Stabil knockdown av gener koding ekstracellulære matrise proteiner i C2C12 Myoblast Cellelinje ved hjelp av små hårnål (sh) RNA

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi gir en protokoll for å stikke ned gener som koder ekstracellulære matriseproteiner (ECM) i C2C12 myoblaster ved hjelp av små hårnål (sh) RNA. Rettet mot ADAMTSL2 som et eksempel, beskriver vi metodene for validering av knockdown-effektiviteten på mRNA-, protein- og cellenivå under C2C12 myoblast til myotubedifferensiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ekstracellulære matriseproteiner (ECM) er avgjørende for skjelettmuskulaturutvikling og homeostase. Den stabile knockdown av gener koding for ECM proteiner i C2C12 myoblaster kan brukes til å studere rollen til disse proteinene i skjelettmuskulatur utvikling. Her beskriver vi en protokoll for å tømme ECM-proteinet ADAMTSL2 som et eksempel ved hjelp av små hårnål (sh) RNA i C2C12-celler. Etter transfeksjon av shRNA plasmider ble stabile celler batchvalgt ved hjelp av puromycin. Vi beskriver videre vedlikehold av disse cellelinjene og fanotysk analyse via mRNA-uttrykk, proteinuttrykk og C2C12-differensiering. Fordelene med metoden er den relativt raske generasjonen stabile C2C12 knockdown celler og pålitelig differensiering av C2C12 celler i multinucleated myotubes ved uttømming av serum i cellekulturmediet. Differensiering av C2C12-celler kan overvåkes av lyse feltmikroskopi og ved å måle uttrykksnivåene av kanoniske markørgener, som MyoD, myogenin eller myosin tungkjede (MyHC) som indikerer utviklingen av C2C12 myoblastdifferensiasjon i myotubes. I motsetning til den forbigående nedslåingen av gener med småforstyrrende (si) RNA, kan gener som uttrykkes senere under C2C12-differensiering eller under nærotubemodning målrettes mer effektivt ved å generere C2C12-celler som stabilt uttrykker shRNA. Begrensninger av metoden er en variasjon i knockdown effektivitet, avhengig av den spesifikke shRNA som kan overvinnes ved hjelp av genknockout strategier basert på CRISPR / Cas9, samt potensielle off-target effekter av shRNA som bør vurderes.

Introduction

Extracellular matrix (ECM) proteiner gir strukturell støtte for alle vev, megle celle-celle kommunikasjon, og bestemme celle skjebne. Dannelsen og dynamisk ombygging av ECM er dermed avgjørende for å opprettholde vev og organ homeostase1,2. Patologiske varianter i flere gener koding for ECM proteiner gi opphav til muskel- og skjelettlidelser med fenotyper som spenner fra muskeldystrofi til pseudomouscular bygge3,4. For eksempel forårsaker patogene varianter i ADAMTSL2 den ekstremt sjeldne muskel-skjelettforstyrrelsen geleofysic dysplasi, som presenterer med pseudomuskulær konstruksjon, det vil si en tilsynelatende økning i skjelettmuskulaturmasse5. Sammen med genuttrykksdata hos mus og mennesker, antyder dette en rolle for ADAMTSL2 i skjelettmuskulaturutvikling eller homeostase6,7.

Protokollen som vi beskriver her ble utviklet for å studere mekanismen som ADAMTSL2 modulerer skjelettmuskulaturutvikling og/eller homeostase i en cellekultursetting. Vi slo ned ADAMTSL2 i cellelinjen murine C2C12 myoblast. C2C12 myoblaster og deres differensiering i myotubes er en godt beskrevet og mye brukt cellekulturmodell for skjelettmuskeldifferensiering og skjelettmuskelbioengineering8,9. C2C12-celler går gjennom forskjellige differensieringstrinn etter serumuttak, noe som resulterer i dannelse av multinukleerte myotubes etter 3-10 dager i kultur. Disse differensieringstrinnene kan pålitelig overvåkes ved å måle mRNA-nivåer av forskjellige markørgener, som MyoD, myogenin eller myosin tungkjede (MyHC). En fordel med å generere stabile genknockdowns i C2C12-celler er at gener som uttrykkes i senere stadier av C2C12-differensiering kan målrettes mer effektivt, sammenlignet med forbigående knockdown oppnådd ved småforstyrrende (si) RNA, som vanligvis varer i 5−7 dager etter transfeksjon, og påvirkes av transfeksjonseffektiviteten. En annen fordel med protokollen som beskrevet her er den relativt raske generasjonen av partier av C2C12 knockdown celler ved hjelp av puromycin utvalg. Alternativer, for eksempel CRISPR/Cas9-mediert genknockout eller isolering av primære skjelettmuskulaturforløpere fra henholdsvis humane eller mål-genets mangelfulle mus, er teknisk mer utfordrende eller krever tilgjengelighet av pasientmuskelbiopsier eller målgensmangelfulle mus. I midlertid, i likhet med andre cellekulturbaserte tilnærminger, er det begrensninger i bruken av C2C12-celler som modell for skjelettmuskelcelledifferensiering, for eksempel cellekulturoppsettets todimensjonale (2D) og mangelen på in vivo mikromiljøet som er avgjørende for å opprettholde udifferensierte skjelettmuskulaturceller10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøre shRNA Plasmid DNA fra Escherichia coli

