Localisé ARNi et l'expression des gènes extra-utérine dans la sangsue médicinale

Biology

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Summary

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour une livraison précise biolistique des réactifs dans le tissu vivre avec un canon à gènes miniatures roman. Nous sommes renversant l'expression de la nétrine axone molécule conseils dans les embryons de sangsue en fournissant des molécules d'ARN double brin dans le mur ventrale du corps et les ganglions des segments unique.

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Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech. J. Vis. Exp. (14), e697, doi:10.3791/697 (2008).

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Abstract

Dans cette vidéo, nous montrons l'utilisation d'un pistolet pneumatique capillaires pour la livraison précise biolistique des réactifs dans les tissus vivants. Nous utilisons la procédure à des modèles de perturber l'expression des gènes dans des segments choisis d'embryons de sangsue, laissant les segments non traitées comme des contrôles internes.

Le pistolet pneumatique capillaire peut être utilisée pour atteindre les couches internes de cellules à des stades précoces du développement, sans ouvrir le spécimen. En tant que méthode pour l'introduction de substances dans localisée des tissus vivants, de la délivrance biolistique avec le pistolet a plusieurs avantages: il est rapide, sans contact et non destructive. En outre, une seule arme capillaire peut être utilisée pour la livraison indépendant de différentes substances. La région de livraison peuvent avoir des dimensions latérales de ~ 50 à 150 um et s'étend sur environ 15 um autour de la profondeur de pénétration moyenne, qui est réglable entre 0 et 50 um. Cette livraison a l'avantage d'être en mesure de cibler un nombre limité de cellules dans un endroit choisi intermédiaire entre cellule unique renverser par microinjection et démontable par des injections systémiques extracellulaire ou par des approches génétiques.

Pour faire tomber ou de frapper dans l'expression de la nétrine axone molécule orientation, qui est naturellement exprimé par certains neurones centraux et dans la paroi ventrale du corps, mais pas le domaine dorsale, nous délivrer des molécules d'ARN double brin ou ADN plasmidique dans la paroi du corps et ganglions centraux. Cette procédure comprend les étapes suivantes: (i) la préparation du dispositif expérimental pour un dosage précis (ajustement de la pression d'accélération), (ii) l'enrobage des particules avec des molécules d'ARN double brin ou d'ADN, (iii) de chargement des particules enrobées dans le pistolet, jusqu'à deux réactifs dans un essai, (iv) la préparation des animaux pour la livraison des particules, (v) la livraison de particules enrobées dans le tissu cible (paroi du corps ou des ganglions), et (vi) le traitement des embryons (immunomarquage, l'immunohistochimie et neuronale étiquetage) pour visualiser les résultats, généralement de 2 à 3 jours après la livraison.

Lorsque les particules ont été revêtus de la nétrine ARNdb, ils ont causé bien visible le knock-down de l'expression nétrine que seulement eu lieu dans des cellules contenant des particules (généralement, 1-2 particules par cellule). Particules enrobées avec un encodage de fluorescence EGFP plasmide induite dans les cellules neuronales quand ils ont cessé dans leurs noyaux.

Protocol

Les particules peuvent être enduits de réactifs différents, tels que les molécules ARN double brin, l'ADN des plasmides ou des colorants. Le type et le diamètre des particules sont choisies selon le réactif et la profondeur des cellules cibles dans le tissu: les grosses particules pénètrent plus loin, mais peut causer des dommages aux tissus.

1. Préparation de particules de revêtement ARNdb

  1. Placer 100% d'isopropanol sur la glace.
  2. Resuspendre 5 mg de particules d'or (S1600ri, Seashell Technology, LLC; diamètre moyen 1,6 um) dans 100 ml de tampon de liaison. Lorsque la solution est prête, passez à l'étape suivante.
  3. Diluer la solution de particules en ajoutant 100 ul de tampon de liaison, brièvement au vortex et sonifier pendant 1-2 min afin d'éviter l'agglutination.
  4. Ajouter 5-10 pg d'ARN double brin / siRNA (dsRNA / siARN doit être dissous dans l'eau à une concentration de ~ 1μg/μl).
  5. Vortex et laisser à température ambiante pendant 2 min. Ces résultats intervalle de concentration et le temps de siARN saturé de particules d'or.
  6. Pellet les complexes de particules siARN / or par centrifugation à 2500 rpm ~ dans une centrifugeuse de paillasse pour ~ 15 sec.
  7. Retirer délicatement le surnageant et ajouter 750 ml d'isopropanol froid avec une perturbation minimale de la pastille. Spin brièvement et éliminer le surnageant.
  8. Resuspendre les particules d'or dans 100 ul froid 100% d'isopropanol, puis soniquer brièvement dans un bain d'ultrasons (2-3 impulsions) pour briser les agglomérats de particules. Enfin, versez les particules en suspension sur une lame de verre et laisser sécher à température ambiante.

2. Préparer le montage expérimental pour un dosage spécifique

  1. Chaque arme a un diamètre de buse différents ouverture, allant d'un minimum de 50 microns ~ à ~ 3mm. L'spécifiques à utiliser pour le pistolet est donc choisi en fonction de la surface du tissu d'être ciblés.
  2. La pression, il est ajusté à la profondeur dans les tissus des cellules cibles, généralement jusqu'à 100 microns ~ (pressions plus élevées peuvent livrer les particules plus profond). La distance entre l'embryon et l'extrémité de la buse affecte également la profondeur de pénétration, comme l'or particules essoufflement dans l'air.

3. Chargement du pistolet avec les particules pré-enduites

Particules devrait être chargé comme une poudre sèche dans les lignes d'injection tube Tygon particules reliée au collecteur. Ce tube, qui devraient être conservés dans une atmosphère sèche à 4 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé, peut être ré-utilisés dans des expériences supplémentaires avec les mêmes réactifs. Notre dispositif expérimental peut fournir jusqu'à deux réactifs différents par test par le biais des ports distincts dans le collecteur.

  1. Gratter les particules séchées revêtement du verre diapositives en utilisant le bord d'une lamelle de verre ou une lame de rasoir avant de les charger dans la ligne de tube Tygon. Ce tube Tygon seront spécifiques seulement à ce réactif pour éviter la contamination croisée.
  2. Comme vous chargez les particules, plier le tube en forme de U près du connecteur, pour maintenir les particules de se propager le long du tube entier et concentrées à proximité du connecteur. Ramassez les particules avec une petite spatule ou d'un morceau de papier plié pèse, et la charge environ la moitié d'entre eux dans les tubes de chaque série d'embryons. Appuyez sur le tube pendant l'étape de chargement de répartir les particules uniformément.

4. Préparation des animaux

Avant et après la livraison des particules d'or, les embryons sont conservés dans l'eau d'étang artificiel stérile à température ambiante.

  1. Placer les embryons, jusqu'à la face ventrale, dans une rainure taillée dans un plat, 5mm d'épaisseur morceau de caoutchouc de silicone (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) et les anesthésier dans une solution d'éthanol à 8% dans l'eau d'étang artificiel stérile ( jeunes embryons à des stades E6-E8 peut rester dans l'eau des étangs artificiels, sans éthanol à travers l'expérience).
  2. Immédiatement avant le tournage des particules, d'abaisser le niveau de bain de découvrir la face ventrale de l'embryon en enlevant une partie de la solution. Placer un morceau de papier de soie avec un petit trou coupé au milieu sur le dessus de celui-ci afin de le stabiliser et de maintenir sa surface de séchage.

5. La livraison des particules enrobées dans le tissu cible

Une charge de particules peuvent généralement être utilisés pour un maximum de dix coups, avec un seul tir en général la livraison de l'ordre de quelques centaines de particules.

  1. Générer un coup en ouvrant l'une des soupapes de 0,3 s, ce qui provoque l'injection d'un bolus de particules provenant de la ligne correspondante tuyau dans le pistolet.
  2. Appuyez sur le tube doucement entre les coups de feu pour déloger les particules de la paroi du tube et donc de faciliter leur injection dans le flux, il de l'arme.
  3. Pour couvrir la surface du tissu d'intérêt, des coups multiples peuvent être nécessaires.
  4. Après la livraison des particules, placer les embryons de nouveau dans l'eau des étangs artificiels, de préférence un seul embryon par puits dans une plaque multi-puits.

6. Immunocoloration et l'étiquetage des neurones

Gardez les embryons à température ambiante et dans l'obscurité pendant 1 à 3 jours après la livraison des particules, jusqu'à ce que l'ARNi (ou l'expression ectopique) est atteint. Nous avons ensuite effectuer l'une des procédures suivantes sur les échantillons expérimentaux et contrôles:

  1. L'hybridation in situ d'analyse pour la présence ou l'absence de l'ARNm de la nétrine. Marquée à la digoxigénine sangsue ribosondes nétrine sont hybridées à des embryons de sangsue ensemble.
  2. Immunocytochimie au dosage de la protéine nétrine et d'autres protéines qui sont uniques aux tissus neuronaux (comme la tubuline acétylée anti). La procédure est effectuée également sur toute monture embryons.
  3. Microinjections de colorants lipophiles (DII et DIO) en neurones unique, pour comble de teinture pour étiqueter les tonnelles complète des neurones d'intérêt (de pression neurones mécano dans notre cas) dans des segments traitées et les témoins. Ce dosage est effectué sur les embryons vivants (intacts ou disséqués).

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Discussion

Dans cette démonstration, nous avons utilisé le pistolet pneumatique capillaires pour fournir des particules d'or dans les cellules localisées dans le volume des petits un embryon vivant sangsue à knock-in et knock-down gènes. La région cible ont généralement un diamètre de ~ 150 um et les particules ont été trouvés ~ 15 um autour de la profondeur de pénétration moyenne, qui était réglable entre 0 et 50 um. Lorsque les particules ont été recouvertes de molécules ARN double brin de l'axone nétrine facteur de guidage, ils ont causé bien visible le knock-down de l'expression nétrine que seulement eu lieu dans des cellules contenant des particules. Particules enrobées avec un plasmide codant pour la GFP par fluorescence induite dans les cellules neuronales quand ils ont cessé dans leurs noyaux.

Nous vous avons montré comment le pistolet pneumatique capillaires donne la technique de la délivrance biolistique une nouvelle capacité, afin de cibler les régions microscopiques d'un tissu confinée en trois dimensions et ciblée avec une grande précision, sans dommage détectable dans le tissu.

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Acknowledgements

Nous tenons à remercier le Dr Michael Baker pour son aide dans la génération des constructions pour le gène knock-in et de fournir les films en accéléré de la croissance des projections sensorielles. Nous tenons également à remercier la Virginie Vandelinder d'assistance technique avec les expériences pistolet pneumatique.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
gold particles Other Seashell Technology, LLC S1600ri
binding buffer Reagent Seashell Technology, LLC
silicone rubber Reagent Dow Corning Sylgard 184

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References

  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

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