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Articles by Andreas Franz in JoVE
JoVE General
Microdissection de Black Widow Soie d'araignée des glandes productrices
Department of Biological Sciences, University of the Pacific
Nous décrivons ici une stratégie efficace pour enlever les glandes produisant la soie de l'abdomen des femelles veuves noires. Cette procédure permet l'isolement rapide de la production de soie sept glandes distinctes d'une manière hautement purifiée, un processus important pour les enquêteurs étudient la production de soie d'araignée et de l'assemblage de fibres.
Other articles by Andreas Franz on PubMed
Preuve Glycosyl à Long Terme Des Réactions De Transfert En Phase Gazeuse
Une réaction de transfert glycosyl à longue distance a été observée dans la dissociation induite par collision de spectres de masse Fourier transform (CID FT) de benzylamine marqués et étiquetés 9-aminofluorene lacto-N-fucopentaose I (LNFP j'ai) et lacto-N-difucohexaose j'ai (LNDFH I). La réaction de transfert a été observée pour les molécules protonées, mais pas pour les molécules sodiated. La réaction de transfert longue distance glycosyl préférentiellement une des deux unités L-fucose en étiquetée LNDFH I. CID expérimente j'ai marqué LNFP et étiquetées LNFP II déterminé le fucose avec la plus grande propension pour la migration. D'autres expériences ont été effectuées pour déterminer la destination finale de la migration fucose. Modélisation moléculaire appuie les expériences et les mécanismes réactionnels sont proposés.
Non-calixarène-aminés Acides Complexes Covalents Formés Par MALDI-MS
Complexes d'inclusion non covalents entre acides aminés et dérivés calix [6] arènes sont observées en spectrométrie de masse MALDI. Les dérivés ester de méthyle, d'éthyle et de propyle de calix [6] arène a produit des complexes d'acides aminés, tandis que les plus petits analogues arene de calix [4] n'ont pas. De même l'arène underivatized calix [6] et le calix [4] arène ne produisent pas de complexes. Acides aminés complexes ont été observés pour presque tous les 20 acides aminés dans l'analyse de temps de vol (TOF). Dans l'analyse de spectrométrie de masse (FTMS) de transformation de Fourier, cependant, seulement les plus élémentaire acides aminés arginine, l'histidine et la lysine forment stables adduits. Les complexes sont abondants dans des conditions d'ionisation (MALDI) désorption laser assistée par matrice, qui suggère des interactions favorables entre hôte et invité.
Synthèse Douce De 2, 3-pyrannosyle Glycosidiques Cyanures Et C-2 Déoxy-2 Pyranosyle Cyanures Avec Hg(CN) (2) / HgBr (2) / TMSCN
Dimérisation catalysée par un acide de Lewis des mono - et glycosidiques glycals par-O-acétylé donna di - et tetrasaccharidic O-acétylé C-glycosides, respectivement. 2, 3-Pyrannosyle cyanures provenaient de glycals /-O-acétylé par une nouvelle, légère anomère S (N)'-acétoxy déplacement avec Hg(CN) (2) / HgBr (2) / TMSCN. Par-O-acétylé 2-C-2-désoxy-pyranoses ont été convertis en cyanures de pyranosyle par le même réactif. Une élimination de l'acide acétique sans précédent de dimères avec D-galacto-L-fuco-configurations et accompagné les S (N)-déplacement dans le cadre de ces conditions. Un nouveau set de (1) H RMN constantes pour 2, 3-pyrannosyle systèmes de couplage a été utilisé pour affectation configurationnelle des complexes tétrasaccharide mimétiques.
Haut Débit Approche One-perle-celui Du Complexe Peptide Codé De Bibliothèques Combinatoires : Analyse De MALDI-MS De Perles De TentaGel Uniques
L'identification des composés prometteurs sur le plan pharmacologique (composés du plomb) de bibliothèques combinatoires est souvent limitée par le débit de la technique d'analyse employée. Spectrométrie de masse à transformée de Fourier transform (FTMS) offre haute sensibilité, précision de la masse (m/Deltam > 500 000) et fonctions de séquençage. On présente une méthode rapide et efficace pour l'analyse de haut-débit de perles uniques de bibliothèques combinatoires peptidique codée avec la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice. Encodage des peptides sur perles uniques sont identifiés et structurellement caractérisés par MALDI temps de vol (TOF) et a MALDI Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) spectrométrie de masse. Il élabore une stratégie de préparation de l'échantillon sur la sonde pour réduire au minimum la manipulation des billes.
C-H-déprotonation Médiée Par Un Groupe Acétoxy Syn-axial Distance--une Formation Sans Précédent Double Liaison Sur Cyanation Du Dimère De L-fucal
Remplacement de l'acétate d'anomère par un groupe de cyanure dans le dimère de di-O-acétyl-L-fucal par l'action de l'acide de Lewis doux [Hg(CN) 2-HgBr (2)-SiCN Me (3)], a non seulement entraîné la transformation désirée mais aussi dans la mise en place d'une liaison double supplémentaire entre le C-2 a et C-3 a. En raison de sa configuration, le groupe acétoxy de C-4 a distant peut faciliter la déprotonation en fonctionnant comme un point d'ancrage interne. Spectroscopie RMN 1 H et la cristallographie aux rayons x montrent que les conformations des cycles A et B et leur orientation relative dans le cyanure de C-linked glycosidiques glycosyl qui en résulte, cyanure de 4-O-acetyl-2-C-(4-O-acetyl-2,3-dideoxy-alpha-L-threo-hex-2-enopyranosyl)-2,3-dideoxy-2-eno-alpha-L-fucopyranosyl, en solution sont pratiquement identiques à la structure cristalline.
Amélioration De La Séparation Par électrophorèse Capillaire Et Détection Par Spectrométrie De Masse Des Oligosaccharides
Nous avons développé une méthode de la CE pour la séparation des isomères structuraux des oligosaccharides étiquetés avec la benzylamine N-quaternisée. Oligosaccharides avec réduction des extrémités ont été dérivés avec de benzylamine par amination réductrice suivie par quaternisation pour produire une étiquette cation fixe. Les oligosaccharides dérivatisés de benzylamine ont été analysés par CE-UV dans le tampon d'acétate d'ammonium et d'ionisation de désorption hors ligne laser assistée par matrice (MALDI) MS. La méthode a été appliquée à un échantillon de 1 nmol d'un oligosaccharide modèle (LNDFH 1). De cet exemple, une norme dilué 38 fmol a été détectée. La quaternisation des produits marqués benzylamine considérablement amélioré la séparation CE d'oligosaccharides neutres ainsi que plusieurs isomères structuraux. Deux isomères de hexasaccharide (LNDFH I et II de la LNDFH) ont été résolue à l'aide d'un tampon d'acétate d'ammonium de base. Cette méthode a aussi été utilisée avec succès pour le profilage des oligosaccharides, libérés de la glycoprotéine B. RNase La libération de 6 pmol de glycanes suivie d'investigation a montré la détection de tous les composants, avec un composant correspondant à 100 fmol. Micropreparative collection de CE activé off-line avec succès CE-MALDI-MS sans échantillon supplémentaire de nettoyage. Ce rapport fournit une méthode simple et rapide pour séparer et d'analyser des oligosaccharides.
Analyse De MALDI-TOF Et ESI-MS Des Oligosaccharides Marquées Avec Une Nouvelle Balise Oligosaccharide Multifonctionnel
Un nouveau label d'oligosaccharide multifonctionnel avec un groupe amino de 1 degré a été synthétisé et caractérisé. L'étiquette d'oligosaccharide a été introduit dans plusieurs oligosaccharides neutres par amination réductrice, et les dérivés ont été analysés par désorption-ionisation de laser assistée par matrice (MALDI) temps de vol (TOF) et spectrométrie de masse par ionisation par électrospray (ESI). Il a été démontré que la réaction de l'étiquetage était satisfaisante, et qu'aussi peu que 50 pmol de matériel de départ pourrait être efficacement étiquetés avec une perte minimale de réactions secondaires. Un mélange de riches en mannose N-glycans libéré de la ribonucléase B a été labellisé. L'étiquette ne semble pas interférer avec la caractérisation structurale des oligosaccharides par spectrométrie de masse. N-quaternisation des oligosaccharides étiquetées a abouti à la sensibilité significativement accrue de détection avec aussi peu que 100 fmol sur la sonde détectée. Deutérium codage des marqués mélanges d'oligosaccharides et l'abondance relative des composantes du mélange a été étudiée. Un protocole pour la séparation chromatographique de mélanges d'oligosaccharides étiquetées par HPLC a été développé et est rapporté ici.
Tris(1,9-diethyladeninium) Triiodure Diiodure
Analyse par rayons x le titre révèle trois cations cristallographiquement distinctes de 1,9-diethyladeninium, deux anions iodure et un triiodide anion dans l'unité asymétrique, donnant six résidus et la formule 3C9H14N5 +.I3 - .2i-. nomenclature Standard purine est utilisé pour identifier les atomes de chaque portion de l'adénine. On observe des liaisons hydrogènes entre atomes N6 et N7 d'une paire de cations [N...N = 2.885 4/2.902 (3) et A de 2.854 3/2.854 (3)], avec des liaisons hydrogènes supplémentaires j'ai-anions par l'intermédiaire de l'autre atome de H N6 n [...J'ai = 3.708 (3), 3.738 (3) et 3.638 (3) A]. L'anion triiodure n'est pas impliquée dans la liaison hydrogène. Les longueurs des liaisons et les angles des cations 1,9-diethyladeninium sont comparées aux valeurs de la littérature et confirment la formation du tautomère imine.
Le Modèle De Liaison Disulfure De Saumon Oeuf Lectine 24 K De La Tshawytscha Saumon Chinook Oncorhynchus
Les liaisons disulfide dans la lectine spécifique galactose SEL 24 K de le œuf de la tshawytscha Saumon Chinook Oncorhynchus ont été déterminées par spectrométrie de masse. Quatre prédictive en silico outils ont été utilisés pour déterminer l'état d'oxydation des cystéines dans la séquence possible et des liaisons disulfide. Une combinaison de digestion trypsique, séparation HPLC et modifications chimiques ont été utilisés pour déterminer l'emplacement des sept ponts disulfures et une paire de cystéines gratuits. Après protéolyse, peptides contenant un ou deux ponts disulfures ont été identifiés par la réduction et la comparaison de la spectrométrie de masse. Spectrométrie de masse MALDI a été appuyée par la modification chimique (iodoacétamide) et digestion in silico. Les affectations des ponts disulfures ont été confirmées par des études de fragmentation en spectrométrie de masse dont la dissociation (DSI) de la source et la dissociation induite par collision (DIC). Les ponts disulfures déterminé expérimentalement et gratuits résidus Cys étaient seulement partiellement conformes à ceux générés par plusieurs algorithmes automatisés du domaine public.
Anticorps Anti-amyloide Bêta Déglycosylée Réduisent Microgliales Phagocytose Et Cytokine Production Tout En Conservant La Capacité D'induire La Séquestration De La Bêta-amyloïde
L'accumulation de protéine bêta-amyloïde (Abêta) est une caractéristique pathologique de la maladie d'Alzheimer, et abaisser la bêta-amyloïde est une approche thérapeutique prometteuse. Anticorps anti-Abêta intact réduisent le cerveau Abêta par deux voies : évolués microgliales phagocytose et transfert de la bêta-amyloïde du cerveau vers la périphérie (Abêta séquestration). Alors que l'activation des microglies, ce qui est essentiel pour la phagocytose des microglies, est nécessairement accompagnée d'événements indésirables thérapeutiques, la capacité pour la séquestration ne semble pas être liée à de tels effets. Autres groupes et nous avons trouvé que simples Abeta liants sont suffisantes pour réduire le cerveau Abêta par la voie de la séquestration du. Dans cette étude, nous visant à éliminer les potentiellement nocive activation immunitaire des anticorps sans affecter la capacité d'induire la séquestration. La partie glycane de l'immunoglobuline est gravement impliquée dans les interactions avec les effecteurs immunitaires dont la Fc du récepteur et le complément c1q ; déglycosylation élimine ces interactions, tandis que l'antigène (Abêta)-affinité de liaison est maintenue. Dans cette étude, nous avons examiné si les anticorps anti-Abêta déglycosylée réduisent microgliales phagocytose et neuro-inflammation sans altérer la capacité d'induire la séquestration de la bêta-amyloïde. Anticorps déglycosylée maintient affinité de liaison de bêta-amyloïde. Anticorps déglycosylée n'augmente pas la phagocytose de la bêta-amyloïde ou cytokine release dans primaire des microglies culture, tandis que les anticorps intacts a fait considérablement. Une injection intraveineuse d'anticorps déglycosylée plasma Abeta concentrations élevées et induite par séquestration de bêta-amyloïde dans une mesure similaire ou supérieure comparée avec l'anticorps intacts dans le modèle de souris transgénique un Alzheimer sans ou avec pathologie de plaque amyloïde bêta. Nous concluons que les anticorps déglycosylée effectivement induit Abeta séquestration sans provocation neuroinflammation ; ainsi, ces anticorps déglycosylée peuvent être optimales pour la thérapie de séquestration pour la maladie d'Alzheimer.
Synthèse Des Amphiphiles Conjugué Acide Folique Pour La Livraison De Drogue Tumeur Ciblées
L'acide folique a été dérivé de le spécifiquement à son groupe carboxyle gamma de conserver son activité de liaison du ligand à l'acide folique récepteur alpha (FRalpha) présent sur les cellules HeLa. Des molécules amphiphiles marqués avec de l'acide folique ont été préparés par la conjugaison de la longue chaîne des amines primaires directement ou par l'intermédiaire de linkers diamine à la fonction gamma-carboxyle de l'acide folique. Acide folique amphiphiles étiquetés avec fluorescent 7-amino-4-carbamoylmethylcoumarin (ACC) ont également été préparés pour visualiser l'absorption des amphiphiles en cellules positives de folate réceptrices. Les structures des nouveaux composés ont été vérifiés par la RMN du proton et de spectrométrie de masse MALDI-TOF. Amphiphiles forment des micelles dans l'eau. Concentration micellaire critique (CMC) ont été déterminées par la méthode par fluorescence de pyrène pour acide folique amphiphiles et la montée dans la méthode hauteur capillaire pour le fluorescent étiqueté amphiphile. Les CMC d'amphiphiles ont été étudiés dans une solution tampon à pH 8 et variait entre 2 et 64 microM. La formation de micelles augmente la solubilité du paclitaxel, un composé anticancéreux lipophiles de modèle, de plus de 80 %. Une quantité importante de l'amphiphile fluorescent étiqueté a été internalisée dans les cellules HeLa connues pour exprimer FRsalpha comparativement aux cellules Caco-2 qui n'expriment pas de FRalpha. Donc, marquée folate amphiphiles prometteuses dans le ciblage des agents antitumoraux exprimant le FRalpha des cellules cancéreuses.
Expression and Characterization of Recombinant Human Leukocyte Sécrétoire Protéase (SLPI) Inhibiteur De La Protéine De Pichia Pastoris
Inhibiteur de la protéase leucocytaire humain de sécrétion (SLPI) s'est avéré posséder des propriétés anti-protease, anti-inflammatoires et antimicrobiennes. Sa présence dans la salive est censé être un moyen de dissuasion majeur de transmission orale du virus de l'immunodéficience humaine-1. Le 11.7kDa peptide est une protéine glycosylée sécrétée, riche en ponts disulfures. Actuellement, SLPI recombinante est uniquement disponible en produit cher expression bactérienne. Nous avons étudié l'utilité de la méthylotrophes levure Pichia pastoris pour produire et sécréter SLPI avec des étiquettes de c-myc et polyhistidine C-terminal. Le protocole de vecteur après amplification a permis d'isoler les souches avec nombre de copie agrandie et paramètres de culture étaient variés pour optimaliser l'expression SLPI. Modification de la procédure de purification a permis la protéine sécrétée, recombinante à être isolés dans le milieu de fermentation sans cellule avec la chromatographie d'affinité de cobalt. Ce dérivé de levure SLPI s'est avéré ont une activité anti-protease comparable au produit bactérien disponible dans le commerce. Ainsi, P. pastoris fournit un système efficace et rentable de production SLPI pour études d'analyse de structure fonction, mais aussi un large éventail d'applications thérapeutiques potentielles.
Phase Gazeuse Brouillage Du Disulfure De Liaisons Au Cours De L'analyse De Spectrométrie De Masse De Désorption-ionisation Laser Assistée Par Matrice
Evidence for photoinduit radical disulfure dans la phase gazeuse au cours de la spectrométrie de masse de désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MS) est décrite. Le phénomène a été observé lors de l'analyse des peptides tryptiques de l'insuline et a été confirmé dans la détermination des ponts disulfures dans la lectine liant le rhamnose SEL24K de la tshawytscha Saumon Chinook Oncorhynchus. On propose un mécanisme possible pour ce brouillage surprenant. Malgré cette conclusion, le modèle de liaison disulfure dans SEL24K a cédé sans ambiguïté une stratégie multi-enzyme digestion en combinaison avec la spectrométrie de masse MALDI. Le modèle s'est avéré pour être symétrique par rapport à la séquence de répétition en tandem de SEL24K. Au meilleur de notre connaissance, il s'agit du premier rapport du pont disulfure dans la phase gazeuse au cours de l'analyse de MALDI-MS. Cette observation a des répercussions importantes pour l'ambiguité des ponts disulfures.
La Sécrétion Et La Protéolyse Des Protéines Hétérologues Fondue à La Protéine De Liaison Maltose Escherichia Coli in Pichia Pastoris
La protéine de liaison d'Escherichia coli maltose (MBP) a été utilisée comme un partenaire de fusion translationnelle afin d'améliorer l'expression des protéines étrangères dans e. coli. Quand trouve N-terminale de la protéine de sa cargaison, PBM augmente la solubilité des protéines intracellulaires et améliore l'exportation de protéines sécrétées dans les systèmes bactériens. Au départ, nous avons exploré si MBP aurait le même effet dans la méthylotrophes levure Pichia pastoris, un hôte eucaryote populaire pour l'expression de la protéine hétérologue. Lorsque MBP a été fusionnée en tant que partenaire N-terminale de plusieurs protéines de C-terminal fret exprimée dans cette levure, protéolyse ont eu lieu entre les deux peptides, et MBP a atteint la région extracellulaire non attachée à sa cargaison. Cependant, dans deux des trois cas, la protéine de cargaison a atteint la région extracellulaire ainsi et son attachement initial au MBP amélioré sa sécrétion de la cellule. Mutagenèse étendue de l'espaceur entre MBP et protéines C-terminal fret ne pourrait pas inhiber le clivage bien qu'il n'a provoqué des changements dans la protéase sites cibles dans les protéines de fusion, tel que déterminé par spectrométrie de masse. Pris ensemble, ces résultats suggèrent qu'une protéase indéterminé P. pastoris attaqué à différents endroits dans la région C-terminale du domaine MBP, y compris l'entretoise et les régions de la cargaison, mais le domaine MBP puisse encore agir pour améliorer la sécrétion de certaines protéines de la cargaison.
Une Méthode Améliorée Pour L'amélioration De La Production Et L'activité Biologique De L'inhibiteur De Protéase De Human Leukocyte Sécrétoire (SLPI) in Pichia Pastoris
Inhibiteur de la protéase leucocytaire humain de sécrétion (SLPI) est une protéine riche en cystéine kD 11,7 s'est avéré possèdent des propriétés antimicrobiennes, anti-inflammatoires et anti-protease. En utilisant une souche Pichia pastoris surproduit isomérase de protéine disulfure (PDI), nous avons obtenu plus de cinq fois supérieurs SLPI que chez les souches exprimant des niveaux normaux de PDI et contenant plusieurs copies du gène SLPI. Des niveaux élevés de PDI a également amélioré l'activité spécifique de la SLPI sécrétée en l'aidant à atteindre une bonne structure tertiaire. Analyse de spectrométrie de masse a révélé un plus grand nombre de ponts disulfures dans la SLPI produite par la souche de la surexpression de PDI par rapport à la SLPI produite dans des souches avec des niveaux normaux de PDI. Bien que d'autres ont utilisé une stratégie semblable pour augmenter le rendement, nous pensons que c'est le premier exemple de la surexpression de PDI en démonstration pour améliorer le pliage et ainsi accroître l'activité biologique d'une protéine produite dans la levure P. pastoris.
Fibres Synthétiques De Soie D'araignée Tissés à Partir De Piriforme Spidroin 2, Une Protéine De Soie Colle Découvert En Orb-tissage Disques De Fixation D'araignée
Araignée fibres de soie de fixation de disque sont filées dans un liquide visqueux qui se solidifie rapidement, les fibres de soie dragline collage de substrats pour la locomotion ou la construction web. Nous rapportons ici l'identification et la filature artificielles d'un roman de fixation du disque de la colle de fibroïne de soie, Piriforme Spidroin 2 (PySp2), à partir des clavipes l'orbe d'or Nephila tisserand. MS appui études PySp2 est un constituant de la glande piriforme, tourné en disques de fixation. Analyse de l'architecture des protéines PySp2 révèle une divergence de séquence par rapport aux autres membres de la famille de soie, y compris l'épi tisserand de soie colle PySp1 fibroïne. PySp2 contient répétitions de blocs internes qui se composent d'unités subrepeat deux: un dominée par Ser, Gln, Ala et Pro, et l'autre riche en. Filage artificiels de recombinants PySp2 troncatures montre que la subrepeat Ser-Gln-Ala-riche est suffisante pour l'assemblage de sous-unités polymères et la formation de fibres ultérieure. Ces études supportent que les deux orbe et épi de tissage araignées ont évolué fortement polaires bloc-répétition des séquences avec la capacité de s'auto-assembler en fibres, ce qui suggère une stratégie visant à permettre la fabrication de fibres dans le milieu liquide des disques de fixation.
Analyse De La Région 5' Non Traduite (5'UTR) De L'alcool Oxydase 1 (AOX1) Gène Dans L'expression De Protéine Recombinante Dans Pichia Pastoris
Pichia pastoris est une levure méthylotrophes qui a été génétiquement modifiée pour exprimer les protéines hétérologues de plus d'un millier d'une valeur à des fins de recherche industriel, pharmaceutique et base. Dans la plupart des cas, la région 5' non traduite (UTR) de l'alcool oxydase 1 (AOX1) gène est fusionnée à la séquence codante du gène recombinant pour l'expression de la protéine dans cette levure. Parce qu'on ne connaît pas l'effet de la AOX1 5'UTR sur l'expression de la protéine, mutagénèse dirigée a été réalisée afin de diminuer ou d'augmenter la longueur de cette région. Ces deux types de changements ont été montrés pour affecter l'efficacité traductionnelle, non stabilité de transcription. Tout en augmentant la longueur de la 5'UTR a clairement diminué l'expression d'un journaliste de la β-galactosidase de manière proportionnelle, une analyse de suppression a démontré que le AOX1 5'UTR contient un mélange complexe d'éléments d'intramoléculaires tant positifs que négatifs, ce qui suggère que la construction d'une synthèse 5'UTR optimisé pour un niveau plus élevé d'expression peut s'avérer difficile.
