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Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

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Genetics

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Summary

Décrit ici est l'utilisation d'une méthode d'amplification de sonde méthylation-spécifique pour analyser des niveaux de méthylation des éléments de LIGNE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires ostéosarcoma-dérivées. L'ultracentrifugation, une procédure populaire pour séparer les vésicules extracellulaires du sérum bovin foetal, est également démontrée.

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Sinha, S., Mannerström, B., Seppänen-Kaijansinkko, R., Kaur, S. LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (156), e60705, doi:10.3791/60705 (2020).

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Abstract

L'amplification de sonde spécifique à la méthylation (MSPA) est une technique simple et robuste qui peut être utilisée pour détecter les différences relatives dans les niveaux de méthylation des échantillons d'ADN. Il est débrouillard, nécessite de petites quantités d'ADN, et prend environ 4 à 5 h de travail pratique. Dans la technique présentée, les échantillons d'ADN sont d'abord dénaturés puis hybridés en sondes qui ciblent l'ADN à des sites méthylés ou de référence comme un contrôle. L'ADN hybride est séparé en réactions parallèles, l'une subissant seulement la ligature et l'autre subissant la ligature suivie de la digestion HhaI-négociée aux séquences non méthylées de GCGC. Les fragments d'ADN qui en résultent sont amplifiés par PCR et séparés par l'électrophorèse capillaire. Les sites GCGC méthylés ne sont pas digérés par HhaI et produisent des signaux de pointe, tandis que les sites GCGC non méthylés sont digérés et aucun signal de pointe n'est généré. La comparaison des pics normalisés de contrôle des versions digérées et non digérées de chaque échantillon fournit le rapport de dosage de méthylation d'un échantillon d'ADN. Ici, MSPA est utilisé pour détecter les effets des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome (VE) sur le statut de méthylation de l'élément nucléaire entrecoupé à long (LINE-1) dans les cellules souches mésenchymales. Les LINE-1 sont des éléments d'ADN répétitifs qui subissent généralement une hypométhylation dans le cancer et, à ce titre, peuvent servir de biomarqueur. L'ultracentrifugation est également utilisée comme méthode rentable pour séparer les vésicules extracellulaires des fluides biologiques (c.-à-d. lors de la préparation du sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques [FBS] et de l'isolation des VE à partir des médias conditionnés par l'ostéosarcome [centrifugation différentielle]). Pour l'analyse de méthylation, les sondes LINE-1 personnalisées sont conçues pour cibler trois sites de méthylation dans la séquence de promoteur LINE-1 et sept sites de contrôle. Ce protocole démontre l'utilisation de MSPA pour l'analyse de méthylation LINE-1 et décrit la préparation de LA SF APPAUVRIe par ultracentrifugation.

Introduction

La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique majeure qui se produit dans les cellules humaines. La méthylation de l'ADN fait référence au lien entre les groupes méthyliques et les résidus de cytosine dans les dinuccléotides du CpG. De tels dinucleotides se trouvent habituellement dans les grappes (îles CpG) à la région de 5' des gènes1. Dans les cellules normales, la plupart de ces dinucléotides existent dans un état non méthylé, ce qui permet la transcription de l'ADN. Incidemment, de nombreux cancers sont associés à des îles cpG hyperméthylées et au silençage transcriptomique2, en particulier dans les gènes suppresseurs de tumeurs, qui à leur tour contribuent à diverses caractéristiques du cancer3.

D'autre part, les éléments nucléaires entrecoupés de longue durée-1 (LINE-1 ou L1) sont des éléments d'ADN répétitifs et transposables qui ont normalement des niveaux élevés de méthylation dans les îles CpG. La méthylation de LINE-1 empêche la translocation et aide à maintenir l'intégrité du génome. Dans plusieurs types de cancer, LINE-1 est hypométhylé, ce qui entraîne l'activation et l'instabilité chromosomique rétrotransposition-négociée subséquente4. LINE-1 représente près de 17% du génome humain5, et son statut de méthylation peut servir d'indicateur des niveaux de méthylation génomique mondiale6. L'hypométhylation globale de LINE-1 est considérée pour précéder la transition des cellules à un phénotype de tumeur7; par conséquent, il est prometteur comme marqueur potentiel pour l'début précoce du cancer.

Actuellement, il existe plusieurs méthodes pour l'analyse de la méthylation, y compris le pyrosequencing, la méthylation spécifique PCR, microarrays, et l'immunoprécipitation de chromatine1. L'utilisation du séquençage de nouvelle génération a également permis d'intégrer des approches à l'échelle du génome pour la détection de la méthylation de l'ADN. Bon nombre de ces méthodes reposent sur l'ADN traité au bisulfite, dans lequel les cytosines non méthylées sont converties en uracil et les cytosines méthylées restent inchangées. Cependant, le travail avec l'ADN bisulfite-traité a plusieurs pièges, tels que les conversions incomplètes des cytosines unmethylées à l'uracil, l'amplification biaisée des séquences, et les erreurs de séquençage8.

Dans l'amplification de sonde méthylation-spécifique (MSPA), les sondes composées de deux oligonucléotides ciblent des séquences d'ADN contenant un emplacement de restriction (GCGC) pour l'enzyme de restriction méthylation-sensible HhaI9. Une fois que les sondes s'hybrident à l'ADN, chaque échantillon est divisé en deux ensembles. Les sondes dans le premier ensemble subissent une ligature, tandis que les sondes dans le deuxième ensemble subissent une ligature suivie d'une digestion Médiée par HhaI sur les sites CGCG non méthylés. Les deux ensembles d'échantillons sont ensuite amplifiés par PCR, et les produits sont séparés par l'électrophorèse capillaire. Les sondes sur les sites non méthylés sont digérées par HhaI et ne sont pas amplifiées pendant le PCR, ce qui n'entraîne aucun signal de pointe. En revanche, les sondes sur les sites méthylés sont protégées de la digestion et sont donc amplifiées pendant pcR, générant par la suite des signaux de pointe10.

MSPA a plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives. Tout d'abord, il nécessite une faible quantité d'ADN (50 à 100 ng) et est bien adapté pour l'analyse de l'ADN à partir d'échantillons de paraffine fixée parlinanine formaline10. Il ne nécessite pas d'ADN bisulfite-traité; en fait, il est impropre à l'ADN qui est modifié de cette façon. De nombreux échantillons peuvent être analysés en même temps, et les sondes MSPA peuvent être conçues de telle sorte qu'elles ciblent plusieurs gènes ou séquences simultanément. En outre, les sondes sont spécifiques et sensibles pour l'ADN méthylé que le site de restriction HhaI correspond à une séquence qui est typique des îles CpG10.

Cette étude a étudié les effets des vésicules extracellulaires (VES) dérivées de l'ostéosarcome (OS) sur la méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales dérivées du tissu adipeux (AT-MSCs; Figure 1). Les véhicules électriques sont des vésicules à l'échelle nanométrique et membranaire sécrétées par la plupart des types de cellules. Ils transportent des protéines, des lipides, de l'ARNm, des microARN et des molécules supplémentaires provenant des cellules parentes11,12. Les véhicules électriques jouent la médiation de la communication intercellulaire et jouent des rôles importants dans plusieurs conditions pathophysiologiques13,14. Une étude récente a montré que les véhicules électriques dérivés du cancer peuvent transférer le LINE-1 actif aux cellules receveuses15. Il a été rapporté plus tôt que les véhicules électriques de la lignée cellulaire HOS-143B peuvent modifier le statut de méthylation de LINE-1 dans les MSC, en plus d'autres effets génétiques16.

Lors de la culture des cellules pour l'isolement des véhicules électriques, il est important d'utiliser le sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques dans le milieu de croissance, puisque les véhicules électriques dérivés du FBS peuvent interférer avec les véhicules électriques provenant d'autres sources et entraver les résultats17,18. L'ultracentrifugation est l'une des méthodes les plus courantes pour épuiser les véhicules électriques de FBS. Il s'agit d'une procédure relativement simple et rentable par rapport à des alternatives telles que l'ultrafiltration et commerciale EV-appauvri FBS19. Ici, le protocole montre également comment préparer EV-appauvri FBS par ultracentrifugation.

Cet article présente un protocole détaillé pour les techniques susmentionnées, de l'isolement des véhicules électriques d'une lignée cellulaire OS à l'analyse de méthylation de LINE-1 dans les MSC traités PAR OS-EV (Figure 1).

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Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique d'Helsinki et le district hospitalier d'Uusimaa (approbation éthique D. No. 217/13/03/02/2015).

1. Préparation de FBS EV-appauvri par ultracentrifugation

  1. Prenez FBS dans des tubes (ultra)centrifugeurs et placez-les dans des seaux ultracentrifuges. Pour s'assurer que l'ultracentrifugation fonctionne sans heurts et en toute sécurité, équilibrez les seaux à moins de 10 mg les uns des autres.
  2. Chargez les seaux sur un rotor oscillant (type SW28, k-facteur 246). Placer le rotor dans l'ultracentrifuge et courir à 100 000 x g pendant 19 h à 4 oC.
  3. Recueillir soigneusement la couche supérieure de couleur claire du supernatant (environ neuf dixièmes) et transférer dans un tube de 50 ml. Ne pas déranger ou pipette la granule brun foncé, car il contient des véhicules électriques de FBS.
  4. Passer le supernatant à travers un filtre de 0,22 m dans un nouveau tube de 50 ml.
  5. Ajoutez le FBS stérilisé par filtre et appauvri par les véhicules électriques aux milieuis de culture cellulaire lors de la croissance des cellules pour l'isolement des véhicules électriques.

2. Isolement des véhicules électriques dérivés de l'ostéosarcome

  1. Cellules d'OS de plaque (ligne cellulaire hos-143B) dans un flacon de T-175 avec rpMI 1640 milieu, complété avec 10% normal FBS et 1% antibiotiques (100 U/mL pénicilline, 0.1 mg/mL streptomycine). Placer le flacon dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Lorsque le flacon est de 70 % à 80 % de confluents, lavez les cellules à l'alin tamponné par le phosphate (PBS) puis développez-les dans des médias contenant 10 % de FBS appauvri par les véhicules électriques (ci-après appelés médias appauvris par les véhicules électriques).
    REMARQUE : 1 x 106 cellules HOS-143B plaquées dans un flacon T175 atteignent 70 % de confluence après environ 60 h.
  3. Au cours des 48 heures suivantes, recueillir les médias conditionnés à partir de cellules d'ostéosarcome après chaque 24 h et ajouter des médias frais EV appauvri.
  4. Centrifuger le support conditionné à 2500 x g pendant 20 min à 4 oC pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Transférer le supernatant dans un nouveau tube, en laissant environ 2 ml de support au fond.
    REMARQUE : S'il n'est pas directement en phase avec l'isolement des véhicules électriques à ce stade, le supernatant peut être stocké à -80 oC.
  5. Verser le supernatant dans des tubes d'ultracentrifuge et les équilibrer plus tôt. Centrifuger les tubes à 100 000 x g pour 2 h à 4 oC.
  6. Jetez soigneusement le supernatant, en laissant environ 1 ml au fond. Ajouter environ 20 ml de PBS (0,1 m filtré) au tube et à la pipette doucement pour laver et suspendre à nouveau le granule EV.
  7. Équilibrez les tubes et effectuez un autre cycle d'ultracentrifugation avec les mêmes réglages.
  8. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille EV en 200 L de PBS par pipetting douce. Conservez les véhicules électriques dans des tubes à faible liaison.
    REMARQUE : Les véhicules électriques peuvent être utilisés immédiatement ou entreposés dans -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.

3. Caractérisation des OS-EV

REMARQUE : Les véhicules électriques purifiés peuvent être caractérisés par des ballonnements occidentaux (WB), l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique de transmission (TEM)16.

  1. Effectuer WB selon le protocole standard16 avec des marqueurs EV CD63, TSG101, et Hsp70, et avec la calnexine comme un contrôle négatif pour indiquer la pureté de l'échantillon EV20.
  2. Pour NTA, diluer d'abord l'échantillon EV dans le PBS filtré de 0,1 m de Dulbecco pour obtenir (idéalement) 30 à 100 particules par image.
    1. Prenez environ 500 l'échantillon dans une seringue de 1 ml et chargez-le dans le port d'entrée de l'instrument NTA. Vérifiez qu'il y a suffisamment de particules par image, pour des mesures précises.
    2. Ouvrez le logiciel NTA et enregistrez cinq vidéos de durée de 60 s, en utilisant le niveau de la caméra 13 à température ambiante. Pendant l'analyse, utilisez le seuil de détection de 5 et le gain de 10.
  3. Analyser les échantillons de véhicules électriques par TEM tel que décrit précédemment21.

4. Culture AT-MSC

REMARQUE : Le tissu adipeux humain pour l'isolement mésenchymal de cellules souches a été fourni comme aspiration de liposuccion (Département de chirurgie plastique, Laser Tilkka Ltd., Finlande). Le consentement éclairé écrit a été pris des donateurs de lipoaspirate, qui subissaient des procédures électives de liposuccion.

  1. Isoler les AT-MSC des aspirates de la liposuccion en utilisant des méthodes d'isolation mécaniques et enzymatiques standard22.
    REMARQUE : Des MSC d'autres sources (y compris les lignées cellulaires commerciales) peuvent également être utilisés.
  2. Les cellules de culture dans les médias d'DMEM/F-12 ont complété avec 10% FBS et 1% antibiotiques.

5. Traitement des MSC avec OS-EV

  1. Plaque 15 000 AT-MSC par puits dans une assiette de 24 puits.
  2. Après 24 h, retirez les vieux supports, lavez les cellules avec du PBS et changez-les en médias appauvris par les véhicules électriques.
  3. Traiter les cellules avec os-VE (à une concentration de particules de 1 x 106 VÉHICULES électriques par cellule) le jour 1 (24 h après l'adhérence cellulaire), le Jour 3 (48 h après le jour 1) et le Jour 5 (96 h après le jour 1).
    1. Arrêter le traitement OS-EV pour les échantillons de point de temps (TP) 0 le jour 1, les échantillons TP 3 le jour 3 et Les échantillons TP 7 le jour 7 (48 h après le jour 5).
      REMARQUE : D'autres calendriers temporels selon les plans expérimentaux peuvent également être suivis.
  4. Extraire l'ADN des MSC en utilisant une méthode appropriée. Inclure des échantillons de contrôle positifs et négatifs pour l'analyse des données.

6. Ligne-1 méthylation d'assay

  1. Concevoir les amorces de sonde LINE-1 personnalisées, comme cela a déjà été fait par Pavicic et coll.23. Pour les sondes de méthylation, sélectionnez trois séquences contenant le site de restriction HhaI dans la région promoteur de LINE-1. Pour les sondes de contrôle, sélectionnez sept séquences dépourvues du site de restriction HhaI du reste de la séquence LINE-1.
    REMARQUE : La séquence LINE-1 est disponible dans la base de donnéesGenBank 24 (L1.2, accession no. AH005269.2). Utilisez les instructions du fabricant MSPA pour la conception des sondes25.
  2. Diluer 70 ng d'échantillon d'ADN dans un tampon TE à un volume de 5 L.
  3. Effectuer les étapes subséquentes de thermocyclisme et de PCR comme mentionné dans le tableau 1. Chauffer les échantillons pendant 10 min à 98 oC, puis laisser refroidir à 25 oC.
  4. Ajoutez un mélange d'hybridation de sonde de 3 ll à chaque échantillon et exécutez le thermocycleur pour permettre aux sondes de s'hybrider à l'ADN.
  5. À température ambiante (RT), ajouter 13 ll de mélange post-hybridation à chaque échantillon. Transférer 10 l dans un deuxième tube.
  6. Placer les deux ensembles de tubes dans le thermocycler et couver à 48 oC pendant au moins 1 min.
    1. Alors que les échantillons sont à 48 oC, ajouter 10 oL du mélange de ligature à la première série de tubes (série non digérée) et 10 l du mélange ligature-digestion à la deuxième série de tubes (série digérée). Exécutez le prochain programme de thermocycler.
  7. Faites tourner les tubes et fixez simultanément le thermocycleur à 72 oC.
  8. Ajouter 5 ll de mélange de polymérase à chaque tube et placer les tubes dans le thermocycleur. Exécutez le programme PCR.
  9. Pendant que le programme PCR est en cours d'exécution, préparer une solution de 1 ml de formamide contenant 2,5 l de norme de taille. Pipette 10 l de cette solution à chaque puits d'une plaque optique de puits 96 (avec code à barres).
  10. Après PCR, diluer les échantillons non digérés et digérés à 1:100 et 1:200 respectivement dans l'eau ultrapure. Ajouter 2 L de produit PCR dilué à la plaque de puits 96. Centrifuger la plaque à 200 x g pour 15 à 20 s pour enlever les bulles d'air.
  11. Effectuer l'analyse fragmentaire d'échantillons par électrophoresis capillaire.
    REMARQUE : La plaque doit être entreposée à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à l'analyse.

7. Analyse des données fragmentaire

  1. Ouvrir l'électrophoresis capillaire entraîne un logiciel d'analyse d'électrophéromigramme.
    1. Sous la colonne Panel, pour l'un des échantillons, choisissez MLPA dans le menu. Cliquez sur l'en-tête du panneau et appuyez sur Ctrl-D pour appliquer MLPA à tous les échantillons.
    2. De la même manière, définir la méthode d'analyse par défaut Microsatellite pour tous les échantillons.
    3. Sélectionnez tous les échantillons et cliquez sur le bouton de lecture verte pour analyser les échantillons selon les paramètres choisis.
    4. Sélectionnez tous les échantillons et cliquez sur le bouton Graphique pour visualiser les pics de la sonde.
    5. Zoom sur la région de pointe pour une résolution plus élevée des pics de sonde individuels. Assurez-vous que les 10 pics correspondant aux sondes du mix de sonde LINE-1 sont étiquetés. Jetez les pics supplémentaires (lt;95 bp et '160 bp).
    6. Dans l'onglet Génotypes, exportez les résultats dans le format des valeurs de virgule séparées (CSV).
  2. Ouvrez le fichier CSV dans un logiciel d'analyse de données et triez les données en colonnes.
    1. Étiquetez les trois pics du site de méthylation en fonction de leur taille approximative (L1-1m à 153 bp, L1-2m à 119 bp, L1-3m à 133 bp). Les sept autres pics correspondent aux sondes de contrôle.
      REMARQUE: Ici, les valeurs des pics de sonde L1-2m sont utilisés, qui ont une taille de 117 bp, puisque cette région a été utilisée dans la plupart des essais de méthylation LINE-123.
    2. Pour chaque échantillon (non digéré et digéré), calculez la superficie maximale des sept pics témoins. Divisez la zone de pointe de chaque sonde LINE-1 par cette somme.
    3. Pour chaque échantillon d'ADN, divisez la valeur de l'échantillon digéré par celle de l'échantillon non digéré pour obtenir le rapport de dosage de méthylation (DM)en utilisant l'équation suivante :
      Equation 1
      Où: DM est le rapport de dosage de méthylation, Ax est la zone sous le pic x (par exemple, L1-2m pic), et Actrl est la zone de pointe de somme des sept sondes de contrôle.

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Representative Results

L'objectif principal de cette étude était d'évaluer les effets épigénétiques des OS-VE sur les MSC. OS-VE ont été isolés à partir de cellules HOS-143B en utilisant la méthode standard de centrifugation différentielle. L'expression des marqueurs EV typiques CD63, Hsp70 et TSG101 par le ballonnement occidental a confirmé la présence d'OS-EV. (Figure 2A). L'absence de signal de calnexin a indiqué la pureté de l'isolat d'OS-EV. D'autres indications de pureté ont été observées avec TEM, avec des vésicules intactes de différentes tailles étant présentes (figure 2B). La concentration moyenne de particules OS-EV était de 7,63x1011/mL (figure 2C). La distribution de la taille des véhicules électriques variait de 50 à 500 nm, environ 80 % des particules se situant dans une fourchette de 50 à 200 nm(figure 2D).

Les AT-MSC ont été traités avec des OS-EV et l'ADN a été extrait des MSC à différents moments. La méthylation LINE-1 a été analysée par MS-MLPA et calculée en termes de rapport de dosage de méthylation. Les résultats de TP 0 ont été utilisés pour déterminer les niveaux de méthylation de base (ligne pointillée) (figure 3). Chez TP 3 (colonnes vertes), on a observé une diminution du rapport de dosage moyen de méthylation LINE-1 chez les SSM lorsqu'il est traité avec des OS-VE, tombant sous les niveaux de méthylation de base. Ce phénomène hypométhylant était plus subtil au TP 7 (colonnes bleues), et le rapport moyen de dosage de méthylation était légèrement plus haut dans les MSC non traités et EV-traités comparés à la ligne de base.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail expérimental. Les véhicules électriques ont été isolés des cellules HOS-143B par centrifugation différentielle et caractérisés par le ballonnement occidental, le TEM et le NTA. Les AT-MSC ont été traités avec des OS-VE à différents moments (TP 0, 3, un 7). L'ADN a été extrait des MSC et la méthylation LINE-1 a été analysée par MSPA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation des véhicules électriques. (A) La présence de marqueurs EV CD63, Hsp70 et TSG101 a confirmé la présence de véhicules électriques par des ballonnements occidentaux, alors qu'aucune bande n'a été observée pour la calnexine, indiquant la pureté de l'isolat EV. 10 g de protéines ont été chargés pour le lysate protéique HOS-143B et les VÉHICULES-OS. (B) TEM a confirmé la présence de véhicules électriques intacts de différentes tailles dans l'isolat. (C) La concentration de particules et la distribution de la taille (D) des OS-VE ont été déterminées par des mesures NTA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Ratios de dosage de méthylation de LINE-1 provenant des MSC non traités ou traités avec des OS-VE. La ligne grise pointillée représente la valeur de méthylation de base, correspondant aux valeurs TP 0. Les colonnes vertes représentent les ratios moyens de dosage de méthylation sans et avec le traitement OS-EV pour les échantillons de TP 3, tandis que les colonnes bleues représentent la même chose pour les échantillons de TP 7. Les échantillons de TP 3 et de TP 7 ont montré une diminution des niveaux de méthylation après traitement avec OS-EV. Cependant, la différence était plus grande dans les échantillons de TP 3, où le niveau de méthylation après le traitement de EV était également inférieur à la valeur de ligne de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Recettes de mélange de réactifs MSPA et programmes thermocycler/PCR. Les volumes mentionnés représentent un échantillon d'ADN. Il convient de noter que le mélange de polymérase doit être préparé pour 2x autant d'échantillons que les mélanges précédents, car il ya deux ensembles de tubes à ce stade. Les détails du programme de thermocyclisme ou de PCR subséquent sont fournis à droite.

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Discussion

Cette étude illustre comment MSPA peut être utilisé pour détecter et quantifier le statut de méthylation d'un élément génétique spécifique. LINE-1 a été l'objet ici, mais les sondes peuvent être conçues pour cibler une gamme de gènes et de séquences. En outre, il existe une liste croissante de mélanges de sondes disponibles pour différentes applications. MSPA est une technique simple et robuste pour l'analyse de méthylation de l'ADN qui ne nécessite pas de conversion bisulfite10. La procédure complète de la préparation de l'échantillon à l'analyse des données prend environ 2 jours, mais ne concerne que 4 à 5 heures de travail pratique réel. Il est applicable pour de petites quantités d'ADN (aussi bas que 70 ng), comme démontré ici.

La partie la plus importante du protocole d'analyse de méthylation est la préparation de mélanges de sondes personnalisés, tels que le mix de sonde LINE-1 dans cette étude. En raison de leurs différentes longueurs, les oligonucléotides de sonde LINE-1 ont été synthétisés dans la gamme de 4 à 40 nM, de sorte que l'étape de dissolution et les dilutions subséquentes ont dû être effectuées avec soin, conformément aux instructions du fabricant25. Le PCR et plusieurs programmes de thermocyclisme du protocole utilisés ici diffèrent de ceux de la version originale du fabricant.

Il y a quelques précautions concernant l'enzyme HhaI. Tout d'abord, le volume d'enzymes utilisées dans le mélange ligature-digestion dépend du fabricant, et les versions de l'enzyme qui sont résistants à l'inactivation de la chaleur ne sont pas adaptés à MSPA. Avec certaines enzymes, il peut y avoir des cas de digestion incomplète, ce qui entraînerait la formation de produits PCR défectueux et des signaux de pointe aberrants. Enfin, la mesure dans laquelle les produits PCR finaux sont dilués pour l'électrophoresis capillaire dépend des sondes. Les premières exécutions sont susceptibles d'impliquer des optimisations, pour lesquelles il est recommandé de tester une gamme de dilutions.

Il y a certaines limitations de MSPA, telles que la nature sélective de la digestion d'ADN HhaI-négociée. Hha Hha Je ne clôt l'ADN qu'aux séquences GCGC non méthylées et je ne tiens pas compte d'autres cas de dinucléotides cpG qui ne sont pas entourés d'un G et d'un C, même s'ils se trouvent dans les îles CpG. Par conséquent, l'état de méthylation de ces dinucléotides (et ceux qui sont situés à l'extérieur de la séquence cible des sondes) ne peut pas être déterminé. Le mix de sonde LINE-1 peut inclure plus de sondes contenant des séquences GCGC supplémentaires de la région du promoteur24, représentant ainsi un plus grand nombre de sites de méthylation.

Alternativement, d'autres enzymes de restriction spécifiques à la méthylation, telles que SacII et MluI, qui ont un site de restriction différent de celui de HhaI peuvent être en outre utilisés dans MSPA, qui peut fournir une représentation plus large des niveaux mondiaux de méthylation26. Deuxièmement, comme observé avec des échantillons de TP 7, les différences dans le rapport de dosage de méthylation peuvent être tout à fait subtiles. Cela peut être dû au nombre élevé de copies de LINE-1 dans le génome5, qui ont des niveaux élevés de méthylation globale dans des conditions normales et ne seront en grande partie pas affectés par les événements d'hypométhylation transitoire dans seulement quelques sites cpG. En outre, les MSC sont hétérogènes en termes de stade de différenciation et du cycle cellulaire, ce qui peut affecter la valeur de méthylation de base. Enfin, MSPA ne peut détecter que les différences relatives dans la méthylation de l'ADN et nécessite des échantillons de référence pour cette raison. Dans de tels cas, les méthodes qui détectent directement la méthylation locale peuvent être plus appropriées, bien qu'elles puissent nécessiter l'étape de conversion bisulfite27.

Puisque cette étude a impliqué l'utilisation des vésicules extracellulaires, nous avons également démontré la préparation du FBS EV-appauvri, qui est une composante essentielle des médias de culture cellulaire pour l'isolement de EV. L'ultracentrifugation est un processus peu coûteux qui peut effectivement séparer les véhicules électriques du reste du FBS. Cependant, les 19 h de centrifugation en font une méthode plus longue que les alternatives, telles que l'ultrafiltration et les versions commerciales19. L'ultracentrifugation nécessite également une manipulation soigneuse de l'échantillon, par exemple lors de l'équilibrage des tubes avant la centrifugation et la collecte du supernatant par la suite. Malgré ces défis, il s'agit d'une méthode populaire pour séparer les véhicules électriques des fluides biologiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par le financement du projet de l'Université d'Helsinki (WBS490302, WBS737141112) du financement de l'Hôpital universitaire d'Helsinki pour la recherche en santé au niveau universitaire (Y1014SUL05, TYH2016130), la Fondation médicale finno-norvégienne et la Fondation médicale finno-norvégienne, et Fonds Maja-Lisa Selander (Fondation Minerva). Nous remercions Walter Pavicic d'avoir fourni le protocole MSPA modifié et du soutien technique connexe. Nous sommes reconnaissants à Teemu Masalin (Université d'Helsinki) de nous avoir aidés avec la production vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Terumo SS+01T1 for NTA
24-well plate Corning 3524 MSC cell culture
3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific 3730XL
50 mL centrifuge tube Corning 430829
Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge Beckman
BlueStar Prestained Protein Marker Nippon Genetics MWP03 WB: protein marker
Calnexin (clone C5C9) Cell Signaling Technology 2679 WB, dilution 1:800
CD63 (clone H5C6) BD Biosciences 556019 WB, dilution 1:1000
Centrifuge 5702 R Eppendorf 5703000010 For conditioned media and cells
Centrifuge 5810 Eppendorf 5810000010 For spinning down 96-well plate
Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) Beckman 331374 Ultracentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX medium Gibco, Life Technologies 31331-028 For AT-MSC culture
Fetal bovine serum Gibco, Life Technologies 10270-106
GeneScan 500 LIZ size standard Applied Biosystems, Life Technologies 4322682 for capillary electrophoresis
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2-10RXN for MSPA negative control
Hi-Di formamide Applied Biosystems, Life Technologies 4311320 for capillary electrophoresis
HOS-143B cell line ATCC CRL-8303
Hsp70 (clone 5G10) BD Biosciences 554243 WB, dilution 1:1000
IRDye 800CW Goat anti-mouse Li-Cor 926-32210 WB: secondary
IRDye 800CW Goat anti-rabbit Li-Cor 926-32211 WB: secondary
LINE-1 probe-mix primers IDT Sequences in Table 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode Applied Biosystems, Life Technologies 4306737 also requires sealing film
Micro BCA Protein Assay kit ThermoFisher Scientific 23235 measure protein concentration
MiniProtean TGX 10% gels Bio-Rad 456-1034 WB: gel electrophoresis
NanoSight LM14C Malvern Instruments for NTA
Nitrocellulose membrane 0.2 µm Bio-Rad 1620112 WB: protein transfer
NucleoSpin Tissue XS Macherey-Nagel 740901.50 for DNA extraction
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 WB: blocking, antibodies
PBS, 1X Corning 21-040-CVR
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies DE17-602E Antibiotics for culture media
Protein LoBind tube, 0.5 mL Eppendorf 22431064 For storing Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit Li-Cor 926-11015 WB: total protein staining
RKO cell line ATCC CRL-2577 for MSPA positive control
RPMI medium 1640 + GlutaMAX Gibco, Life Technologies 61870-010 For HOS-143B cell culture
SALSA MLPA HhaI enzyme MRC-Holland SMR50
SALSA MLPA reagent kit MRC-Holland EK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mix MRC-Holland P300-100R
Swinging rotor SW-28 Beckman Coulter 342207 Ultracentrifugation
Syringe filter, 0.22 µm Jet Biofil FPE-204-030 sterile filtering FBS
Tecnai 12 FEI Company equipped with Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., USA); for TEM
TBS, 1X tablets Medicago 09-7500-100 WB: buffer
Trans-Blot Turbo Bio-Rad WB: transfer
Thermal cycler ThermoFisher Scientific TCA0096
TrypLE Express Gibco 12604-021 for trypsinization of cells
TSG101 (clone 4A10) Sigma SAB2702167 WB, dilution 1:500

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References

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