Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Bioengineering

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Summary

Questo protocollo genera microarray di bioparticelle che forniscono brulio di neutrofoni controllati spazialmente. Fornisce un facile accesso ai mediatori che i neutrofili rilasciano durante la migrazione e consente l'analisi quantitativa dell'imaging.

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Walters, N., Reátegui, E. Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro. J. Vis. Exp. (156), e60544, doi:10.3791/60544 (2020).

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Abstract

Lo sciame neutrofilo è un processo cooperativo attraverso il quale i neutrofili sigillano un sito di infezione e promuovono la riorganizzazione dei tessuti. Lo sciame è stato studiato in modo classico in vivo in modelli animali che mostrano modelli caratteristici della migrazione cellulare. Tuttavia, i modelli in vivo hanno diverse limitazioni, tra cui mediatori intercellulari che sono difficili da accedere e analizzare, così come l'incapacità di analizzare direttamente i neutrofili umani. A causa di queste limitazioni, c'è bisogno di una piattaforma in vitro che studia brulicante di neutrofili umani e fornisce un facile accesso ai segnali molecolari generati durante lo sciame. Qui, un processo di microstampa multifase viene utilizzato per generare un microarray di bioparticelle che stimola lo sciame imitando un'infezione in vivo. Il microarray di bioparticelle induce i neutrofili a sciamare in modo controllato e stabile. Sul microarray, i neutrofili aumentano di velocità e formano sciami stabili intorno ai cluster di bioparticelle. Inoltre, è stato analizzato il supernatante generato dai neutrofili e si è scoperto che 16 proteine sono state espresse in modo differenziale nel corso dello sciame. Questa piattaforma di brulichi in vitro facilita l'analisi diretta della migrazione dei neutrofili e del rilascio di proteine in modo riproducibile e controllato dallo spazio.

Introduction

Neutrofili, il più abbondante globulo bianco nel flusso sanguigno1, stanno guadagnando l'attenzione come potenziali bersagli diagnostici e terapeutici2,3 perché possono essere coinvolti in una varietà di condizioni mediche tra cui gotta4, sepsi3, trauma5,6, cancro1,7,8, e varie malattie autoimmuni5,9. Lo sciame neutrofilo è un processo multifase, strettamente regolato con una complessità che lo rende un focus particolarmente interessante di studio5,10,11. Durante lo sciame, i neutrofili isolano un sito di infiammazione dal tessuto sano circostante5,10,11. Una corretta regolazione del brulicante di neutrofoni è essenziale per promuovere la guarigione delle ferite e, in ultima analisi, la risoluzione dell'infiammazione5,12. Lo sciame neutrofilo è stato studiato principalmente in vivo nel roditore12,13,14,15 e pesce zebra10,11,12,15 modelli. Tuttavia, la natura di questi modelli animali in vivo dà luogo a limitazioni5. Ad esempio, i mediatori rilasciati dai neutrofili durante lo sciame non sono facilmente accessibili per l'analisi5. Inoltre, ci sono molte fonti potenziali per un determinato mediatore in vivo, quindi un esperimento in vivo deve introdurre una carenza genetica per inibire la produzione cellulare e/o l'interazione al fine di studiare il ruolo di quel mediatore in un dato processo13. Un esperimento in vitro aggira questa complicazione consentendo l'osservazione dei neutrofili senza il contesto di cellule aggiuntive. Inoltre, la ricerca che descrive la migrazione coordinata dei neutrofili umani è limitatadi 16. Su una piattaforma di bruliè in vitro, i neutrofili umani possono essere analizzati direttamente. Una piattaforma di brulicante in vitro potrebbe ampliare le conoscenze acquisite dagli studi in vivo fornendo opportunità per colmare le lacune lasciate dai limiti degli studi in vivo.

Per rispondere alla necessità di una piattaforma in vitro che imita il brulicare di neutroni in vivo, abbiamo sviluppato una piattaforma di microstamping che ci permette di patternare microarray di bioparticelle che stimolano il brulicare di neutroni in modo controllato spazialmente. Noi generiamo microarray di bioparticelle su vetrini di vetro in un processo in due fasi. In primo luogo, utilizziamo il microstamping per generare un microarray di macchie di polielettrolita cationico (CP). In secondo luogo, aggiungiamo una soluzione di bioparticelle che aderiscono alle macchie CP tramite interazione elettrostatica. Modellando prima lo strato CP, possiamo modellizzare selettivamente bioparticelle caricate negativamente per generare il modello di brulicante di neutrofili desiderato. Lo strato caricato positivamente contiene le bioparticelle caricate negativamente attraverso la fase di lavaggio vigoroso che rimuove le bioparticelle dalle aree sul vetrino che non hanno il CP. Inoltre, il CP utilizzato qui, un copolimero di acrilammide e monomero cationico quaternizzato, è biocompatibile, quindi non induce una risposta dai neutrofili. Ha una carica superficiale molto alta che immobilizza le bioparticelle di dimensioni micron al vetrino di vetro, impedendo così ai neutrofili di rimuovere le particelle dalla posizione modellata sul vetrino di vetro. Ciò si traduce in cluster di bioparticelle disposti in un microarray. Quando abbiamo aggiunto i neutrofili al microarray, formavano sciami stabili intorno agli ammassi di bioparticelle. Attraverso il monitoraggio della migrazione dei neutrofili, abbiamo scoperto che i neutrofili brulicanti migrano attivamente verso i cluster di bioparticelle. Inoltre, abbiamo usato questa piattaforma per analizzare alcuni mediatori che i neutrofili rilasciano durante lo sciame. Abbiamo trovato 16 mediatori che sono espressi in modo differenziale durante lo sciame. Le loro concentrazioni seguono tre tendenze generali nel tempo: aumento, diminuzione o picco. La nostra piattaforma di brulichi neutrofili in vitro facilita l'analisi del brulicare di neutrofi umani controllato spazialmente, così come la raccolta e l'analisi di mediatori rilasciati da brulicanti di neutrofoni. In una pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che i pazienti con determinate condizioni mediche (trauma, malattia autoimmune e sepsi), avevano neutrofili che funzionavano in modo diverso rispetto a quelli provenienti da donatori sani5. In studi di ricerca futuri, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzata per analizzare la funzione neutrofila tra una varietà di popolazioni di pazienti. Questa piattaforma può analizzare quantitativamente la complessa coordinazione coinvolta nello sciame neutrofico. Ulteriori studi possono essere fatti per fornire informazioni sulla funzione neutrofila di una specifica popolazione di pazienti o la risposta dei neutrofili a un agente patogeno di interesse.

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Protocol

Gli autori riconoscono i volontari sani che hanno gentilmente donato il loro sangue. Gli esemplari di sangue sono stati ottenuti dopo il consenso volontario informato secondo il protocollo dell'IRB (Institutional Review Board) #2018H0268 esaminato dal Comitato di Scienze Biomediche della Ohio State University.

1. Microfabbricazione di microarray di microparticelle di bioparticelle

  1. Utilizzando procedure di fotolitografia standard, generare il wafer di silicio master.
    1. Generare una prova del disegno desiderato utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design), quindi inviare a un produttore di fotomaschera per produrre una maschera fotografica cromata. Il design qui utilizzato è composto da 4 mm x 4 mm di array rettangolari di 30 m di diametro riempiti in cerchi con una spaziatura centrale-centrale di 150 m. Questo design può essere modificato come desiderato per diverse applicazioni.
    2. Spincoat uno strato di 40 m di spessore di un fotoresist negativo su un wafer di silicio. Cuocere il wafer a 65 gradi centigradi per 5 min e 95 gradi centigradi per 10 min.
    3. Esporre il wafer alla luce UV attraverso una fotomaschera cromata con 150-160 mJ/cm2 (Figura 1A).
    4. Cuocere il wafer a 65 gradi centigradi per 5 min e 95 gradi centigradi per 10 min. In questa fase, il modello dovrebbe essere visibile sul wafer (Figura 1B).
  2. Mescolare accuratamente un rapporto 10:1 di prepomero polidimetiloxanano e il suo agente di polimerazione (cioè 20 g di prepolimero e 2 g di agente di polimeraggio) e versare la miscela polidimetilsiloxane (PDMS) non curata sul wafer principale in una parabola petri(Figura 1C).
  3. Il vuoto tratta la miscela PDMS non curata fino a quando non sono presenti bolle d'aria sul wafer principale. Curare a 65 gradi centigradi durante la notte.
  4. Utilizzare un bisturi per tagliare intorno all'esterno della sezione modellata del wafer e rimuovere lentamente la lastra PDMS curata. Posizionare la lastra PDMS su un tagliere pulito con il lato modellato rivolto verso l'alto (Figura 1D).
  5. Estrarre singoli francobolli dalla lastra PDMS con un punzone biopsia di 8 mm(Figura 1E). Per uno scivolo di vetro, saranno necessari otto francobolli.
  6. Posizionare ogni timbro a faccia in giù sul nastro adesivo per rimuovere eventuali detriti.
  7. In anticipo, preparare una soluzione da 1,6 mg/mL di CP in acqua.
    1. Aggiungere la quantità corretta della polvere CP all'acqua (ad esempio, da 0,8 g a 500 mL).
    2. Mescolare su una piastra di mescolare a temperatura ambiente durante la notte, o fino a quando tutto il solido è sciolto in acqua. La soluzione CP può essere conservata a temperatura ambiente per 6 mesi.
    3. Se lo si desidera, rendere fluorescente la soluzione CP aggiungendo poli-L-lisina etichettata con fluoresceinisiocianato (PLL-FITC).
      1. Aliquota circa 10 mL della soluzione CP. Aggiungere una piccola quantità di PLL-FITC (0,05 mg) al volume di aliquota. La quantità può essere modificata per regolare la luminosità della fluorescenza come desiderato.
      2. Vortex la soluzione CP etichettata con FITC per 20 s, o fino a quando la soluzione è un uniforme, colore giallo pallido. Proteggere dalla luce e conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
  8. Con i francobolli a faccia in su, prime ogni timbro con 100 sL di 1,6 mg/mL soluzione di CP, assicurando non si formano bolle d'aria tra la soluzione CP e il timbro (Figura 1F).
  9. Invertire i timbri su uno strato di soluzione CP (Figura 1G).
  10. Rimuovere i francobolli dalla soluzione CP dopo 1 h.
  11. Dab ogni timbro bagnato a faccia in giù su uno scivolo di vetro pulito 6–8x per rimuovere il liquido in eccesso.
  12. Vuoto trattare i francobolli per 1-2 min.
  13. Aderire un distanziale di imaging di 8 pozzi, 9 mm di diametro sulla parte superiore di un vetrino pulito come guida per il posizionamento del francobollo. Con questo distanziale, ogni vetrino può avere otto microarray.
  14. Posizionare un timbro a faccia in giù sulla diapositiva di vetro al centro di ogni pozzetto del distanziale di imaging (ad esempio, utilizzare otto francobolli in totale).
  15. Posizionare un peso bilanciato di 5,6 x 0,1 g sopra ogni timbro e attendere 10 min per la stampa (Figura 1H). È necessario un peso equilibrato per garantire che il francobollo venga premuto uniformemente sul vetrino di vetro e promuovere anche il trasferimento del CP al vetrino di vetro.
  16. Rimuovere i pesi e i francobolli dalla vetrina di vetro (Figura 1I). Lasciare asciugare lo strato CP a temperatura ambiente per 24 h prima di aggiungere le bioparticelle, come descritto al punto 1.17. Se il CP è contrassegnato con FITC, l'efficacia della stampaggio può essere verificata a questo punto con un microscopio fluorescente a 488 nm prima di procedere al passaggio 1.17 (Figura 1M).
  17. Tagliare una lastra PDMS vuota alle dimensioni del distanziale di imaging e utilizzare il punzone biopsia da 8 mm per creare pozzi nel PDMS che si allineano con i pozzetti di un distanziale di imaging. Aderire la lastra PDMS alla diapositiva di vetro con il distanziale di imaging (Figura 1J).
  18. Scongelare una soluzione di bioparticelle (ad es. coli o zymosan) e diluire a 500 g/mL in acqua per l'iniezione (WFI).
    NOTA: Le bioparticelle non hanno bisogno di essere opsonizzate. I recettori della superficie neutrofilo riconoscono direttamente le molecole su queste bioparticelle19,20,21.
  19. Aggiungete 100 l di bioparticelle a ogni PDMS bene sul vetrino di vetro (Figura 1K).
  20. Far rock lo scivolo di vetro per 30 min.
  21. Sciacquare accuratamente i pozzi con acqua. Il microarray di bioparticelle può essere conservato in un ambiente privo di polvere a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi. A questo punto, il modello deve essere controllato con un microscopio fluorescente a 594 nm prima di procedere al passaggio 2.1 (Figura 1N).

2. Preparazione del campione

  1. Raccogliere almeno 2 mL di sangue fresco nei tubi K2-EDTA dal donatore desiderato. La resa prevista dei neutrofili è 1–2 x 106 cellule/1 mL di sangue intero. Il saggio di imaging richiede circa 1,5 x 105 neutrofili, e l'analisi del supernatante richiede 1 x 106 neutrofili. Utilizzare il sangue entro 4 h.
  2. Separare i globuli rossi (RBC) aggiungendo un agente di aggregazione eritrociti in un rapporto 1:5 all'intero sangue. Attendere 45 min per uno strato traslucido (cappotto di bufala) per separare dallo strato di RBC.
  3. Rimuovere il buffy coat e lavare con fosfato tamponato salina (PBS) utilizzando 1 mL di bufala: 9 mL PBS.
  4. Centrifuga per 5 min a 190 x g e 20 gradi centigradi.
  5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet a 5 x 107 celle / mL.
  6. Utilizzare un kit di selezione immunomagnetica negativa per isolare i neutrofili.
    1. Aggiungere 50 - L di anticorpo cocktail/1 mL di sospensione cellulare. Attendere 10 min.
    2. Aggiungete 100 l di perline magnetiche/1 mL di sospensione cellulare. Attendere 10 min.
    3. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo rotondo e posizionare in un magnete cilindrico. Attendere 10 min.
  7. Versare il supernatante in un tubo di centrifuga. Aggiungere fino a 10 mL di PBS. Centrifuga per 5 min a 190 x g e 20 gradi centigradi.
  8. Aspiratore supernatante. Risospendi il pellet bianco in IMDM con 0.4% albumin sieri umano.
  9. Nuclei macchiati con 20 sg/mL Hoechst 33342 per 10 min a 37 gradi centigradi.
  10. Aggiungi 5 mL di IMDM con 0.4% albumin siero umano per risciacquare. Centrifuga per 5 min a 190 x g e 20 gradi centigradi.
  11. Risospendere le cellule a 7,5 x 105 celle/mL in IMDM con 0,4% di albumin del siero umano.
  12. Aggiungere 100 l della sospensione cellulare a un pozzo PDMS contenente un microarray di microparticelle di bioparticelle. Assicurarsi che la sospensione cellulare sia convessa sopra la parte superiore del PDMS e non contenga bolle.
  13. Sigillare con una coverslip di 12 mm di diametro. Coprire l'apertura del pozzo PDMS con una coverslip di 12 mm di diametro. Premere delicatamente verso il basso sul coperchio con una pinzetta in modo che le sospensioni delle cellule in eccesso fuoriescano al bordo del pozzo. Utilizzare un tessuto per rimuovere la sospensione cellulare in eccesso.

3. Esecuzione dell'analisi e dell'analisi delle immagini

  1. Caricare l'array di microparticelle con le cellule sulla stazione di imaging a cellule vive con un microscopio dotato di un'incubatrice a gabbia impostata a 37 , 5% CO2e 90% di umidità relativa.
  2. Usa la microscopia fluorescente e luminosa time-lapse per registrare immagini con ingrandimento 10x ogni 10 s a 405 nm, 594 nm e brightfield. In un esperimento tipico, le immagini vengono raccolte fino a 2 h.
  3. Utilizzare un software di tracciamento cellulare automatizzato per tenere traccia della migrazione di singoli neutrofili verso il cluster di bioparticelle.
    1. Utilizzare la modalità di regressione automatica di un software di rilevamento delle celle di rilevamento spot. Impostare il raggio spot su 5 m (la dimensione approssimativa di un nucleo di neutrofili). Impostate la lunghezza minima della traccia su 120 s e una dimensione massima dello spazio di un fotogramma.
    2. Dai dati generati dal software di tracciamento delle celle, estrai i file che contengono la posizione e la velocità dei neutrofili. Questi file possono essere utilizzati con un software grafico per generare tracce di migrazione neutrofili (Figura 2C) e una mappa termica di velocità rispetto al tempo (Figura 2D), rispettivamente.
  4. Utilizza le immagini fluorescenti da 405 nm per monitorare le dimensioni dello sciame nel tempo su un software di analisi delle immagini di tua scelta.
    1. Definire le regioni di interesse (ROI) intorno a ogni cluster di bioparticelle in cui i neutrofili sciameranno. Mantenere lo stesso ROI di dimensioni per analizzare ogni cluster di bioparticelle.
    2. Analizzare l'intensità media fluorescente delle immagini di 405 nm all'interno di ogni ROI nel tempo.
    3. Generare una curva di calibrazione di intensità media fluorescente alle dimensioni dello sciame prendendo misure manuali a varie dimensioni dello sciame da 0 m2 alla dimensione massima dello sciame. Utilizzare questa calibrazione per calcolare la dimensione dello sciame nel tempo.

4. Raccolta supernatante e rilevamento di proteine

  1. Incubare i neutrofili nei pozzi contenenti il microarray di bioparticelle a 37 e 5% di CO2 per 3 h. Prelevare i campioni nei punti temporali desiderati. In genere, i campioni verranno prelevati a 0, 0,5, 1 e 3 h. Per superare il limite di rilevazione del saggio dell'array proteico, per ogni punto di tempo è stato utilizzato l'intero volume di un pozzo sovranabile (200 l). Ogni momento è stato analizzato in triplice copia.
  2. Utilizzando un microscopio a campo luminoso, verificare che gli sciami si formino sul microarray.
  3. Aspirare il supernatante con una pipetta da 200 l e caricare in un tubo di filtro centrifuga 0,45 m.
  4. Centrifugare il supernatante a 190 x g e 20 gradi centigradi per 5 min e raccogliere il volume filtrato.
  5. Conservare i campioni a -80 gradi fino al tempo di elaborazione.
  6. Utilizzare un kit di microarray che rileva una gamma di proteine umane per elaborare i campioni.
    1. Aggiungere 200 l di ciascun campione in un tubo di dialisi separato fornito con il kit.
    2. Collocare i tubi di dialisi in un becher contenente almeno 500 mL di PBS (pH - 8,0). Mescolare delicatamente su un piatto di mescolare per almeno 3 h a 4 gradi centigradi. Modificare il PBS nel becher e ripetere questo passaggio.
    3. Trasferire ogni campione in un tubo di centrifuga pulito e centrifugare a 9.000 x g per 5 min per rimuovere eventuali precipitati. Trasferire ogni supernatante in un tubo pulito.
    4. Biotinylate ogni campione aggiungendo 36 lofonizzanti di 1x dal kit per 1 mg di proteine totali nel campione dializzato a 180 . Incubare a 20 gradi centigradi per 30 min. Mescolare delicatamente ogni 5 min.
    5. Aggiungere 3 - L di soluzione di arresto fornita con il kit in ogni tubo campione. Trasferire ogni campione in un nuovo tubo di dialisi e ripetere i passaggi da 4.6.2–4.6.3. In questa fase, il campione può essere conservato a -20 o -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti a procedere.
    6. Lo scivolo di vetro fornito con il kit è conservato a -20 gradi centigradi. Lasciare arrivare a temperatura ambiente. Posizionare lo scivolo di vetro assemblato in un cappuccio a flusso laminare per 1-2 h a temperatura ambiente.
    7. Aggiungere 400 l del buffer di bloccante fornito con il kit in ogni pozzetto dello scivolo di vetro assemblato. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    8. Centrifugare i campioni preparati per 5 min a 9.000 x g per rimuovere precipitati o particolato. Diluire 5x con buffer di blocco.
    9. Rimuovere il buffer di blocco da ogni pozzo. Aggiungere 400 l dei campioni diluiti nei pozzi appropriati. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente mentre dondolo.
    10. Decantare i campioni da ogni pozzo. Lavare 3x con 800 l.l of the 1x lavare tampone ho fornito con il kit a temperatura ambiente per 5 min ciascuno mentre dondola.
    11. In un contenitore pulito, immergere lo scivolo di vetro assemblato in 1x tampone di lavaggio I. Lavare 2x a temperatura ambiente per 5 min ciascuno mentre dondola.
    12. Aggiungere 400 lofan di 1x streptavidina coniugata di 1x Cy3 ad ogni sotto-array. Coprire con strisce adesive in plastica. Proteggere dalla luce per il resto del protocollo.
    13. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente mentre dondolo.
    14. Decant la soluzione e smontare il vetrino dalle camere campione.
    15. Nel tubo di centrifuga di 30 mL fornito con il kit, aggiungere con attenzione lo scivolo di vetro e abbastanza 1x lavare tampone I per coprire lo scivolo di vetro. Lavare 3 volte per 10 min ciascuno a temperatura ambiente mentre dondolo.
    16. Nel tubo di centrifuga di 30 mL, lavare 2x con tampone di lavaggio 1x II per 5 min ciascuno a temperatura ambiente mentre dondola.
    17. Lavare lo scivolo di vetro con 30 mL di ddH2O per 5 min. Rimuovere il vetrino di vetro dal tubo centrifuga e lasciare asciugare per 20 min in un cappuccio a flusso laminare. Lo scivolo di vetro preparato può essere conservato a -20 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la scansione.
    18. Scansiona lo scivolo di vetro con uno scanner microarray a un'emissione di fluorescenza di 555 nm.

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Representative Results

Quando i neutrofili vengono aggiunti al microarray di microparticelle di bioparticelle, i neutrofili che contattano i cluster di bioparticelle si attivano e avviano la risposta sciami. Il microarray di bioparticelle è stato convalidato utilizzando la microscopia fluorescente time-lapse per monitorare la migrazione dei neutrofi verso i cluster di bioparticelle (Video S1). La migrazione dei singoli nuclei di neutrofili viene monitorata mentre migrano verso il cluster di bioparticelle. Quando i neutrofili raggiungono l'ammasso di bioparticelle, i loro nuclei si sovrappongono ad altri nuclei nell'ammasso. Pertanto, non è possibile tracciare con precisione un neutrofilo all'interno del cluster utilizzando questo metodo. Gli ammassi di bioparticelle di zimosan ed E. coli provocano entrambi la generazione di sciami di neutrofili. Per i nostri risultati, Figura 2Utilizza i dati provenienti da sciami di neutrofili generati da particelle di E. coli. Figura 3 e gli altri pannelli della Figura 2 utilizzano sciami neutrofili generati da particelle di zimosan. I risultati ottenuti dimostrano che i cluster di bioparticelle stimolano l'attivazione dei neutrofili quando un neutrofilo ha contattato l'ammasso, che alla fine ha portato alla formazione di sciami di neutrofili stabili intorno a ogni cluster dopo 30-60 min (Figura 2A,top). Al contrario, i neutrofili non hanno mostrato la migrazione collettiva in assenza di cluster di bioparticelle (Figura 2A, bottom e Video S2). Utilizzando l'intensità fluorescente dei nuclei di neutrofili macchiati a 405 nm, la dimensione media dello sciame di neutrofi di circa 30 m di diametro sono stati trovati a 1.4900 m2 (media : SD, Figura 2B, parte superiore). L'intensità di fluorescenza di una data regione di interesse in cui non sono presenti cluster di bioparticelle era approssimativamente costante nel tempo, il che ha confermato l'assenza di migrazione collettiva in questa impostazione (Figura 2B, fondo). Tracce di migrazione di neutrofili mostrano che i neutrofili convergono su un cluster di bioparticelle quando ne era presente uno (Figura 2C, in alto). Al contrario, non è stata osservata alcuna convergenza nel sistema di controllo (Figura 2C, fondo). È stata misurata la velocità (distanza percorsa/tempo) dei neutrofili brulicanti e non attivati ed è stata rilevata una differenza statisticamente significativa nelle distribuzioni di velocità (ANOVA, p < 0.0001), come illustrato nella Figura 2D. La velocità media per i neutrofili brulicanti era di 20,6 x 13,0 m/min (media : SD), e la velocità media per i neutrofili di controllo era di 2,0 x 2,2 m/min.

Inoltre, è stata analizzata la concentrazione di 16 proteine che i neutrofili hanno rilasciato durante lo sciame (Figura 3). Sono stati calcolati la concentrazione normalizzata di ogni proteina in punti temporali diversi nel processo di brulicazione (t - 0, 0,5, 1 e 3 h) dove la concentrazione normalizzata è (C – Cmin) / (Cmax – Cmin). 10 proteine sono aumentate di concentrazione durante lo sciame. Queste proteine erano adipsin, galectin-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 e TLR2. Due proteine (pentraxin 3 e RANK) sono diminuite in concentrazione durante lo sciame. Le restanti quattro proteine (clusterina, PF4, RANTES e Trappin-2) sono aumentate durante la prima ora di sciami, ma sono diminuite successivamente. In altre parole, le concentrazioni di quelle proteine "spiked" durante lo sciame. Delle 16 proteine identificate, 12 proteine sono state identificate nella nostra precedente pubblicazione5. Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 e TLR2 sono stati mostrati come specifici per lo sciame, mentre clusterin, IL-6R, MMP-8 e MMP-9, RANK e trappin-2 non erano5.

Figure 1
Figura 1: Produzione di microarray di microparticelle di bioparticelle. Un wafer di silicio rivestito con fotoresist negativo è esposto alla luce UV attraverso una fotomaschera cromata (A). Dopo che il wafer di silicio è cotto e sviluppato, un modello di fotoresist rimane sulla superficie del wafer di silicio. Questo è il wafer maestro (B). In un piatto Petri, una miscela PDMS viene aggiunta alla parte superiore del wafer master. Il PDMS viene curato durante la notte a 65 gradi centigradi per formare lo stampo PDMS (C). Lo stampo PDMS viene tagliato dal wafer master e viene utilizzato un punzone di biopsia per eliminare singoli francobolli PDMS (D). Un timbro PDMS (E) è rivestito con soluzione CP (F). Il francobollo è invertito su un sottile strato di soluzione CP (G). Dopo l'incubazione nella soluzione CP per 1 h, il francobollo viene incollato su uno scivolo di vetro per rimuovere l'eccesso di francobolli CP. Otto francobolli vengono poi premuti su un vetrino pulito con un peso di 5,6 x 0,1 g, allineato con un distanziale di imaging (H). Quando il timbro viene rimosso, rimane un modello CP (I). Una lastra PDMS con pozzetti pretagliati viene aderisceto allo scivolo di vetro (J). Quindi, viene aggiunta una soluzione di bioparticella sul modello CP (K). Le bioparticelle caricate negativamente si legano al polielettrolita caricato positivamente tramite l'interazione elettrostatica. La soluzione di bioparticelle in eccesso viene lavata via, lasciando le bioparticelle modellate sopra il modello CP (L). (M) Immagine fluorescente dello strato CP etichettato con FITC (Barre di scala : 50 m, immagine grande; Barra della scala: 25 m, interna). (N) Immagine fluorescente di bioparticelle di zimosana a motivi geometrici coniugate con Texas Red (barra di scala : 100 m, immagine grande; Barra della scala : 50 m, interna). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Crescita dello sciame neutrofilo intorno a i cluster di bioparticelle. In presenza di cluster di bioparticelle, i neutrofili subiscono una migrazione collettiva verso i cluster di bioparticelle (inbasso, neutrofili di controllo). Quando non sono presenti bioparticelle, i neutrofili non eseguono la migrazione collettiva. (A) In presenza di cluster di bioparticelle di zymosana, i neutrofili formano sciami in 30 min. Senza cluster di bioparticelle, non si formano sciami (scale di scala : 50 m). (B) Gli sciami neutrofilo crescono fino a una dimensione media di 1.490 x 680 m2 (media SD) di circa 30 am di diametro cluster di bioparticelle di E. coli. I neutrofili di controllo presentano una densità costante che non corrisponde a nessuna crescita dello sciame (ANOVA, p < 0.0001, n - 32 sciami di neutrofili, N - 1 donatore, barre di errore - deviazione standard). (C) Le tracce dei neutrofili brulicanti convergono sugli ammassi di bioparticelle di zymosan, mentre i neutrofili di controllo non mostrano alcun punto convergente (barre di scala : 50 m). (D) I neutrofili che si avvicinano a un bersaglio zymosano hanno una velocità media di 20,6 x 13,0 m/min (media : SD), mentre i neutrofili di controllo hanno una velocità media di 2,0 2,2 m/min. Ogni conteggio sulla mappa di calore rappresenta un neutrofilo con la velocità istantanea data al momento specificato. Queste mappe di calore sono rappresentative di un esperimento (n - 1 sciame; N - 1 donatore; ANOVA, 6.114 - neutrofili brulicanti, 32.116 - neutrofili di controllo, p < 0.0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Mediatori gratuiti rilasciati dai neutrofili brulicanti. Lo sciame neutrofilo influisce sulla produzione di varie proteine nel tempo. La concentrazione proteica è stata misurata a 0, 0,5, 1 e 3 h. I punti dati sono stati dotati di spline levigate (0,05 USD). Queste proteine tendono a seguire una delle tre tendenze caratteristiche: diminuire nel tempo, aumentare nel tempo, o chiodare intorno a 1 h e poi diminuire (Barre di errore - deviazione standard; n - 3 repliche; N - 1 donatore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video S1: Neutrophil che si sta riscalda verso cluster di bioparticelle di zymosan. I nuclei neutrofili sono mostrati in blu. I bersagli zomanti sono contrassegnati da cerchi rossi (barra di scala - 50 m; tempo di acquisizione originale 60 min). Clicca qui per scaricare questo video.

Video S2: Migrazione casuale dei neutrofili non attivata. I nuclei neutrofilo sono mostrati in blu (barra della scala - 50 m; tempo di acquisizione originale - 60 min). Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Abbiamo sviluppato una piattaforma di microstampa per generare array uniformi di bioparticelle per stimolare il brulicare di neutrofoni in vitro. La natura in vitro della nostra piattaforma ci permette di aggirare le complicazioni che sorgono con esperimenti di sciame in vivo, vale a dire la scarsa capacità di analizzare i mediatori rilasciati dai neutrofili brulicanti5. Inoltre, i modelli in vivo vengono in genere eseguiti in roditori11,12,13,15,22,23o pesce zebra11,12,15,23. La nostra piattaforma utilizza neutrofili umani, che ci permette di interpretare più direttamente i nostri risultati nel contesto della malattia umana, anche se alcune somiglianze tra topo e neutrofili umani sono state osservate5,11. Inoltre, manteniamo un ambiente brulicante controllato dallo spazio che distingue la nostra piattaforma dai modelli in vivo fornendo un alto livello di riproducibilità che facilita l'analisi della migrazione collettiva dei neutrofili umani, nonché la raccolta e l'analisi dei mediatori rilasciati dai neutrofili sciamendoli.

Durante lo sviluppo del nostro protocollo di microstampa, sono sorte diverse sfide che hanno richiesto un'attenta risoluzione dei problemi. In primo luogo, il CP utilizzato per il microstamping è altamente idrofilo, e i francobolli PDMS sono idrofobici. Poiché il CP non ha un'alta affinità per il PDMS, la nostra procedura è stata attentamente progettata per evitare la formazione di bolle e promuovere l'umidismo. In primo luogo innesco il francobollo con CP mentre face-up (passaggio 1.8), riduciamo al minimo la formazione di bolle tra il CP e il timbro. Il francobollo viene quindi invertito su uno strato di CP e incubato per 1 h. Questo lungo tempo di incubazione assicura che ogni sezione del francobollo sia bagnata. In secondo luogo, il processo di rimozione di CP in eccesso prima della stampa su uno scivolo di vetro pulito (passaggio 1.11) può essere incoerente. Durante l'esecuzione del passaggio 1.11, il timbro deve essere esaminato attentamente. Quando il motivo inizia a diventare visibile, il timbro è pronto per il passaggio 1.12. Inoltre, il tempo di vuoto richiesto per asciugare i francobolli (passaggio 1.12) può variare. Questo dipende principalmente dal tempo. In una giornata calda e umida, sono necessari 2 min di tempo sottovuoto. In una giornata fredda e secca, 1 min di tempo vuoto è sufficiente.

Abbiamo dimostrato che i neutrofili di donatori sani formano sciami stabili intorno a cluster di bioparticelle. Con la microscopia fluorescente time-lapse, possiamo quantificare le dimensioni dello sciame e la migrazione dei neutrofili, che ci permette di analizzare quantitativamente la chemiotassica neutrofila5. Ad esempio, abbiamo dimostrato in precedenza che questa piattaforma può essere utilizzata per calcolare l'indice chemiotattico (CI, il coseno dell'angolo tra il vettore di velocità dei neutrofili e il vettore di posizione tra il neutrofilo e il cluster di bioparticellepiù vicino), la velocità (distanza che il neutrofilo viaggia divisa per il tempo), la velocità radiale (la velocità moltiplicata per CI) e la distanza totale percorsa (la differenza tra la posizione neutrofila e quella iniziale) dei singoli neutrofi. A differenza della maggior parte degli studi in vitro24,25,26, la nostra piattaforma non ha un gradiente chemiotattico artificiale, quindi la comunicazione intercellulare neutrofilo è l'unica forza motrice della migrazione dei neutrofili. Inoltre, il supernatante generato dai neutrofili brulicanti è facilmente accessibile. Possiamo raccogliere e analizzare il supernatante per i mediatori intercellulari rilasciati dai neutrofili senza interferenze da altri tipi di cellule presenti in vivo. Sono state osservate 16 proteine la cui espressione durante lo sciame potrebbe essere descritta come una delle tre tendenze: aumento (10 proteine), diminuzione (due proteine) e picco (quattro proteine). Sei di queste proteine hanno confermato tendenze precedentemente segnalate durante lo sciame nel tempo5. Alcune delle proteine identificate sono state precedentemente mostrate come specifiche per bruliorismi, mentre altre sono state espresse in modo differenziale da neutrofili non che si spostano ad attivare5. Proteine che aumentano la concentrazione nel tempo sono probabilmente associati con la risposta pro-infiammazione. Alcune delle proteine che aumentano la concentrazione nel tempo sono già note per essere coinvolte nella risposta pro-infiammatoria (ad esempio, galectin-3 e MMP-9)27,28. La relazione tra altre proteine e infiammazione è meno ben compresa. Le proteine che si surriscaldano o diminuiscono durante lo sciame possono essere coinvolte nella regolazione dell'infiammazione. Tuttavia, ulteriore ricerca è necessaria per comprendere il ruolo nell'infiammazione di molte delle proteine che sono espresse in modo differenziale durante lo sciame. L'analisi dei mediatori rilasciati insieme alla migrazione dei neutrofili può aiutarci a comprendere meglio il complesso quadro dell'infiammazione e il modo in cui i neutrofili influiscono sul tessuto circostante durante lo sciame.

In studi futuri, la nostra piattaforma può essere utilizzata per studiare a fondo la capacità dei neutrofili malsani di generare sciami stabili intorno a cluster di bioparticelle modellati. Varie condizioni mediche sono state correlate ai neutrofili, tra cui la sepsi3, il trauma6e il cancro1,8,17,18, il che suggerisce che i neutrofili in questi pazienti potrebbero aver alterato la funzione. Questa piattaforma può essere utilizzata per esaminare le differenze tra i mediatori intercellulari rilasciati da neutrofili sani e malsani. Inoltre, questa piattaforma potrebbe essere modificata per creare microbi vivi e utilizzata per analizzare la risposta dei neutrofili ai microbi vivi in vitro.

In conclusione, abbiamo sviluppato una nuova piattaforma per l'analisi dei neutrofili che brulicano in vitro. La natura altamente controllata della nostra piattaforma ci permette di mitigare i problemi che sorgono durante gli esperimenti di brulicing dei neutrofili in vivo. Neutrophil che brulica su un microarray di microparticelle di bioparticelle è facilmente quantificabile tramite la microscopia fluorescente time-lapse. Inoltre, possiamo raccogliere i mediatori rilasciati dai neutrofili senza l'interferenza di altri tessuti presenti in vivo. Questa piattaforma può essere utilizzata nella ricerca futura per quantificare le differenze tra i comportamenti di migrazione dei neutrofili da donatori sani e malsani.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare William G. Lowrie e dell'Comprehensive Cancer Center presso la Ohio State University. I dati presentati in questo rapporto provengono da immagini elaborate utilizzando Imaris x64 (vers. 9.3.0 Bitplane) disponibili presso il Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Questa struttura è supportata in parte dalla concessione P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18001 Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator Okolab 777057437 / 77057343 Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit STEMCELL Technologies 17957 Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2 Nikon Instruments MEA54010 / MEF55037 Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch Sigma Aldrich Z708925 To cut PDMS stamps
HetaSep STEMCELL Technologies 7906 Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array Raybiotech Inc. AAH-BLG-1000-4 High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA) Sigma Aldrich A5843 Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053 To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes Thermo Fisher Scientific 02-657-32 Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask Front Range Photomask N/A Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner Perkin Elmer ASCNGX00 Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris Bitplane 9.3.0 Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package Nikon Instruments MQS31100 Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) Sigma Aldrich P3069-10MG 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer Grace Bio-Labs 654008 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer University Wafer 590 Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater Laurell WS-650MZ-23NPPB Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025 MicroChem 2025 Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) Dow 1673921 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System Kloé UV-KUB 2 Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water Thermo Fisher Scientific A1287303 High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185 BASF 8185 Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen Z2843 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array

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