  1. Generasjon klonale bakterielle kolonier som bærer shRNA plasmids
    1. Få glyserolbestander av E. coli som bærer målspesifikke shRNA plasmider og en kontrollplasmid fra kommersielle kilder (Materialtabell).
      MERK: Tre forskjellige shRNA plasmider ble brukt, rettet mot ulike regioner av murine Adamtsl2 mRNA. En shRNA ble valgt til å målrette mot 3'-untranslated region (3'UTR) av Adamtsl2 for å lette redningseksperimenter med uttrykk plasmids koding rekombinant full lengde ADAMTSL2 eller individuelle ADAMTSL2 proteindomener. I tillegg ble en kryptert shRNA plasmid inkludert som en negativ kontroll. Detaljer om shRNA-sekvensene er gitt i figur 1A.
    2. Tin shRNA bakteriell glyserol lager ved romtemperatur (RT). Overfør 10 μL bakteriell glyserollager på en Luria-Bertani (LB) agarplate supplert med 100 μg/ml ampicillin (LB-Amp).
      MERK: LB-Amp plater er utarbeidet ved autoclaving 1 L lb medium (for 1 L: 10 g tryptone, 5 g gjær ekstrakt, 10 g NaCl, justere pH til 7.0) sammen med 12 g agar. La mediet avkjøles til ~ 50 °C og tilsett ampicillin (lagerløsning: 50 mg/ml i sterilt vann) til en endelig konsentrasjon på μg/ml (LB-Amp agar). Hell umiddelbart ~ 20 ml LB-Amp agar i en 10 cm Petri-tallerken og la agaren stivne før bruk. 1 L LB-Amp agar er vanligvis tilstrekkelig til å helle ca 40 10 cm Petri retter. Petriretter som inneholder LB-Amp agar er stabile i minst en måned hvis de lagres forseglet ved 4 °C i mørket.
    3. Spre bakterier med steril Drygalski slikkepott eller annen passende metode for å oppnå enkle bakterielle kolonier. Inkuber bakterieplater opp ned over natten ved 37 °C.
  2. Plasmid forberedelse
    1. Neste morgen fjerner du Petri-fatet med de enkelte bakteriekoloniene og lagrer ved 4 °C for å unngå overvekst av bakteriekoloniene og dannelsen av satellittkolonier. Forsegle Petri-fatet hvis den lagres over natten eller lenger.
    2. På ettermiddagen, tilsett 5 ml LB-Amp medium i en polypropylen bakteriell kultur tube. Velg en enkelt bakteriell koloni fra Petri-fatet kultivert over natten med en pipettespiss og inokulerLB-Amp medium ved å kaste ut pipettespissen i bakteriekulturrøret som inneholder LB-Amp-mediet.
    3. Inkuber bakteriell kultur over natten i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C med lokket løst festet for å tillate aerasjon.
    4. Ta ut bakteriell kultur rør neste morgen og holde på 4 ° C for å unngå bakteriell overvekst. På ettermiddagen, resuspendere bakterier ved virvlende og overføre 1 ml av natten bakteriell kultur i 50 ml LB-Amp medium i en 250 ml konisk kolbe. Inkuber over natten i en shaker ved 250 o/min ved 37 °C.
    5. Neste morgen overføres bakterier til et 50 ml engangssentrifugerør og sentrifugebakterier ved 6000 x g ved RT i 15 min. Fjern mediet og fortsett med trinn 1,2,6.
      MERK: Hvis plasmid DNA ikke kan isoleres umiddelbart, fjern LB-Amp-mediet etter sentrifugeringstrinnet og oppbevar bakteriepelleten ved -20 °C.
    6. Følg instruksjonene for plasmid preparatsett (midi skala) for å trekke ut plasmid DNA fra bakteriene. Vurder plasmid DNA-kvalitet ved å måle A260/A280-forholdet ved hjelp av et spektrostometer.
      MERK: EtA 260/A280-forhold på > 1,8 er ønskelig, noe som indikerer høy renhet av plasmid DNA-preparatet. Et lavere A260/A280-forhold antyder kontaminering med protein eller utilstrekkelig fjerning av ekstraksjonsreagenser. Ytterligere plasmid rensing trinn kan være nødvendig.

2. Kuling og transfeksjon av C2C12 celler og puromycin valg

  1. C2C12 cellekultur
    1. Tin C2C12 celler (Materialtabell) raskt i et 37 °C vannbad og hell celler i sterildisponibel 15 ml sentrifugerør som inneholder 8 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) medium supplert med 100 enheter penicillin og streptomycin antibiotika (serumfri DMEM) i en cellekultur hette. Sentrifugeceller i 3 min ved 160 x g ved RT.
    2. Aspirer supernatant og resuspendere cellepellet i 10 ml serumfri DMEM supplert med 10% føtal storfe serum (FBS) (komplett DMEM). Overfør celler til 10 cm vevkultur behandlet plastretter. Inkuber celler i en fuktet inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
    3. Neste dag, erstatt mediet med frisk komplett DMEM.
    4. Utvid C2C12-celler med lav passasje på 3–4 10 cm. Når C2C12-cellene når 50–60 % samløpet, må du aspirere mediet og skyll C2C12-celler med 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
    5. Tilsett 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuber i 2 min ved RT. Monitor celleavløsning under et mikroskop og utvid inkubasjonstiden om nødvendig, til de fleste cellene er løsrevet.
      MERK: Trykk forsiktig på parabolen kan bidra til å løsne cellene.
    6. Når de fleste cellene er løsrevet, tilsett 10 ml komplett DMEM til parabolen, pipette volumet opp og ned flere ganger, og overfør cellesuspensjon til en steril engangs15 ml sentrifugerør. Sentrifugeceller i 3 min ved 160 x g ved RT. Aspiriv supernatant og resuspender cellepellet i 2 ml frysemiddel (10 % dimetylsulfoksid [DMSO]/90% FBS).
    7. Overfør to 1 ml aliquots per 10 cm tallerken i kryovialer. Inkuber i en cellefrysende beholder fylt med RT isopropanol i minst 24 timer i en -80 °C-fryser, noe som resulterer i en frysehastighet på ca -1 °C per min for å unngå dannelse av iskrystaller. Lagre celler for langvarig bruk i dampfasen av flytende nitrogen.
      MERK: Leverandøren anbefaler å bruke C2C12-celler opp til passasjernummer 15. Forfatternes erfaringer viste også at lavere passasjertallceller viste mer konsekvent og rask differensiering i myotubes. Det er viktig å opprettholde C2C12-celler ved lav celletetthet (<50% samløpet) for å unngå for tidlig innsettende differensiering. Differensiering eller differensiert C2C12 celler kan ikke gå tilbake til den opprinnelige myoblast tilstand og må kastes.
  2. Klargjøre C2C12-celler for transfeksjon
    1. Kultur udifferensiert C2C12 celler i en 10 cm tallerken til de når 50-60% samløpet. Aspirer mediet, skyll C2C12 celler med 10 ml PBS, og tilsett 1 ml 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber i 2 min ved RT, overvåke celleavløsning under et mikroskop, og forlenge inkubasjonstiden om nødvendig, til de fleste cellene er løsrevet.
      MERK: Trykk forsiktig på parabolen kan bidra til å løsne cellene.
    2. Når de fleste cellene er løsrevet, tilsett 10 ml komplett DMEM til parabolen og overfør cellesuspensjon til en steril engangsrør på 15 ml sentrifugerør. Sentrifugeceller i 3 min ved 160 x g ved RT. Aspirasjon supernatant og resuspender cellepellet i 4 ml fullstendig DMEM.
    3. Kombiner 10 μL cellesuspensjon med 10 μL trypanblå i et 1,5 ml reaksjonsrør, bland ved å pipettere opp og ned og forsiktig sveipe reaksjonsrøret og overfør celler til et tellelysbilde. Bestem cellenummeret/mlved hjelp av en automatisert celleteller.
    4. Fortynn C2C12 celler til 50 000 celler/ml og frø 100 000 celler (2 ml) per brønn i en 6-brønnplate for å oppnå ca 40–50 % samløpet etter inkubasjon over natten. Inkuber celler i en fuktet inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
  3. Transfection av C2C12 celler med shRNA plasmid ved hjelp av polyetylenimin (PEI) og puromycin valg
    1. Utarbeidelse av PEI lagerløsning
      1. Løs opp 16 mg PEI i 50 ml sterilt destillert vann (konsentrasjon av lageroppløsning: 0,32 mg/ml) i en 50 ml glassmedieflaske med skrukork. Inkuber oppløsningen ved 65 °C i 1 t og virvel oppløsningen kraftig flere ganger i løpet av inkubasjonsperioden for å oppløse PEI fullstendig.
      2. Juster til pH 8 ved å legge til 15 μL på 1N HCl per 50 ml.
        FORSIKTIG: HCl er etsende. Konsentrert HCl skal håndteres under røykhetten. Etterforskerne bør bruke egnet personlig verneutstyr.
      3. Frys PEI-oppløsningen ved -80 °C i 1 time med et løst festet lokk og tin raskt ved 37 °C i et vannbad for ytterligere å forbedre løseligheten. Gjenta frysetiningssyklusen 3x.
      4. Oppbevar PEI-lageroppløsningen i 0,5 ml aliquots for engangsbruk ved -20 °C.
    2. Transfection av C2C12 celler
      1. Kombiner 25,5 μL (8,5 μL/μg plasmid DNA) av PEI-lageroppløsningen med 100 μL 25 ml NaCl i et 1,5 ml reaksjonsrør og inkubator i 5 min ved 37 °C. Kombiner 3 μg av plasmid DNA med 100 μL på 25 mM NaCl og inkubator i 5 min ved 37 °C.
      2. Kombiner hele volumet av fortynnet PEI reagens med den fortynnede plasmid og bland ved å forsiktig pipettere opp og ned. Inkubat i 25 min ved 37 °C.
      3. I løpet av inkubasjonstiden endrer du mediet til C2C12-cellene beregnet for transfeksjon til DMEM uten FBS eller antibiotika.
      4. Tilsett PEI / DNA transfection mix til C2C12 celler slippe for dråpe og bland hele tiden ved å forsiktig flytte cellekulturparabolen. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Etter 6 timer, endre mediet for å fullføre DMEM.
    3. Valg av Puromycin
      1. 24 timer etter transfeksjon, bytt medium til utvalgsmedium (komplett DMEM pluss 5 μg/ml puromycin). Fortsett puromycinvalg til puromycinresistente C2C12-celler oppnås, noe som vanligvis tar 10–14 dager.
      2. Utvid puromycinresistente C2C12-celler ved lav celletetthet (<50−60 % samløpet), det vil si for å opprettholde den udifferensierte tilstanden og kryobevaringen av 6–10 hetteglass for fremtidige eksperimenter som beskrevet i trinn 2.1.4−2.1.7.
        MERK: Oppretthold puromycinresistente C2C12-celler i nærvær av 5 μg/ml puromycin for rutinemessig cellekultur og ekspansjon. Puromycin ble imidlertid utelatt i differensieringseksperimentene.

3. Phenotypisk analyse av C2C12 Differensiering

MERK: Metodene som er beskrevet nedenfor, kan enkelt tilpasses for generell fenotypisk analyse av C2C12 myoblastdifferensiering i myotubes ved å variere de spesifikke antistoffene som brukes i vestlig flekking eller genspesifikke primere som brukes i kvantitativ evidensase kjedereaksjon (qPCR)-analyse.

  1. C2C12 differensieringsprotokoll og brightfield mikroskopi
    1. Frø 150.000 celler/ brønn i en 12 brønnplate. Kulturpuromycinresistente C2C12 stabile celler i en 12 brønnplate i utvalgsmedium i en fuktet inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Kultur C2C12 celler i fullstendig DMEM til de når ~ 95% samløpet.
    2. For å indusere differensiering av C2C12-celler, erstatt fullstendig DMEM med serumfri DMEM (dag 0 av differensiering). Bytt medium annenhver dag og følg C2C12 myotubeformasjon ved hjelp av et omvendt lyst feltmikroskop med kamera.
      MERK: Mange protokoller bruker 2% hesteserum for å skille C2C12-celler til myotubes. I forfatternes hender hadde fjerning av serumet helt en lignende effekt. Insulin er beskrevet som et additiv til cellekulturmediet for å akselerere C2C12-differensiering. I den nåværende protokollen ble C2C12-celler imidlertid pålitelig differensiert til myotubes innen 3-5 dager etter serumdeprivasjon og tilsetning av insulin som anses unødvendig.
  2. Myosin tungkjede (MyHC) immunstaining for å visualisere myotubes
    1. Frø 50 000 puromycinresistente C2C12-celler per kammer i et 8 brønnkammerlysbilde i 500 μL fullstendig DMEM. Kulturceller til de når 95% samløpet i fullstendig DMEM (ca 24 timer).
    2. For å indusere differensiering, bytt fra komplett DMEM til 500 μL serumfri DMEM (dag 0 av differensiering). På ønsket tidspunkt(er), aspirer mediet og skyll celler 3x med 0,5 ml PBS.
      MERK: Utfør alle følgende trinn på RT.
    3. Fiks celler med 0,2 ml paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS i 15 min. Skyll celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
      FORSIKTIG: PFA er farlig. Ta egnede forholdsregler og kast paraformaldehydoppløsning som farlig avfall.
    4. Slukke PFA med 0,2 ml 0,5 M glycin i PBS i 5 min. Skyll celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    5. Inkubatceller med 0,2 ml 0,1 % ikke-ionisk overflateaktivt middel/vaskemiddel (Materialtabell) i PBS i 10 min for å permeabilisere cellemembranen. Blokker med 0,2 ml storfeserumalbumin i PBS i 1 t. Skyll celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    6. Inkubatceller med 0,2 ml MyHC antistoff (1:200 i PBS) i 2 timer. Skyll celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    7. Inkuber celler med 0,2 ml geit-anti mus rhodamin rødkonjugert sekundærantistoff (1:200 i PBS). Skyll celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min hver.
    8. Etter å ha fjernet PBS kvantitativt, legg til en dråpe monteringsmedium som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI) per kammer. Dekkslip og herding monteringsmedium i henhold til produsentens instruksjoner. Forsegl med neglelakk.
    9. Vær oppmerksom på C2C12-celler ved hjelp av et fluorescensmikroskop ved hjelp av riktig filtersett.
  3. Vurdere knockdown effektivitet ved kvantitativ e-artsase kjedereaksjon i sanntid (qRT-PCR)
    1. Kultur C2C12 celler under differensieringsforhold i 12 brønnplater som beskrevet i pkt. 3.1.
    2. Fjern differensieringsmediet ved ønsket tidspunkt, skyll cellene én gang med 1 ml PBS, og tilsett 0,5 ml RNA-ekstraksjonsreagens (Materialtabell) per brønn. Lyse cellene ved å forsiktig pipettere opp og ned og overfør cellelysat til et sterilt 1,5 ml reaksjonsrør. Isoler RNA ved å følge produsentens protokoll nøye.
      FORSIKTIG: RNA-ekstraksjonsreagensen inneholder fenol. Den skal brukes under en røykhette. Samle RNA-avtrekksreagensavfall og kast som farlig avfall. Etterforskerne bør bruke egnet personlig verneutstyr.
    3. Løs opp den endelige RNA-pelleten i 20 μL diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann. Bestem kvantiteten og kvaliteten på RNA-preparatet ved hjelp av et spektrofotometer og bestem Forholdet A260/A280 som kvalitetsmål.
      MERK: En typisk utbytte fra 1 brønn på 12 brønnplate er 5–7 μg av total RNA med et A260/A280-forhold på 1,8-2.
    4. For å fordøye gjenværende co-renset genomisk DNA, fortynn 1 μg RNA i et totalt volum på 8 μL DEPC-behandlet vann i et PCR-rør. Tilsett 1 μL reaksjonsbuffer på 10x og 1 μL DNase I (1 enhet/μL) (Materialtabell) og inkuber i 15 min ved RT. Tilsett 1 μL stoppoppløsning (25 mM EDTA) og inkuber ved 70 °C i 10 min.
    5. For å generere cDNA, kombinere 10 μL dNase behandlet RNA med 10 μL av 2x omvendt transkripsjonase master mix, som inneholder omvendt transkripsjonase, tilfeldige primere, 4 mM dNTP mix (1 mM hver av dATP, dTTP, dGTP, og dCTP), og omvendt transkripsjon reaksjonsbuffer. Inkuber reaksjonen i en termocycler ved hjelp av programmet som anbefalt av produsenten. Fortynn cDNA med vann i forholdet 1:5.
    6. For å forberede qRT-PCR-reaksjonen, kombiner 5 μL SYBR grønn qPCR masterblanding med 0,5 μL genspesifikke fremover- og reversprimere (henholdsvis 10 μM) og 2 μL DEPC-behandlet vann per reaksjon. Pipette qPCR reaksjon i en brønn av en 96 godt qRT-PCR plate og tilsett 2 μL fortynnet cDNA. Sett opp tre tekniske replikaer for hver biologiske replikareog inkluderer et rengjøringsgen som Gapdh eller Hprt1.
    7. Amplify PCR-produktet med en qRT-PCR termocycler ved hjelp av følgende program: 50 °C for 2 min (uracil-DNA glykoslase [UDG]-aktivering), 95 °C for 2 min (dual-lock DNA polymerase aktivering), 40 sykluser på 95 °C for 15 s, 60 °C for 30 s og 72 °C i 1 min.
    8. Kvantifiser qRT-PCR-resultater ved hjelp av DDCt-metoden som normaliserer til et rengjøringsgen, for eksempel Gapdh eller Hprt1.
  4. Vurdere knockdown effektivitet ved vestlig blotting
    1. Frø 300.000 puromycinresistente C2C12-celler per brønn i en 6-brønnplate for western blotanalyse. Etter 24 timer, endre medium til serum-fri DMEM å initiere differensiering (dag 0 av differensiering).
    2. På ønsket tidspunkt samle to 1 ml serumfri kondisjonert medium i et 1,5 ml reaksjonsrør og sentrifuge i 5 min ved 500 x g ved RT for å fjerne frittliggende celler og celleavfall.
      MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis ECM-proteiner eller andre utskillede proteiner i betinget medium undersøkes. Hvis proteinet av interesse er lokalisert i cytoplasma eller er membranbundet, aspirer cellekulturmediet og fortsett med cellelysistrinn (3.4.7−3.4.12). Cellelysis bør utføres parallelt med proteinnedbøren fra serumfritt kondisjonert medium for å minimere proteolytisk nedbrytning og andre utilsiktede konsekvenser av langvarig lagring av cellelaget.
    3. Etter sentrifugering, overføring 1 ml betinget medium i et nytt 1,5 ml reaksjonsrør og utfellingsproteiner ved å legge til 0,391 ml av en blanding av trikloreddiksyre (TCA) og ikke-ionisk overflateaktivt middel/vaskemiddel. Kort vortex blandingen og inkuber i 10 min på is.
      MERK: Klargjør proteinutfellingsblandingen direkte før bruk ved å kombinere 0,252 ml 55 % TCA og 0,139 ml 1 % ikke-ionisk overflateaktivt middel/vaskemiddel per ml betinget medium og vortex kort. Løsningen blir uklar.
      FORSIKTIG: TCA er etsende og må håndteres på riktig måte.
    4. Pellet de utfelte proteinene ved >16 000 x g i 10 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
      FORSIKTIG: Supernatanten inneholder TCA og bør samles separat og kastes som farlig materiale.
    5. Vask proteinpellet 3x med iskald aceton og sentrifuge hver gang på > 16 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    6. Lufttørk proteinpelleten i 3-4 min ved RT og oppløs i 50 μL natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel elektroforese (SDS-PAGE) prøvebuffer (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% glyserol og 0,004% bromfenolblå, supplert med 5% β-merkaptoetanol). Kok prøven i 5 min ved 95 °C og bruk for vestlig flekking for å oppdage ønsket målprotein ved hjelp av standardprosedyrer.
      FORSIKTIG: β-Mercaptoetanol er luktog giftig og må håndteres i en røykhette.
    7. For intracellulære og membranbundne proteiner, skyll cellelaget én gang med 2 ml PBS.
    8. Tilsett 1 ml PBS og løsne celler ved å skrape dem av brønnen ved hjelp av en celleskraper. Samle celler i et 1,5 ml reaksjonsrør og sentrifuge ved 3420 x g i 3 min ved 4 °C. Vask cellepellet 3x med 1 ml PBS og sentrifuge ved 3420 x g i 3 min ved 4 °C hver gang.
    9. For å lyse cellene, resuspendercellepellet i 0,2 ml lysebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% natriumdeoksykolater, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerophosphate og 1 mM natrium orthovanadate) supplert med 1x EDTA-fri proteasehemmer cocktailreagens og inkubator i 30 min på is.
    10. Ultrasonicate for 15 s på is med en utgangseffektinnstilling på 10 med en driftsfrekvens på 23 kHz.
    11. Fjern cellerester ved sentrifugering ved 13 680 x g i 20 min ved 4 °C. Samle supernatant i en ny 1,5 ml reaksjonsrør og bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en kommersiell Bradford analyse eller annen egnet metode.
    12. For hver prøve, kombinere 100 μg protein med 5x SDS-PAGE prøvebuffer i et totalt volum på 60 μL og kok i 5 min ved 95 °C. Analyser prøver etter standard vestlige blotting prosedyrer for tilstedeværelsen av ønsket målprotein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Valg av puromycinresistent C2C12 kan oppnås i 10-14 dager etter transfeksjon på grunn av effektiv eliminering av ikke-resistente, det vil si utransinfiserte celler (figur 1B). Vanligvis fjernes mer enn 80% av cellene fra cellekulturretten, og disse cellene fjernes under rutinemessig cellevedlikehold. Puromycinresistente C2C12-celler som uttrykker kontrollen (kryptert) shRNA beholder spindelformen, langstrakt cellemorfologi ved lav celletetthet og evnen til å skille seg inn i myotubes. C2C12 differensiering ved serumuttak kan overvåkes av lyse feltmikroskopi og ved immunstaining for myotubemarkøren myosin tungkjede (MyHC) (Figur 2). MyHC-positive myotubes observeres mellom 3-5 dager etter differensieringsinitiering. Myotubes er multinucleated som vist ved tilstedeværelsen av mer enn én DAPI-positiv kjerne innenfor MyHC-positive cellegrenser. Figur 3A viser lyse feltbilder av stabile C2C12-celler som er kultivert i fullstendig DMEM. Knockdown-effektiviteten som presenteres her varierer fra 40–60 % (figur 3B). Siden mRNA ble høstet i den proliferative tilstanden der lille Adamtsl2 uttrykkes, vises knockdown-effektiviteten lav, men knockdown-effektiviteten forventes å være større på senere tidspunkter under C2C12-differensiering, hvor endogene Adamtsl2 induseres og dermed uttrykkes på mye høyere nivåer. Western blot analyse bekreftet vellykket knockdown av ADAMTSL2 i cellelysat et hentet fra C2C12 celler som knivly uttrykker shRNA 3086 sammenlignet med kontroll shRNA (Figur 3C).

Figure 1
Figur 1: Valg av stabile C2C12-celler etter transfeksjon med shRNA-koding plasmid DNA. (A) Tabell som viser målområdet (CDS, koding sekvens; 3'-UTR, 3'-uoversatt region), klone ID (heretter referert til som 1977, 3086 og 972), og sekvens av shRNAs brukes til å målrette Adamtsl2. (B) Panelene viser valg av C2C12 celler transfected med kontroll shRNA og de tre Adamtsl2-målretting shRNAs. C2C12-celler ble transinfisert med shRNA plasmider og puromycin ble lagt til mediet etter 24 h. Puromycin-sensitive celler vises runde og til slutt løsne under rutinemessig cellekulturvedlikehold (røde piler). I motsetning, puromycin-resistente celler som huser de integrerte shRNA plasmids vises spindelformet, litt langstrakt, festet, og levedyktig (blå piler). Skaler stenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: C2C12 myoblast til myotube differensiering. Lyse feltbilder av differensierende C2C12-celler viser tett brosteinsutseende av cellene i begynnelsen av differensieringen (dag 0−1) og multinukleerte myorør ble observert etter dag 5 (øverste rad). Immunfarging av differensierende C2C12-celler med myosintung kjede (MyHC, rød), som er en markør for myotubes, induseres på dag 3 av differensiering (midtpanel). Nuclei ble farget med DAPI og det sammenslåtte bildet vises i de nedre panelene. Skaler stenger = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Validering av stabil knockdown i prolifererende C2C12-celler. (A) Lyse feltbilder av stabile C2C12-celler dyrket i fullstendig DMEM. Skala linjer = 300 μm. (B) qRT-PCR analyse av Adamtsl2 mRNA uttrykk i stabile C2C12 celler. Ct-verdier ble normalisert til rengjøringsgenet Hprt1. mRNA ble høstet før differensiering. Feilfelt representerer standardavvik. (C) Western blot analyse som viser redusert ADAMTSL2 protein i cellelysate / ECM fraksjon fra C2C12 celler som stikker ut shRNA 3086. Endogene ADAMTSL2 ble oppdaget ved hjelp av et skreddersydd polyklonalt peptidantistoff (tilgjengelig på forespørsel). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her en protokoll for stabil knockdown av ECM-proteiner i C2C12 myoblaster og for fenotypisk analyse av differensiering av C2C12 myoblaster i myotubes. Flere faktorer bestemmer utfallet av eksperimentet og må vurderes nøye. Opprettholde C2C12 celler i spredningfasen er et kritisk skritt for å holde C2C12 cellene i myoblast forløper tilstand. Beholde evnen til C2C12 celler å konsekvent skille seg inn myotubes avhenger av i) passasjerantall celler, ii) tettheten av de kultiverte cellene under rutinemessig vedlikehold, og iii) næringstilgjengelighet, krever hyppig og regelmessig etterfylling av cellekulturmedium11,12,13. På grunn av noen ukjente mekanismer, høyere passasje nummer C2C12 celler også miste potensialet for ytterligere myoblast fusjon11. Instruksjonene fra leverandøren av C2C12-cellene foreslår å opprettholde disse cellene opp til passasje nummer 15. Deretter kan differensieringspotensialet reduseres og eksperimenter med slike celler kan resultere i mindre konsekvent myotubedannelse. På den annen side kan celletettheten under vedlikehold resultere i lignende effekter9. Nå confluent C2C12 celle tettheter under rutinemessig cellekultur fremme initiering av C2C12 myoblast differensiering og dermed kan negativt påvirke differensiering potensialet i cellepopulasjonen. Derfor er det av avgjørende betydning å hindre c2C12 celler fra å nå høye celletettheter under rutinemessig C2C12 cellevedlikehold. Dette kan oppnås ved allerede sub-culturing C2C12 celler ved lave celletettheter (<50−60% samløpet). Serum sult brukes til å indusere C2C12 celledifferensiering i myotubes. Derfor opprettholde celler for lengre tider uten å fylle medium alvorlig eksos nærings- og serumnivåer. Etterfylling med ferskt serum som inneholder medium minst annenhver dag kan forhindre utbruddet av uønsket for tidlig differensiering på grunn av nærings- og serumdeprivasjon.

C2C12 differensiering er vanligvis indusert av serum sult. Prosentandelen av serum som brukes til å indusere C2C12 differensiering kan i stor grad påvirke resultatene, spesielt tiden det tar å danne MyHC positive myotubes14,15. Flere protokoller viser vellykket induksjon av differensiering under ulike serumkonsentrasjoner. Bruk av 2–10 % FBS eller hesteserum og fullstendig serumdeprivasjon er rapportert, og alle forhold resulterer i C2C12 myotubedannelse. Serumprosenten eller endringen i serummyeet kan endre markører betydelig for differensiering. I tillegg kan kilden til serumpåvirke det eksperimentelle resultatet, fordi opprinnelseslandet kan eller ikke tillater visse tilsetningsstoffer under storfe serumproduksjon8. Serumnivået kan justeres for å oppnå differensieringshastigheten i henhold til spesifikke eksperimentelle krav. Insulin kan legges til kulturmediet av C2C12-celler for å akselerere differensiering og myotubedannelse16.

Evnen til å levere plasmider koding shRNA eller rekombinant proteiner i C2C12 celler via transfection er et attraktivt trekk ved C2C12 celler. Flere kommersielle liposom-baserte transfection reagenser har blitt brukt tidligere for å levere plasmid DNA i C2C12 celler med variabel rapportert transfection effektivitet17,18,19,20,21. PEI viser også rimelig transfection effektivitet og er et kostnadseffektivt alternativ til liposom-baserte transfection reagenser. En sammenligning mellom transfection med en kommersiell liposom-basert transfection reagens og PEI viste ingen betydelig endring i transfection effektivitet og litt høyere effektivitet ble funnet med PEI22. I våre hender var transfection effektivitet med PEI tilstrekkelig til å generere stabile puromycin-resistente C2C12-celler. Et kritisk skritt i denne protokollen er imidlertid å holde inkubasjonstiden til transfection reagensen kort. Som nevnt ovenfor er C2C12-celler følsomme for serumabstinens og langvarig eksponering for lave serumforhold under transfeksjon kan favorisere C2C12 celledifferensiering. Siden transfeksjon utføres i fravær av serum, ble inkubasjonstiden etter transfeksjon holdt kort for å levere raskt serumholdig medium for å forhindre for tidlig differensiering. Puromycin ble lagt til kulturmedium 24 timer etter transfeksjon for å initiere valg av puromycinresistente C2C12-celler. Metoder for å introdusere plasmid DNA i differensierte myorør inkluderer transfection (opptil 85% effektivitet rapportert), elektroporasjon, eller en biolistic tilnærming23,24,25. Alternativt kan stabile C2C12-celler som skjuler en inducible shRNA plasmid genereres for å slå ned gener i senere stadier av myotube differensiering eller under myotube modning26.

Metoden som er beskrevet her resulterte i stabil knockdown av ADAMTSL2 i C2C12-celler hvor funksjonen under differensiering i myotubes nå kan bestemmes. Generasjonen av stabile knockdown celler kan være spesielt viktig å studere funksjonen av proteiner som induseres under myotube dannelse eller modning. Forbigående transfeksjon med siRNA ville for eksempel ikke være tilstrekkelig til effektivt å slå ned disse genene, siden den forbigående knockdown effekten av siRNA kan avvenne seg etter 5-7 dager. Alternativt er knockoutav et ECM-protein ved hjelp av CRISPR/Cas9 teknisk mer utfordrende, og individuelle kloner må velges og sekvenseres for å sikre knockout av ønsket gen. Den utviklende linjen av reagenser kan imidlertid gjøre CRISPR/Cas9 til den valgte metoden for funksjonstap i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

D.H. støttes av National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) og frøfinansiering fra Leni & Peter W. May Department of Ortopedikk, Icahn School of Medicine ved Mt. Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11, (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25, (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40, (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26, (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115, (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3, (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7, (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167, (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107, (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306, (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186, (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5, (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4, (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591, (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46, (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286, (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278, (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003, (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17, (2), 514-526 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics