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Articles by Adrian W. Briggs in JoVE
JoVE General
引物延伸捕获：从严重退化的DNA来源有针对性的顺序检索
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
我们提出了有针对性的古DNA序列检索，这是我们用来重建完整的线粒体基因组的5个尼安德特人的个人方法。现今人类的这些序列的比较表明，尼安德特人有一个长期的低有效的人口规模。
Other articles by Adrian W. Briggs on PubMed
100 万碱基对组成的尼安德特人 DNA 的分析。
尼安德特人是最与当代人类关系密切，因此，他们的基因组提供一个独特的机会，以确定完全解剖学上的现代人类所特有的遗传变化的灭绝原始人类群体。我们已确定 38,000 岁尼安德特人化石是非常自由的现代人类 DNA 的污染。直接高通量测序的 DNA 提取物这个化石迄今取得了超过 100 万碱基对组成的含古猿核 DNA 序列。与人类和黑猩猩的基因组的比较表明，现代人类和尼 DNA 序列平均分道扬镳约五十万年以前。现有的技术和化石资源现已不足以启动尼安德特人基因组测序工作。
模式的损害的基因组 DNA 序列从 Neandertal。
高吞吐量直接测序技术就已到基因组序列最近打开更新世生物的可能性。在这里我们分析确定从 Neandertal、 猛犸和洞熊的 DNA 序列。我们显示阵地毗邻符在古代 DNA，是任职人数过多嘌呤暗示，depurination 为其退化作出了贡献。我们此外显示编码胞嘧啶残留物所引起的替换是大大任职的 DNA 序列，而其他替换是罕见大幅聚集在分子的两端。我们目前观测到的替代模式用于估计的脱氨作用中单和双链 DNA、 单绞两端的长度和频率的绝缘层有无破损部分胞嘧啶残留率模型。研究结果表明可以从更新世生物获得可靠的基因组序列。
从向皮克/微克： 定量 Pcr 技术降低了高通量测序的物质需求。
目前的努力来恢复 Neandertal 和猛犸象的基因组 DNA 454 测序证明这种技术的敏感性。但是，例程 454 测序应用程序仍然需要微克数量的初步材料。这是由于缺乏有效的方法来量化 454 测序库，因此有必要昂贵和劳动密集型程序时测序古代 DNA 和其他穷人的 DNA 样本。在这里我们报告一种基于定量 pcr 技术，有效地消除了这些限制的 454 测序库量化方法。我们估计分子数目和片段大小分布在测序库来自 Neandertal DNA 提取、 SAGE ditags 和黑猩猩的基因组 DNA，而不执行任何滴定运行获得最优排序的收益率。使用此方法，454 测序可以经常从执行只要 50 pg 的初步材料无滴定法运行，从而大幅度降低成本，同时提高样品的吞吐量和协议开发 454 平台上的范围。该方法也应适用于照排胶片/Solexa 和 ABI/固体测序，并应因此有助于扩大所有三个平台的辅助功能。
线粒体基因组序列确定的高通量测序的完成初稿。
一个完整的线粒体 (mt) 基因组序列是从个别 38,000 岁 Neandertal 改造的 8341 mtDNA 序列确定 4.8 Gb 的 DNA 生成从大约 0.3 g 的骨之间。装配序列分析毫不含糊地规定 Neandertal 线粒体基因变异的现存的人类 mtDNAs，不属于和允许分歧日期之间，两个 mtDNA 失传的 660,000 + 140,000 年的估计数。在线粒体基因编码的 13 蛋白质，线粒体呼吸链的细胞色素 c 氧化酶亚 2 单位自尼安德特人分离经历了数目最大的氨基酸替换中人类的祖先。有证据表明净化 mtDNA 沦落的初稿中的选定内容相比其他灵长类谱系，这表明尼安德特人的有效种群大小小。
有针对性地的检索和分析的五个 Neandertal 线粒体基因组。
Neandertal DNA 分析存在巨大潜力的调查人口历史这一群体的智人，但进展一直有限由于样本和 DNA 的损坏的状态的瑰宝。我们目前有针对性古代 DNA 序列检索方法，大大减少样品销毁和测序的要求，并使用此方法来重建完整线粒体 DNA (mtDNA) 的基因组序列五尼安德特人从其地理范围。我们发现在尼安德特人，住在 38,000 到七万年前年前 mtDNA 遗传多样性是大约三分之一的在当代的现代人类。与线粒体蛋白演变的分析，这些数据表明的尼安德特人的长期有效种群大小是比现代人类和现存类人猿的少。
Neandertal 基因组和古代 DNA 真实性。
高吞吐量 DNA 测序的最新进展已灭绝生物的基因组的基因组规模分析可能。这些新的机会带来新的困难，在评估中检索的 DNA 序列的真实性。我们将讨论如何解决这些困难，尤其是 Neandertal 基因组的分析。我们认为只有直接测定的尼安德特人从所有当代人类有不同的 DNA 序列职位可以作为一种可靠的手段来估计人类的污染。间接的措施，如 DNA 碎片、 核苷酸 misincorporations 或在不同片段大小类中，派生的等位基因频率的比较的程度是不可靠的。幸运的是，基于 mtDNA 尼安德特人和当前人类，男性 Y 染色体序列，通过污染的检测之间的差异和重复序列从相同的化石来检测常染色体显性遗传污染的临时办法允许初始 Neandertal 基因组大规模测序。这将导致固定核基因组中尼安德特人和当前人类可以作为今后直接污染检测方法之间的差异的发现。用于分析的其他化石的智人可能在未来成为可能的我们建议类似的 '引导带' 方法，直到获得足够的数据，做更明确的直接检测适用的临时办法。
去除 Deaminated 的 Cytosines 和体内甲基化古 DNA 检测。
确定从古代生物的 DNA 序列有高的错误率，主要是由于尿嘧啶基地创建的胞嘧啶脱氨作用。我们使用合成的寡核苷酸，以及从猛犸象和 Neandertal 遗骸中提取的 DNA，以显示尿嘧啶-DNA-糖苷酶与核酸内切酶八治疗中尿嘧啶残留删除从古代 DNA 和修复大部分产生从无到有网站，离开未损坏部件的 DNA 片段不变。Neandertal DNA 序列与本议定书确定极大地增加了准确性。此外，我们的研究结果表明 Neandertal DNA 保留体内 CpG 甲基化模式，可能会让未来的基因失活的研究和印迹在远古生物。
早期的现代人类，从 Kostenki，俄罗斯的完整线粒体基因组。
从早期现代人类 (EMHs) 的 DNA 序列恢复可以揭示与尼安德特人的古老群体及其相互作用和它们在当前的人口之间的关系。然而，这种实验是很有问题的因为当今人类 DNA 经常污染骨头 [1，2]。例如，在最近的一项研究线粒体 (mt) DNA 从新石器时代的欧洲骨架，序列变异只采取了真确如果他们没有或罕见的现时的人口，而其他人也要折扣尽可能污染 [3，4]。这限制了对有效市场假说个人携带罕见序列分析，从而产生偏见，视古代基因池。其他办法确定污染的 DNA，如有投入的所有个人都联系与样本的基因分型的标本是可能的情况下限制分析 [5、 6] 并且不能排除所有可能的污染来源。通过研究 mtDNA Neandertal 遗骸，那里可以区分污染和内源性 DNA 序列，我们显示碎片模式和核苷酸 misincorporations 可以用于衡量古代 DNA 序列的真实性。我们使用这些功能来确定从大约 30,000 岁有效市场假说，从俄罗斯的 Kostenki 14 站点的完整的 mtDNA 序列。
Neandertal 基因组序列草图。
尼安德特人，当今人类的进化近亲在三万年前消失之前住在欧洲和西亚的大部分地区。我们目前的基因组的三个人从超过 40 亿核苷酸组成的 Neandertal 的序列草图。来自世界各地的五个当今人类基因组的 Neandertal 基因组的比较找出一些可能受祖传的现代人类，包括所涉及的基因在代谢和认知和骨骼发展中的积极选择的基因组区域。我们显示尼安德特人与当今人类在撒哈拉以南非洲与欧亚大陆比当今人类共享了更多的遗传变异暗示到非非洲人的祖先来自尼安德特人基因流发生前欧亚集团的分歧，从彼此。
有针对性地进行调查，通过基于阵列的序列捕获的 Neandertal 基因组。
现在是可能执行灭绝生物的全基因组鸟枪法测序，以及捕获特定基因组区域。然而，有针对性地重新排序的核基因组的大部分地区尚未被证明古代 DNA。在这里我们显示微阵列上的杂交捕获成功可以超过经过从 Neandertal 即使存在约 99.8%微生物 DNA DNA 的目标区域的恢复。使用这种方法，我们已经测序大约 14,000 蛋白质编码位置推断为对人类的沿袭自最后一个共同的祖先与黑猩猩共享后已更改。通过生成一个 Neandertal 和 50 当今人类在这些职位的顺序，我们确定了 88 已成为固定在人类以来我们分歧从尼安德特人的氨基酸替换。
路障上 Paleogenomes — — 聚合酶延伸分析揭示了阻塞病变在古代 DNA 中的频率。
虽然在过去几年看到很大的进步，从化石标本 DNA 序列检索中，一些古代 DNA 的特征仍然知之甚少。这是阻塞性病变，即化学改建，不能被忽视的 DNA 聚合酶，从而防止扩增及受影响的分子随后测序尤其如此。一些研究得出的结论，绝大多数古代 DNA 分子携带阻塞病变，建议拆除、 修复或旁路的阻塞病变可能会大大增加的时间深度和地理范围的标本可供古 DNA 分析。但是，以前的研究使用非常间接检测方法，没有对频率的阻塞病变中内源性的古代 DNA 提供确凿的估计数。我们开发了一个新方法，聚合酶延伸分析 （PEP），直接揭示了聚合酶在 DNA 模板上失速的匹配项。通过测序单引物延伸产品使用 PEP 方法成千上万，我们已经为古代 DNA 在单分子水平上第一次直接确定阻塞病变。虽然我们找到阻止病变三/四古代样品中的明确证据，但不超过 40%的分子受中的样本中，表明这种修改远不那么频繁，在古代 DNA 比以前所认为的任何影响。
从西伯利亚的 Denisova 山洞古 Hominin 组的遗传史。
使用从在西伯利亚南部的 Denisova 山洞发现手指骨中提取的 DNA，我们已测序约 1.9-fold 覆盖到古 hominin 基因的组。此人是从组中与尼安德特人共享共同的起源。这部分人口没有参与从尼安德特人的推定基因流成人士 ；但是，这些数据表明它贡献及其对当今美拉尼西亚人的基因组的遗传材料的 4-6%。我们指定此 hominin 人口 'Denisovans'，并建议它可能是广泛存在于亚洲期间在晚更新世。在 Denisova 山洞里发现的一颗牙进行线粒体基因组高度相似的手指骨。这颗牙尼安德特人与现代人类，进一步表明 Denisovans 有不同于尼安德特人与现代人类的进化历史一样没有派生的形态特征。
由底漆扩展 DNA 目标序列的快速检索捕获。
有方法普遍需要充实感兴趣之前高通量测序序列的 DNA 样本，并减少试探性的方法与相关的成本。虽然针对经过大小的区域，几个样品中很有用，如那些目前使用芯片杂交捕获方法涉及笨重的处理步骤、 孵化时间长和每个示例成本高。相比之下，底漆扩展捕获 (PEC) 方法允许小的基因组区域内 2 h，平行样品用低成本与 DNA 来源的直接选择。佩奇承诺有用的应用程序，如古代 DNA 或法医测序，分类测量的宏基因组样品或重复元素的基因组图谱的研究。
下一代测序库从受损 DNA 的制备。
下一代测序 （本国一般事务） 具有革命性的古代 DNA 研究，与高吞吐量目标浓缩方法结合使用时，特别是。然而，实现高测序深度和精度从样品往往仍然由于古代 DNA 受损状态有问题，特别是古代 DNA 极低拷贝数和丰度的尿嘧啶残留来自胞嘧啶脱氨作用，导致编码错误。因此是关键原料 DNA 提取到一个适配器结扎测序图书馆，改为使用非常有效的程序和同样重要的是从尿嘧啶残留量减少错误。我们提出一项议定书允许高效转化为适配器结扎窗体 DNA 片段的本国一般事务图书馆编制。议定书 》 包含了一个选项来删除绝大多数的尿嘧啶卫生局病变作为库制备过程的一部分。此过程要求只有两个自旋列纯化步骤和无凝胶纯化或珠处理。从 DNA 提取物 aliquot 开始，成品、 高度放大的图书馆可以生成中 5 h，或下 3 h 如果尿嘧啶去除不是必需的。
