Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Published 8/15/2008
11 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Deze video demonstreert de techniek van micro-injectie in de gonaden van C. elegans om transgene dieren te creëren.

Cite this Article

Copy Citation

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transgene Caenorhabditis elegans gemakkelijk kan worden aangemaakt via micro-injectie van een DNA-plasmide oplossing in de gonaden 1. Het plasmide DNA herschikt te vormen extrachromosomaal concatameren die stabiel zijn geërfd echter niet met dezelfde efficiëntie als de werkelijke chromosomen 2. Een gen van belang is co-geïnjecteerd met een duidelijke fenotypische marker, zoals rol-6 of GFP, om de selectie van transgene dieren mogelijk maken onder een microscoop dissectie. De exogene gen kan worden uitgedrukt van zijn eigen promotor voor cellulaire lokalisatie studies. Als alternatief kan het transgen worden aangedreven door een ander weefsel-specifieke promotor om de rol van het gen product in die bepaalde cel of weefsel te beoordelen. Deze techniek drijft efficiënte genexpressie in alle weefsels van C. elegans, behalve voor de geslachtscellen of vroege embryo 3. Creatie van transgene dieren wordt op grote schaal gebruikt voor een scala aan experimentele paradigma's. Deze video toont de micro-injectie procedure om transgene wormen genereren. Bovendien is selectie en het behoud van stabiele transgene C. elegans lijnen beschreven.

Protocol

Expressieplasmide Bouw

Twee plasmiden zijn nodig: een voor weefsel-specifieke expressie van het gen van interesse en een tweede als selecteerbare transformatie marker.

Experimentele Plasmide

  1. Selecteer een promotor die wordt uitgedrukt in de weefsels / cellen soort belang, bijvoorbeeld, een zenuw of spier-specifieke promoter. Als men is om meerdere genen tot expressie in hetzelfde weefsel, kan een promotor cassette plasmide in het Gateway-systeem (Invitrogen) worden gebruikt. Deze aanpak maakt het inbrengen van een gen van belang stroomafwaarts van de promotor door recombinationele klonen 4. In het algemeen, 2-5 kb van de upstream-sequenties voldoende is om correcte en nauwkeurige uitdrukking hebben.

  2. Het cDNA van het gen van belang gekloond kunnen worden op twee manieren:
    1. Conventionele klonen met behulp van restrictie-enzymen.
    2. Voor het klonen van Gateway, is het PCR geamplificeerd met behulp van primers die de gateway att B recombinationele volgorde bevatten. De versterkte cDNA wordt eerst gerecombineerd in de donor vector pDONR201 om de invoer vector te maken en daarna getransformeerd in E. coli stam DH5a. Volgende selectie van succesvolle recombinanten en mini-prep isolatie van DNA, wordt het item vector gerecombineerde in de promotor-bevattende bestemming vector het maken van de expressieplasmide. Details over recombinationele klonen zijn verkrijgbaar bij zowel de Invitrogen Gateway handleiding of in Caldwell et al.. 5.

Selecteerbare Marker Plasmide

Voorbeelden van transgene marker plasmiden zijn rol-6 of het gebruik van het lichaam muur spier promotor unc-54 tot en met fluorescerende eiwit expressie rijden. Deze marker plasmiden zijn meestal beschikbaar vanuit de onderzoeksgemeenschap op aanvraag.

Micro-injectie van C. elegans

Voorbereiding

  1. Een DNA-isolatie van de twee plasmiden die moeten worden geïnjecteerd. Kwantificeren en meng ze samen in een 1:1 verhouding van 50 ng / ul per stuk.

  2. Bereid agar pads:
    1. Maak een 2% agarose-oplossing in water, hitte of in de magnetron totdat het is opgelost.
    2. Aangegeven een aantal 22 x 50 mm bestrijken glazen op een benchtop.
    3. Met behulp van een Pasteur pipet, plaats een daling van de gesmolten agarose op een dekking van glas en meteen een seconde afdekglas plaats over de daling bij een 90 hoek ten opzichte van de eerste. Herhaal dit voor verschillende andere dekglaasjes. De diameter van de afgeplatte schijf van agarose moet tussen de 15-20 mm.
    4. Nadat de agarose is gestold (dit duurt maar even), verwijder dan de dekking van glas en laat het pad volledig aan de lucht drogen (enkele uren tot 's nachts).
    5. Bewaar de pads in een deksel glazen doos op kamertemperatuur.

  3. Maak naald laders voor DNA-oplossing:

    Naald laders zijn gemaakt van 100 ul capillaire buisjes die in het midden verwarmd boven een open vuur en snel getrokken om ongeveer twee keer hun lengte. De twee helften uit elkaar geklikt zodra de capillair afkoelt. Voorraad 10-20 naald laders voor injectie. Rechtop bewaren in een microcentrifugebuis rek. Wees voorzichtig om niet zichzelf te spiesen op de punten.

  4. Maak micro-injectie naalden:

    De naald is gemaakt van een speciale capillaire buis dat een interne glas gloeidraad bevat; dit filament dient als een lont voor de DNA-oplossing. Deze zijn getrokken op een naald-trekker machine. We maken gebruik van een Narishige PP-830 trekker met een warmte-instelling van 24,8. Meerdere naalden zijn getrokken op een moment en worden opgeslagen in een klein plastic doosje. Meerdere naalden kunnen gemakkelijk worden "gemount" op een strip van boetseerklei voor langdurige opslag.

  5. Punt van de naald "branding":

    De tip van de micro-injectie naald wordt getrokken zo fijn dat het eigenlijk is gesloten op het einde en moet worden opengebroken met behulp van kleine scherven van de dekking glas. Deze worden bereid door wikkelen een 18 x 18 mm dekglas in een papieren handdoek en voorzichtig druk uit te oefenen totdat het breekt in stukken. Scherven van een bruikbare afmetingen zijn ongeveer 3 x 4 mm.

  6. Grow wild type (N2) wormen aan het begin van de volwassen stadium voor injectie met behulp van standaardprocedures 6. Bereid ongeveer 100 goed geënsceneerd wormen / bouwen geïnjecteerd.

Procedure

  1. Open de hoofdkraan op een helium tank die is aangesloten op een micro-injectie naald arm en houder. Sluit de regelventiel zodat het gas naar de regel in te voeren, waardoor de druk om 35 psi. Merk op dat het gas kan worden vrijgegeven met behulp van een voetpedaal.

  2. Steek een naald lader in een standaard mond pipetter slangen (te vinden in verpakkingen van glas capillaire buizen) en het opstellen van een kleine hoeveelheid van het plasmide mengsel (~ 1 pi).

  3. De naald lader wordt zorgvuldig geplaatst in de back-end van een injectienaald ingebracht en voorzichtig de weg door de lengte vande naald totdat u weerstand voelt. Verdrijf de DNA-oplossing door zachtjes te blazen, dan verwijdert u de lader.

  4. Steek de naald in de micro-injectie arm, en let te plaatsen binnen de kleine interne rubberen pakking.

  5. Plaats een naald-brekende scherf van de dekking glas op een rand van een agar pad. Dek de scherf, evenals het gehele oppervlak van de agar pad, met halogene olie. Plaats de agar pad op het podium van een omgekeerde microscoop.

  6. Plaats de naald in het midden van het veld met behulp van het bekijken van de 4x objectieve en heldere gebied van verlichting, maar nog niet laten zakken in de olie. Ook de binnenkant van de scherf van de dekking glas in het midden, dan richten op het (nog steeds met behulp 4X doelstelling). Laat de naald in de olie, waardoor het in dezelfde focal plane als de scherf van de dekking glas. Verhoog de vergroting door over te schakelen naar de 40X doelstelling. Richten op de rand van de scherf en de positie van de punt van de naald, indien nodig.

  7. Het openstellen van de punt van de injectienaald, zacht duwtje de naald tegen de rand van het deksel glas scherf, terwijl tegelijkertijd de toepassing van een korte puls van gas via het voetpedaal. De naald zal voldoende opengebroken wanneer kleine druppeltjes vloeistof ontsnappen aan de uiteinde van de naald. Overtollige vloeistof stromen als gevolg van een te grote opening is niet wenselijk, omdat het doden van de dieren.

  8. Haal de agar pad vanaf het podium door het verhogen van de naald op, maar veranderen niets aan de X-of Y-as positie. Schuif de stage uit onder de naald, verwijder de agar pad en plaats deze op een dissectie microscoop. Overdracht van een worm op het pad, onder het oppervlak van de olie. Als de worm kronkelt voorzichtig aaien tot hij contact maakt met de agar pad. De vochtige worm dient te houden aan de droge agarose.

  9. Injectie
    1. Plaats snel de agar pad weer op het podium, het centreren van de worm in het gezichtsveld.
    2. Laat de naald in hetzelfde vlak van focus als de worm.
    3. Zet de filters om Hoffman Verlichting (een soort contrast filter). Dit maakt morfologische detail van de worm om zichtbaar te worden. Als Nomarski / DIC optiek zijn beschikbaar op de omgekeerde ruimte die zo goed zal werken. Met behulp van de 40X doel, focus op de "korrelig" syncytieel midden van de worm gonaden, onder de "honingraat" patroon van de kiem kernen (kiezen welke gonaden is gepositioneerd aan de kant van de worm naar de naald).
    4. Fijnafstemming van de positie van de naald totdat de tip ook in focus (hetzelfde vlak als de gonaden "korreligheid").
    5. Steek de naald in het midden van de gonaden en breng een korte puls van gas druk om een ​​druppel of twee van DNA te verdrijven in de gonaden arm. U moet zich aan een golf van vloeistof verspreid over de distale gonade. Denk niet dat meer vloeibaar is beter, want te veel vloeistof kan stromen in de proximale bocht van de gonaden arm, die kan stilgelegd eicel productie. Indien mogelijk, afhankelijk van de positie van de worm, injecteren de andere gonaden arm op dezelfde manier.
    6. Het is belangrijk om snel te werken, terwijl het injecteren van een worm, omdat het gemakkelijk kan uitdrogen. De beslissing om de tweede gonaden arm injecteren is afhankelijk van hoe snel je kunt opnieuw de positie van de naald en worm. Het hele proces idealiter minder dan 1-2 minuten.

  10. Verwijder het deksel glas van het podium en plaats het op een dissectie reikwijdte. Van toepassing zijn 1μl van M9 buffer (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direct op de ingespoten worm (dit kan leiden tot onder te dompelen de pipetpunt onder het oppervlak van de halogene olie). De buffer moet hydrateren de worm, en wordt dan drijven uit de agarose pad oppervlak. Overdracht van de worm een ​​gewone plaat met behulp van een worm te kiezen. De agarose pad kan worden hergebruikt nog een aantal keren totdat het is geworden te verzadigd met buffer en de wormen niet meer houden.

Transgene selectie

  1. Geïnjecteerd wormen, de P-0 generatie, worden overgebracht naar de individuele verse, bacterieel geplaatste platen (60 mm) en mag zich voort te planten. Typisch, worden geïnjecteerd dieren geïncubeerd bij 20 ° C gedurende 2-3 dagen totdat de nakomelingen verschijnen.

  2. De F 1 nakomelingen zijn waargenomen voor het bewijs van de transgene marker (zoals fluorescentie) met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop. Elke tl-licht, drager F 1, is dier afzonderlijk gekloond op een nieuwe plaat (sinds nakomelingen van elk F 1 zijn een duidelijke lijn beschouwd). De F 1 hermafrodieten mogen reproduceren. Nogmaals, is dit typisch uitgevoerd bij bij 20 ° C gedurende 2-3 dagen totdat de nakomelingen verschijnen.

  3. De F-2 generatie is waargenomen voor transgene dieren. F 2 dieren die hebben geërfd en die de transgene array worden beschouwd als een "stabiel" lijn.

    OPMERKING: Bij de F 1 eleeftijd kunnen er tal van transgene dieren, maar ze zijn niet stabiel. De meerderheid van de F 1 transgene dieren zullen niet worden doorgegeven in de F 2 stabiele lijnen.

    OPMERKING: Om te bepalen voor de variabiliteit in het gen kopie-aantal, het genereren van een minimum van drie onafhankelijke stabiele lijnen per construeren geïnjecteerd.

  4. Iedere onafhankelijke stabiele lijn moet worden gehandhaafd als een aparte lijn van de wormen. Elke lijn kan worden gepropageerd door de overdracht van verschillende transgene dieren om een ​​nieuwe plaat bij elke generatie, dit moet worden uitgevoerd met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop als de selecteerbare merker is fluorescerend.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bij het doen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden:
- Injecteren direct in het centrum van de gonaden
- Injecteer niet te veel vloeistof
- Snel werken om uitdroging te voorkomen.

Als je in de problemen met de naald, zoals het is gebroken te groot is, is het het beste om remake een verse naald, in plaats van te proberen te injecteren met een minder dan ideale naald.

De generatie van transgene wormen kent vele toepassingen, zoals:
- Identificatie van gemuteerde genen, in de methode genaamd transformatie te redden
- In kaart brengen van eiwit-domeinen door middel van de expressie van eiwitten afgebroken
- Karakterisering van de rol van een gen in cellulaire en ziekte processen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wij willen de coöperatieve geest van alle Caldwell Lab-leden erkennen. Bewegingsstoornissen onderzoek in het lab is ondersteund door de Bachmann-Strauss Dystonie & Parkinson Foundation, Verenigde Parkinson Foundation, American Ziekte van Parkinson Vereniging, de ziekte van Parkinson Vereniging van Alabama, de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson, en een Undergraduate Research.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats