form er ønsket21,25,26,27,28, Opprett en ekstra virtuell maske. Bruk et firkantet bilde lerret og skape positive hvite funksjoner på en svart bakgrunn. For tilnærme en passende størrelse for de hvite funksjonene (som til slutt vil støtte celle vedheft) anta at den totale størrelsen på bildet tilsvarer størrelsen på mikroskopet er viewfield som brukes for laserskanning litografi.
  2. Konvertere et binært bilde til en digital maske
    1. Last ned LSM-ROI-generator funksjoner tilgjengelig gratis på programvaren depotet29.
    2. Åpne MATLAB og Finn katalogen av de nedlastede funksjons filene. En gang inne telefonkatalog, åpen det run_script. m MATLAB skriften og løpe manuskriptet.
    3. Velg den binære *. TIF-filen for konvertering. Deretter velger du en mappe for å lagre regions filer.
    4. Angi ønsket endelig størrelse, i mikron, for det valgte bildet. Inndatabildet vil bli skalert og dimensjonert for å matche disse parametrene. For at hele bildet skal passe inn i viewfield til mikroskopet, må den totale størrelsen på bildet være mindre enn eller lik størrelsen på mikroskopet viewfield.
    5. Hvis du oppretter en enkelt piksel array, i ROI-generator valg, sørg for å fjerne merket for Fjern av under små regioner/single pixels, for å sjekke av merket firkanter, og for å uncheck Bruk under Vannrette linjer. Deretter klikker du OK.
      Merk: Hvis du oppretter en regions fil for å opprette enkelt celle mønstre, er standardalternativene riktige.
    6. Finn den resulterende *. ovl-filen i den tidligere angitte mappen. Denne filen må bringes til mikroskopet for å laste de ønskede regionene som kontrollerer laser lukkeren under to-Foton laserskanning litografi.

3. fabrikere fiducial markør arrays

  1. Soaking basen hydrogel
    1. Under dårlige lysforhold, tilsett 200 μL av LAP/NVP-løsningen på AF633 (begge forberedt i trinn 1). Bland godt mens du beskytter mot lys.
    2. Fjern all PBS-løsning fra Petri-parabolen som inneholder en PEGDA-hydrogel fra trinn 1.
    3. Legg den oppløste PEG-633 til hydrogel for å danne en dråpe som fullstendig omfatter base hydrogel.
      Merk: Hvis hullet i Petri-fatet bare er litt større enn hydrogel, kan det fungere som en brønn for å holde mønster løsningen. Ellers må du passe på at dekkglass er helt tørr før du legger til mønster oppløsning, eller den kan renne av hydrogel forårsaker hydrogel til tørke under mønsteret.
    4. Legg inn Petri-parabolen på prøveholderen på mikroskopet og plasser lokket på Petri-parabolen. La mønster løsningen suge inn i hydrogel i minst 30 minutter i mørket.
      Merk: mikroskopet kan slås på og konfigureres i løpet av denne suge tiden. Ved hjelp av 488 NM laser til bildet hydrogel under soaking er fin.
  2. Konfigurering av mikroskopet
    1. Ved hjelp av en 488 NM laser linje og filtre som passer til bildet AlexaFluor 488, Finn hydrogel ved hjelp av PEG-488 signal. Block samling av lengre utslipps bølgelengder fra detektoren da disse vil bli mettet med signal fra PEG-633.
    2. Finn midten av hydrogel i XY flyet ved hjelp av vertikale og horisontale flis skanninger og null scenen posisjon her.
    3. Finn hydrogel overflate ved hjelp av linjeskanninger og z-stack-funksjonen. Null fokus posisjon her. Nivå hydrogel ved å gjenta disse linjeskanninger bort fra XY-senteret for å identifisere overflate posisjonen og justere sett skruene for mikroskop fasen.
    4. Opprett en separat eksperiment fil for photopatterning i arbeidsområdet for mikroskop. Sett multiphoton kraft til 1,8% (15,5 mW ved 740 NM målt ved bak blenderåpningen til målet), og skannehastigheten til 6 (0,1 μm/μs). Juster størrelsen på bilderammen i piksler for å oppnå en pikselstørrelse på 0,1 μm per piksel og et størrelsesforhold på 100:1.
    5. Last inn regions filen (*. ovl) som ble opprettet i trinn 2,2, i kategorien regioner. Bruk en makro til å angi at alle områder skal være anskaffet.
    6. Slå på z-stack-funksjonen og sett avstanden til 3,5 μm for en total dybde på 28 μm og totalt antall z-skiver av 9.
    7. Bruk stillings funksjonen til å angi bestemte steder på hydrogel der fiducial markør matriser skal photopatterned.
      Merk: z-plasseringen av disse stillingene vil diktere midtposisjonen til hver z-stabel; Når du plasserer posisjoner, sørg for at hver posisjon vil garantere at det mønstrede volumet vil overlappe med hydrogel på alle overflater.
    8. Bruk flis funksjonen til å angi flere rader og kolonner i hver posisjon. Pass på å unngå overlappende mønstrede områder. Ideelt sett må du sørge for at mønstrede områder er nær nok til å fjerne tomme og ubrukelige plasseringer mellom posisjonene.
  3. Photopatterning fiducial markør arrays
    1. Som suge tid nærmer seg 30 min merke, ta påfølgende z-stack linjeskanninger av overflaten av hydrogel hver 5 min for å se etter hevelse basert på endringer i plasseringen av overflaten i forhold til den nullstilt fokus posisjon.
    2. Hvis ingen endring i overflaten posisjon oppstår over en 5 min intervall, Last og kjøremønster innstillinger opprettet i trinn 3.2.4
    3. Når mønster eksperimentet er ferdig, bruker du 488 NM-laseren til å kontrollere at hydrogel overflate ikke beveger seg under mønsteret.
      Merk: Hvis hydrogel overflate ikke er i samme posisjon som før mønsteret, finnes det flere scenarier. Hydrogel hadde ikke nådd hevelse i likevekt før mønsteret, hydrogel begynte å tørke ut under mønsteret, eller mikroskopet opplevde z-drift. Kilden til denne overflate oversettelsen bør identifiseres og korrigeres i påfølgende mønster kjøringer.
    4. Fjern hydrogel fra mikroskopet og aspirer den PEG-633 løsningen fra Petri parabolen.
      Merk: hydrogel er fortsatt svært følsom for lys. Å holde hydrogel i mørket er svært viktig til all skylling er fullført.
    5. Skyll hydrogel 3 ganger med steril filtrert PBS, og pass på å fjerne rinsate mellom hver påfølgende skylling. Gjenta denne trippel skylle hver 15 min for 1 time.
    6. La hydrogel skylle i PBS over natten.
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
    7. Triple skylle hydrogel med PBS. Deretter raskt trippel skylle hydrogel med en 200-Proof etanol løsning, etterfulgt av en annen trippel skyll med PBS. Ikke la hydrogel å sitte i 200 bevis etanol i lengre perioder.
      Merk: noen komponenter av mønster løsningen kan krasje ut av oppløsning og sette inn på overflaten av hydrogel og vises som et solid lag av fluorescens (~ 1-5 mikron tykk) under 633 NM belysning. Skylling med 200 bevis etanol bør fjerne disse uønskede komponentene.
  4. Bruke påfølgende photopatterning til å generere enkelt celle mønstre (valgfritt)
    Merk: Hvis kontroll over celle spredningsområdet og formen er ønsket, kan flere runder med mønster utføres. Basen gel må ha PEG-RGDS utelatt fra sin opprinnelige formulering. Det anbefales at mønstre av fiducial markør arrays utføres sist for å unngå bleking av fluorescerende fiducial markører.
    1. Løs opp 20 mg PEG-RGDS i LAP/NVP-løsningen som er klargjort i trinn 1.
    2. Gjenta trinn 3,1 – 3,3 ved hjelp av PEG-RGDS-løsningen i stedet for PEG-633-løsningen. Bruk den aktuelle regions filen som definerer enkelt celle mønstrene (se trinn 2 for instruksjoner).
      Merk: for å visualisere arrays av PEG-RGDS mønstre, er det flere alternativer. En fluorescerende variant av Peg-RGDS kan brukes21,30 eller Peg-RGDS kan være dopet med fluorescerende pinne. Anbefalt: Alternativt kan 488 NM laser linje kjøres i tandem med multiphoton mønster laser å bleke PEG-488 signal i basen hydrogel, skape ikke-fluorescerende regioner som sammenfaller med RGDS innlemmelse.

4. visualisere fiducial markør arrays

  1. Anskaffe en z-stack bilde av fabrikkert array
    1. Erstatt PBS i Petri parabolen med cellen medier som brukes for cellekultur.
      Merk: fenol rød ledig Media anbefales for bruk under bilde oppkjøpet å hindre Phototoksisitet.
    2. Etter 1 h av suge tid, bruk en widefield fluorescens mikroskop utstyrt med en strukturert belysning modul og en høy-forstørrelse vann nedsenking objektiv linse for å visualisere hydrogeler bruke et filter sett hensiktsmessig for fluorescerende fiducial markører.
    3. Samle en høyoppløselig z-stabel med bilder (linjeavstand 0,4 μm i Z) som omfatter minst 20 μm dybde fra overflaten av hydrogel inn i hydrogel i mønstret område, noe som gjør at den øvre grensen av z-stakken inneholder minst 1-2 bilder fysisk over mønstret område (dvs. hvor de fluorescerende fiducial markørene ikke lenger er synlige og bare støy er til stede).
      Merk: anskaffelse av denne bildes takken er nødvendig for å verifisere at alle mønster parametre er korrekte og kan analyseres sammen med celledata i trinn 5,3.

5. utføre TFM ved hjelp av photopatterned hydrogeler

  1. Seeding celler
    Merk: for å opprettholde sterilitet, følg alle standard vevs kultur praksis.
    1. Før celle seeding følger du standardprotokollene for den respektive cellelinjen for cellekultur og vedlikehold.
    2. Valgfritt Hvis sterilitet av hydrogel er en bekymring, ruge den hydrogel for 24 h i Media som inneholder antibiotika etterfulgt av skylling med normale medier.
    3. Til frø celler, først re-suspendere trypsinized celler i det endelige volumet av medier som skal brukes i hydrogel Petri parabolen.
    4. Fjern all løsning fra hydrogel parabolen og erstatte med celle-Laden Media.
    5. La hydrogel sitte uforstyrret i celle-Laden Media i 10 min.
    6. Forsiktig flytte Petri parabolen til en inkubator. Oppretthold cellene i inkubator for 4 h eller til cellene er synlig overholdt.
    7. Erstatt celle Laden medier med celle frie medier for å fjerne unadhered celler.
  2. Anskaffe bilder av celler og fiducial markører
    1. Still inn temperaturen for inkubasjons kammeret på mikroskopet til 37 ° c og CO2 til 5% og la kammeret for å nå de innstilte punktene.
    2. Plasser Petri parabolen på prøve holderen og Finn de mønstrede områdene.
    3. Finn en celle av interesse (COI) og få et overført eller fluorescerende bilde av COI.
      Merk: dette bildet vil bli brukt til å segmentere cellegrensen under analyse, slik at bildet skal tydelig visualisere cellen snøbrettkjørere.
    4. Anskaffe en z-stabel av mønstret matrise under COI som i trinn 4.1.4.
    5. Skaff deg et ekstra sett med overførte eller fluorescerende bilder av cellen.
      Merk: Sammenlign det andre bildet satt til den første for å avgjøre om cellen skade på grunn av Phototoksisitet er observert og om bildet oppkjøpet innstillingene må justeres. Celler som krymper etter eksponering har sannsynligvis lidd betydelige fototoksisk effekter, noe som kan påvirke resultatene.
    6. Gjenta trinn 5.2.3-5.2.5 for hver COI.

6. analysere bilder

  1. Utarbeidelse av bildefiler for analyse
    1. Bruk data som er samlet inn i trinn 5,2, til å klargjøre en beskåret bildestakk for området rundt en COI slik at det nederste bildet (første bilde) av stabelen representerer det første bildet der: (1) > 80% av de mønstrede markerings kolonnene er synlige, (2) det øverste bildet (siste bilde) i bunken inneholder ikke lenger noen synlige fiducial markører (dvs. over hydrogel overflate), og (3) det er minst 20 μm av ikke-stresset fiducial markører rundt COI.
      Merk: beskjæring av bildene reduserer beregningstiden betraktelig under analysen. Analysekoden i senere trinn kan kjøres uten å beskjære bildene, men dette anbefales ikke.
    2. Lag et beskåret bilde av det overførte og/eller fluorescerende bildet slik at det samsvarer med XY-beskjæring av stabelen i forrige trinn.
    3. Bruk enten beskåret overført eller fluorescerende bilde-avhengig av hva som er mer representativt for celle form-å segmentere bildet for hånd (spore cellegrensen) eller via bildebehandling verktøy.
    4. Konvertere dette bildet til et binært bilde der det indre av cellen er svart (dvs. intensitet = 0) og området rundt cellen er hvit (dvs. intensitet ≠ 0). Lagre dette bildet som binær maske. tif.
    5. For hver COI, samle bildet stabelen filen, overført bildefil, og binær maske fil i en enkelt mappe.
  2. Kjører analyse skript på bildene
    1. Klon eller laste ned TFM analysefunksjoner tilgjengelig gratis på programvaren depotet29. Hele depotet skal lastes ned som det er et betydelig antall avhengigheter i undermappene.
    2. Åpne MATLAB og legge til katalogen og alle undermapper av den lokale klone av koden depotet til banen.
    3. Angi mappen i MATLAB-arbeidsområdet til mappeplasseringen der de klargjorte bildene i trinn 6,1 ble lagret.
    4. Åpne og Kjør skriptet Tracking. m . Når du blir bedt om det, følger du instruksjonene for å laste inn de riktige bildene, utføre innledende forhånds behandlingstrinn og feil-kontrollere algoritmen for objekt sporing.
    5. Når skriptet er fullført, åpne og kjøre dispShear. m -funksjonen. Dette skriptet må ikke kreve inn data fra brukeren.
    6. En gang det dispShear. m skriften har fullført, åpen og løpe disp3D. m. Følg instruksjonene hvis du blir bedt om å åpne bilder.
      Merk: under kjøring kan skriptet be brukeren om å tegne en linje på et bilde av den mønstrede matrisen. Denne linjen skal representere den primære bevegelses aksen til skanne laseren under mønsteret og bør line-opp med en rad med mønstrede fiducial markører. Denne prosessen instruerer koden om hvilken retning (dvs. rader eller kolonner av fiducial markører) sannsynligvis gir de mest justerte rader av fiducial markører.
    7. Når dispShear. m- koden er fullført, kjører du koden dispSurface. m etterfulgt av koden interpFinal3D_2. m . Disse skriptene bør ikke kreve inn data fra brukeren.
      Merk: interpFinal3D_2. m- skriptet konverterer Forskyvnings data til overflate tractions ved hjelp av programvare som er innhentet eksternt, som tidligere er beskrevet31. Hvis du vil bruke disse eksterne funksjonene, kan interpFinal3D_2. m interpolerer Forskyvnings data i ensartede rutenett for å tjene som inn data for konverterings funksjonene. Hvis du bruker en annen konverteringsmetode, eller hvis tractions ikke er nødvendig, kan du hoppe over dette trinnet.
    8. Når alle skriptene er kjørt, må du kontrollere at alle data og utganger finnes i den første katalogen.
    9. Gjenta trinn 6.2.3 – 6.2.8 for hver COI.
      Merk: innenfor koden depotet, er det en mappe som inneholder skript som tillater automatisk batch kjøring av hver av skriptene på en liste over kataloger. Se automatiserings skriptene selv (dvs. kommentarer i koden) for instruksjoner om hvordan du bruker dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gjennom hele protokollen er det en rekke sjekkpunkter som gir tilbakemelding for å vurdere kvaliteten på mønster prosedyren. For å gi innsikt om hvordan man vurderer fremdriften ved hvert av disse kontrollpunktene, gir vi representative resultater for et eksperiment. Resultatene markere anvendelsen av denne protokollen utført på en photopatterned hydrogel forberedt på TFM analyse av menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs). Resultatene inkluderer rå bildedata i tillegg til behandlede data utganger i hvert kritiske trinn.

Det første kontrollpunktet oppstår i trinn 4, når fiducial markør matrise er photopatterned i hydrogel. Når du samler inn en bildestakk, skal de resulterende bildene vise en vanlig rekke mønstrede funksjoner (figur 1a-C) som svinge i intensitet som en funksjon av z-posisjon i bildes takken. Hvis mønstret overflate ikke var perfekt nivå, ulike regioner av hvert bilde skive kan virke ut av fase med hverandre med hensyn til disse svingninger; Dette er forventet og bør ikke påvirke analyse unntatt i ekstreme tilfeller.

De resterende sjekkpunkter bruke utganger fra hver av skriptene kjøres under analyse av en gitt COI. Skriptet Tracking. m inneholder flere diagnostiske bilder, inkludert en z-projeksjon av fluorescerende fiducial markører (figur 2a) for å vurdere pre-prosessering kvalitet, en tomt på oppdaget centroids fargekodet som en funksjon av z-posisjon ( Figur 2B) for å vurdere kvaliteten på objekt gjenkjenningen, og et plott med spor som representerer oppdagede markør centroids som er koblet til kolonner i z-retningen (figur 2C) for å vurdere kvaliteten på objekt sporingen.

For nøyaktig 3D centroid deteksjon nødvendig for å beregne referanse koordinater og forskyvninger, fluorescerende fiducial markører bør ligne ellipsoidiske figurer med intensitet synkende radielt fra sentrum. Skriptet disp3D. m gir et plott av intensitet som en funksjon av z-posisjon for hver kolonne med oppdagede funksjoner i en gitt bilde stabel (Figur 3a, B) for å vurdere kvaliteten på fiducial markør intensitet profiler. Både disp3D. m og dispShear. m sammen gir histogrammer av målt Forskyvnings støy i hver av kartesiske koordinat dimensjoner (Figur 4A-C) samt interpolert varme kart for forskyvning (Figur 4 E, F). Til slutt gir interpFinal3D_2. m varme kart over overflate tractions beregnet ved hjelp av outsourcet kode (figur 5)31.

Figure 1
Figur 1: typiske mønster resultater.
(A) fluorescerende bilder av fiducial markører som viser intensitet svingninger gjennom Z-dimensjonen fra hydrogel overflaten til 12,4 μm innenfor hydrogel. (B) en bearbeidet volum gjengivelse avslører den ellipsoidiske formen til fiducial markører. (C) delt for å vise rå markør data. A, C: Scale bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: diagnose utganger fra algoritmen for partikkel sporing.
Objekt gjenkjennings-og sporingsprogramvaren sender ut flere diagnostiske bilder, inkludert (a) en Z-vektet projeksjon av de fluorescerende fiducial markørene og (B) en scatter-plott av markør posisjoner med fargekodet Z-posisjon. (C) en ekstra utgang viser en z-vektet projeksjon, som i (a), med 2D-oppdagelser fra hver ramme som er koblet til kolonner. (D) en nærmere titt på (B) mer tydelig viser individuelle 2D-oppdagelser farge kodet av z-posisjon. A: Scale bar = 20 μm. C: Scale bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: diagnose utganger fra algoritmen for 3D-forskyvning.
(A, B) Linje plott av markør intensitet som en funksjon av ramme posisjon vise svingninger mellom markører gruppert i vertikal retning. Disse linje tomter tillate kvalitativ vurdering av rutenettet innretting med Imaging planet, samt generelle kvaliteten på mønstrede fiducial markører. (A) overlappende svingninger i markør intensitet bekrefter akseptabel justering av bilde planet med mønstret fiducial markør matriser. Hvis du inkluderer tomme rammer øverst på en Z-stabel, kan du automatisk beregne en støy terskel i behandlingsprogramvaren. (B) dårlig overlapping mellom svingninger er ofte en indikasjon på dårlig justering av mønstret rutenett med Imaging planet, men kan også tyde på at rutenettet selv er feiljustert og kan gi dårlige resultater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: diagnostiske utganger fra 2D-og 3D-algoritmer for forskyvning.
(A-C) Histogrammer av målte forskyvninger i regioner som betraktes som "ikke-deformert" (dvs. Forskyvnings støy) gir en kvantitativ vurdering av nøyaktigheten av beregnede Referanselinjer for tilnærme markør referanse posisjoner. Forskyvnings felt gir en visuell fremstilling av både (D) in-plane (Shear) og (E) ut av flyet (normal) målt forskyvninger. D: Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: diagnoseresultater fra algoritmen for trekkraft konvertering.
(A-C) Strekkraft påkjenninger kan beregnes basert på interpolert forskyvning felt for å bestemme (B) total traction, (C) skjær raft, og (D) normal trekkraft. A: Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne protokollen er å gi en arbeidsflyt som lindrer mye av vanskelighetene knyttet til generering og analyse av TFM data. Når forberedt, de photopatterned hydrogeler er enkle å bruke, som krever bare kjennskap til standard vev kultur praksis og fluorescens mikroskopi. Referansen-gratis aspekt muliggjør bekymringsløs navigering på celle-Laden hydrogeler og eliminerer tungvint bildebehandling trinn som bilde registrering mellom referanse og deformert bilder. Den resulterende analysen er nesten helt automatisert og data fra individuelle COIs kan analyseres fra Start til slutt på mindre enn 10 min.

De viktigste utfordringene i denne protokollen stammer fra fabrikasjon av photopatterned hydrogel. Fordi de fleste av reagensene som brukes i protokollen er syntetisert internt, forventer vi at brukere med liten erfaring med syntetiske hydrogel materialer kan være noe avskrekket fra å forsøke denne protokollen. Når det er sagt, alle de pegylert komponentene som brukes i denne protokollen er syntetisert fra nesten identiske protokoller ved hjelp av en-pott reaksjoner og mange av komponentene kan kjøpes fra kommersielle leverandører.

Denne protokollen krever også litt mestring over bruk av laser-skanning mikroskop. Parameterne for laserskanning må optimaliseres for alle forskjellige mikroskop, ettersom laser intensitet, objektiv linser og andre mikroskop komponenter vil variere, selv mellom mikroskop av samme modell. En enkel tilnærming til å bestemme de beste mikroskop innstillingene for foto mønstre er å utføre et panel av skanninger med varierte innstillinger. Enhver innstilling som påvirker den totale laser eksponeringen som mottas av prøven, vil påvirke størrelsen og kvaliteten på de mønstrede markørene. Dette inkluderer: skannehastighet, pikselstørrelse, snitt nummer, laser effekt/intensitet/fluence, forstørrelse og numerisk blenderåpning32,33. Det er ofte lettest å justere laser kraft og skannehastighet og så det anbefales å starte med de to parametrene. Det bør også bemerkes at programvaren som brukes til å generere regioner filer ble utviklet spesielt for merket av mikroskop vi bruker, og kan være nødvendig å bli forsterket for å imøtekomme andre mikroskop gjør og modeller. Med innstillingene i protokollen, brukeren bør forvente å generere ellipsoidiske markører med 3D Gaussian-like intensitet profiler av full bredde halv Max dimensjoner på 0,84 ± 0,11 μm i XY og 3,73 ± 0,30 μm i Z. Algoritmen for objekt deteksjon bruker et Center-of-Mass av intensitet for å identifisere markør centroids og vil fungere best når markører presentere en bestemt stigning av intensitet.

Riktig skylling av hydrogel og beskyttelse mot lys og forurensning er kritisk viktig for cellekultur. Som nevnt i protokollen, kan noen av mønster komponentene krasje ut av oppløsning og innskudd på overflaten av hydrogel. Hvis disse komponentene ikke er helt skylles ut av overflaten, kan celle vedheft bli uforutsigbart påvirket. Ved eksponering for UV-spektrum lys, selv i små doser, mens hydrogel er soaking i mønster løsningen, vil mønster oppløsningen begynne å polymeres og vil gi dårlige resultater. Til slutt vil luftbårne partikler eller ufiltrert partikler komplisere analysen, spesielt hvis de er fluorescerende. Det bør utvises spesiell forsiktighet for å hindre at disse forurensninger kommer inn i prøven på alle trinn i protokollen.

Analysekoden forutsier referanse plasseringer av deformert fiducial markører ved å forutsi den opprinnelige matrisen fra ikke-deformert markører i samme rad eller kolonne som deformert markør. Selv om dette forenkler analysen betraktelig, medfører det også noen restriksjoner på hva som kan eller ikke kan analyseres. På et minimum, hver deformert markør blir analysert bør ha 2 eller flere medlemmer av både kolonne og rad av markører som ikke er deformert, slik at en nøyaktig prediksjon kan gjøres. En rad defineres av prikkene som skrives ut i en enkelt linjeskanning på mikroskopet, og en kolonne defineres av markører mønstret på en enkelt y-akse ved hjelp av en z-stabel-funksjon. Dette begrenser analyse til enkeltceller eller små celle klynger basert på lengden og dybden av hvert mønstrede område. Det er viktig å merke seg at dette ikke er utbedret ved å plassere to mønstrede områder perfekt ved siden av hverandre. Dette er fordi selv om XY komponentene kan stille opp, er det ikke mulig å perfekt linje opp Z posisjons komponenter av arrays, med mindre prøven overflaten er perfekt nivå med både fokalplanet og scenen. Den beste måten å unngå denne begrensningen er å ansette flere runder med mønstre som spesifikt dikterer vedheft ligand plassering. Hvis riktig justert, kan celle vedheft begrenses til brukbare områder på mønstrene.

Analysekoden er optimalisert for firkantede matriser der markører er plassert omtrent 3,5 μm fra hverandre i Z og 2,1 μm i X og Y. Den endelige avstanden vil variere basert på mønster gjengivelse og hevelse, men dette bør ikke ha stor innvirkning på ytelsen hvis avstanden mellom rader er konsekvent (avstands variasjon på rad vil ikke påvirke sporingen). Mens koden kan kjøre til ferdigstillelse på forskjellig foreskrevet matriser, gjeldende tilstand kan gi dårlige resultater hvis matriser ikke samsvarer med parametrene som er oppført her. Våre nåværende mål for Analysekoden er å inkludere støtte for variabel avstand samt trekantede arrays, som kan forbedre trekkraft rekonstruksjon nøyaktighet og redusere regionale bias i forhold til kvadrat arrays.

For å konkludere, gir vi en tilnærming til TFM som gjør det mulig for facile innsamling og analyse av TFM data uten perturbing mobilnettet funksjon. Vårt mål med denne tilnærmingen er å gi en mer tilgjengelig og ikke-påtrengende TFM tilnærming, uten å svekke oppløsningen og kvaliteten på TFM data. Vi forventer at denne metodikken vil fremme konvergens av biokjemiske kunnskap om mobilnettet fenotyper med observerte fysiske egenskaper av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

O. A. Banda ble støttet av midler fra en NSF IGERT SBE2 fellesskap (1144726), oppstart midler gitt av University of Delaware, og National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299). JHS er støttet av finansiering fra National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299) og National Science Foundation CAREER Award program (1751797). Mikroskopi tilgang ble støttet av tilskudd fra NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) og staten Delaware. Den strukturerte lys mikroskop ble anskaffet med midler fra staten Delaware Federal Research and Development Grant program (16A00471). Den LSM880 konfokalmikroskopi mikroskop brukes for to-Foton laserskanning litografi ble kjøpt med en delt instrumentering stipend (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158, (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9, (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151, (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108, (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43, (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13, (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227, (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6, (1), 103 (2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4, (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120, (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94, (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80, (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2, (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23, (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11, (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5, (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8, (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9, (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6, (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. 183-220 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics