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Articles by Andreas Franz in JoVE
JoVE General
Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda
Department of Biological Sciences, University of the Pacific
A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.
Other articles by Andreas Franz on PubMed
Evidencia De Reacciones De Transferencia De Glicosil De Largo Alcance En La Fase Gaseosa
Una reacción de transferencia de largo alcance glicosil se observó en la disociación inducida por colisión de espectros de masas Fourier transform (CID FT) de benzylamine-etiquetado y 9-aminofluorene-labeled lacto-N-fucopentaose me (LNFP yo) y lacto-N-difucohexaose I (LNDFH I). Se observó la reacción de transferencia para las moléculas protonada pero no para las moléculas de sodiated. La reacción de transferencia glicosil largo alcance preferencial una de las dos unidades de L-fucosa en etiquetado LNDFH I. CID experimentos con LNFP marcado y etiquetados LNFP II determinó la fucosa con la mayor propensión a la migración. Otros experimentos fueron realizados para determinar el destino final de la migración fucosa. Modelado molecular había apoyado los experimentos y se proponen mecanismos de reacción.
No-covalentes Calixarene-aminoácidos ácidos Complejos Formados Por MALDI-MS
Complejos de inclusión no covalente forman entre aminoácidos y derivatizados calix [6] arenes se observan en espectrometría de masas MALDI. Los derivados éster metil, etil y propil de calix [6] arene rindieron complejos de aminoácidos, mientras que los más pequeños análogos de arene calix [4] no. Del mismo modo el cáliz underivatized [6] arene y arene calix [4] no produjeron complejos. Complejos de aminoácidos fueron observados para casi todos los 20 aminoácidos en análisis de tiempo de vuelo (TOF). En análisis de espectrometría de masas (FTM) de transformación de Fourier, sin embargo, sólo el más básico de los aminoácidos arginina, histidina y lisina formaban estables aductores. Los complejos fueron abundantes en condiciones de ionización (MALDI) de desorción láser asistida por matriz, que sugirieron una interacción favorable entre el host y el cliente.
Síntesis Suave De Cianuros De 2, 3-enopyranosyl Disaccharidic Y Pyranosyl 2-C-2-deoxy Cianuros Con Hg(CN) 2/HgBr 2/TMSCN
Dimerización catalizado por el ácido de Lewis de mono - y disaccharidic glycals por-O-acetilado dio di - y tetrasaccharidic O-acetilado c-glucósidos, respectivamente. 2.3-Enopyranosyl cianuros se obtuvieron de glycals per-O-acetilado por una nueva, suave anomérico S (N)'-acetoxy desplazamiento con Hg(CN) 2/HgBr 2/TMSCN. Por-O-acetilado 2-C-2-deoxy-piranosas fueron convertidos en pyranosyl cianuros por el mismo reactivo. Acompañado de una eliminación sin precedentes de ácido acético de dímeros con D-galacto-L-CF-configuraciones y la S (N)-desplazamiento bajo esas condiciones. Un nuevo conjunto de (1) H NMR acoplamiento constantes para sistemas de 2, 3-enopyranosyl fue utilizado para la asignación basada en la configuración de complicado tetrasacárido imitadores.
Alto Rendimiento Compuesto Uno-grano-un Enfoque Librerías Combinatorias Péptido Codificado: Análisis De MALDI-MS De Solos TentaGel Granos
La identificación de compuestos farmacológicamente prometedores (compuestos de plomo) de librerías combinatorias con frecuencia está limitada por el rendimiento de la técnica analítica empleada. Espectrometría de masas de transformada de Fourier (FTM) ofrece capacidades de secuenciación, alta sensibilidad y exactitud total (m/Deltam > 500 000). Se presenta un método rápido y eficaz para el análisis de alto rendimiento de cuentas individuales de librerías combinatorias péptido codificado con espectrometría de masas (MALDI) de desorción/ionización láser asistida por matriz. Codificación péptidos en cuentas individuales son identificados y caracterizados estructuralmente por MALDI tiempo de vuelo (TOF) y ultrahigh-resolution MALDI Fourier transform ion ciclotrón resonancia (FT-ICR) espectrometría de masas. Se desarrolla una estrategia de preparación de muestras en la sonda para minimizar el manejo de las cuentas.
C-H-deprotonation Mediada Por Un Grupo De Remoto Acetoxy Syn-axial--una Formación Sin Precedentes De Enlace Doble Con Cianuro Del Dimer De L-fucal
Reemplazo del anomérico acetato por un grupo de cianuro en el dímero de di-O-acetyl-L-fucal por la acción del ácido de Lewis suave [Hg(CN) 2-HgBr (2)-SiCN Me (3)], resultó no sólo en la transformación deseada sino también en la introducción de un adicional doble enlace entre C-2A y C-3A. Debido a su configuración, el remoto grupo de acetoxy C-4A puede facilitar la Deprotonación funciona como una base interna. Espectroscopia de RMN de 1 H y Cristalografía de rayos x indican que las conformaciones de anillos A y B y su orientación relativa en el resultante glicosil disaccharidic C-ligado cianuro, cianuro de 4-O-acetyl-2-C-(4-O-acetyl-2,3-dideoxy-alpha-L-threo-hex-2-enopyranosyl)-2,3-dideoxy-2-eno-alpha-L-fucopyranosyl, en solución son virtualmente idénticas a la estructura cristalina.
Mejor Separación De Electroforesis Capilar Y Detección De Espectrometría De Masa De Oligosacáridos
Hemos desarrollado un método para la separación de los isómeros estructurales de oligosacáridos con N-CUATERNIZADA benzylamine de CE. Oligosacáridos con reducción extremos fueron derivatizadas con benzylamine por aminación reductora seguido por Cuaternización ceder una etiqueta de catión fijo. Se analizaron los oligosacáridos benzylamine-derivatizada por CE-UV en tampón de acetato de amonio e ionización de desorción de fuera de la línea láser asistida por matriz (MALDI) MS. El método fue aplicado a una muestra de nmol 1 de un oligosacárido de modelo (LNDFH 1). De esta muestra se detectó un estándar diluida de 38 fmol. La Cuaternización de productos marcados con benzylamine mejoró significativamente la separación de la CE de oligosacáridos neutros junto con varios isómeros estructurales. Dos isómeros de hexasaccharide (LNDFH I y II de LNDFH) fueron base resuelta mediante un tampón de acetato de amonio. Este método también se aplicó con éxito a los perfiles de los oligosacáridos de la glicoproteína RNasa B. La liberación de 6 pmol de glicanos seguido workup demostraron la detección de todos los componentes, con un componente correspondiente a 100 fmol. Micropreparative colección de CE había activado off-line exitoso CE-MALDI-MS sin muestra adicional limpieza. Este informe proporciona un método simple y rápido para separar y analizar los oligosacáridos.
Análisis De MALDI-TOF Y ESI-MS De Oligosacáridos Con Una Nueva Etiqueta Oligosacárido Multifuncional
Un nuevo sello de oligosacárido multifuncional con un grupo amino de 1 grado fue sintetizado y caracterizado. La etiqueta del oligosacárido fue introducida en varios oligosacáridos neutrales por aminación reductora, y los derivados se analizaron mediante desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI) tiempo de vuelo (TOF) y por ionización por electrospray (ESI) de espectrometría de masas. Se demostró que la reacción de etiquetado fue satisfactoria, y que tan poco como 50 pmol de material de partida podría ser eficientemente marcados con una mínima pérdida de reacciones secundarias. Una mezcla de alta-manosa N-glicanos liberados de ribonucleasa B fue etiquetada. La etiqueta no parece interferir con la caracterización estructural de los oligosacáridos por espectrometría de masas. N-Cuaternización de los oligosacáridos etiquetados resultó significativamente mayor sensibilidad de detección con tan poco como 100 fmol la sonda detecta. Deuterio codificación de etiquetado mezclas de oligosacáridos y abundancia relativa de los componentes de la mezcla fue investigado. Un protocolo para la separación cromatográfica de las mezclas de oligosacáridos etiquetados por HPLC se desarrolló y se divulga aquí.
Tris(1,9-diethyladeninium) Triiodide Diioduro
Análisis de la radiografía del título compuesto revela tres cationes crystallographically distintos de 1, 9-diethyladeninium, dos de aniones de yoduro y un triiodide anión en la unidad asimétrica, dando seis residuos y la fórmula 3C9H14N5 +.I3 - .2i-. nomenclatura de purina estándar se utiliza para identificar los átomos de cada molécula de adenina. Hidrógeno se observa entre los átomos N6 y N7 de un par de cationes [N...N = 2.885 4/2.902 (3) y A de 2.854 3/2.854 (3)], con hidrógeno adicional vinculación a aniones vía el otro átomo H N6 [N...Yo = 5.115 (3), 3.738 (3) y 3.638 (3) A]. El anión triiodide no está involucrado en la vinculación del hidrógeno. Las longitudes de enlace y ángulos de los cationes de 1,9-diethyladeninium se comparan con los valores de la literatura y confirman la formación del tautómero imina.
El Patrón De Enlace De Disulfuro De Salmón Huevo Lectinas 24 K Del Salmón Chinook Oncorhynchus Tshawytscha
El disulfuro de la lectina galactosa específicos SEL 24 K del huevo del salmón Chinook Oncorhynchus tshawytscha se determinaron mediante espectrometría de masas. Cuatro predictivo en silico herramientas se utilizaron para determinar el estado de oxidación de cisteínas en la secuencia y posible ubicación de los enlaces de disulfuro. Una combinación de digestión tríptica, separación de HPLC y modificaciones químicas fueron utilizados para establecer la ubicación de siete enlaces disulfuro y un par de cisteínas libres. Después de proteólisis, péptidos que contienen uno o dos enlaces de disulfuro se identificaron mediante reducción y comparación de masa espectral. Espectrometría de masas MALDI fue apoyada por modificación química (Yodoacetamida) y en la digestión de silico. Las asignaciones de disulfuro más fueron confirmadas por estudios de masa espectral de la fragmentación y disociación inducida por colisión (CID) en fuente de disociación (ISD). Los enlaces disulfuro determinado experimentalmente y libres residuos Cys coincidieron sólo parcialmente con los generados por varios algoritmos automatizados de dominio público.
Anticuerpos Anti-amyloid Beta De Deglycosylated Reducen La Producción De Fagocitosis Y Citoquinas De Microglial Conservando La Capacidad Para Inducir El Secuestro De Beta Amiloide
Acumulación de beta amiloide (Abeta) es una característica patológica de la enfermedad de Alzheimer, y reducir de Abeta es un enfoque terapéutico prometedor. Anticuerpos anti-Abeta intacto reducen cerebro Abeta a través de dos vías: fagocitosis microglial y traslado de Abeta desde el cerebro a la periferia (Abeta secuestro). Mientras que la activación de la microglía, que es esencial para la fagocitosis microglial, necesariamente se acompaña de eventos no deseados capensis, la capacidad de secuestro no parece vincularse a tales efectos. Nosotros y otros grupos hemos encontrado que agentes de enlace de Abeta simples son suficientes para reducir el cerebro Abeta a través de la vía del secuestro. En este estudio, se intentó eliminar la activación inmune potencialmente perjudicial de anticuerpos sin afectar la capacidad de inducir el secuestro. La porción de glicanos de inmunoglobulina críticamente participa en las interacciones con los efectores inmunes incluyendo la c1q del receptor y complemento del Fc; deglycosylation elimina estas interacciones, mientras que el antígeno (Abeta)-vinculante afinidad se mantiene. En este estudio, investigamos si los anticuerpos de anti-Abeta deglycosylated reducen microglial fagocitosis y neuroinflamación sin alterar la capacidad para inducir el secuestro de Abeta. Anticuerpos Deglycosylated mantienen Abeta afinidad. Anticuerpos Deglycosylated no mejoran la fagocitosis de Abeta o citocinas liberar en primaria microglia cultivada, mientras que los anticuerpos intactos lo hicieron significativamente. La inyección intravenosa de anticuerpos deglycosylated plasma Abeta niveles elevados e inducida por secuestro de Abeta similar o mayor grado en comparación con anticuerpos intactos en modelo de ratón transgénico para el Alzheimer sin o con patología de placa de Abeta. Concluimos que los anticuerpos deglycosylated efectivamente inducida Abeta secuestro sin que provoca neuroinflamación; así, estos anticuerpos de deglycosylated pueden ser óptimos para la terapia de secuestro para la enfermedad de Alzheimer.
Síntesis De Anfífilos Conjugado Con ácido Fólico Para La Administración De Fármacos Dirigidos a Tumor
El ácido fólico era derivatizado específicamente en su grupo gamma-carboxilo para retener su actividad ligando para el folato receptor alfa (FRalpha) presente en las células HeLa. Moléculas anfifílicas etiquetadas con ácido fólico fueron preparadas por la conjugación de cadena larga aminas primarias directamente o a través de conectores de diamina al grupo gamma-carboxilo del ácido fólico. Ácido fólico Anfífilos marcados con fluorescente 7-amino-4-carbamoylmethylcoumarin (ACC) también estaban preparados para visualizar la captación de Anfífilos en células positivas del receptor de folato. Las estructuras de los nuevos compuestos fueron verificadas por proton NMR y espectrometría de masas MALDI-TOF. Los Anfífilos forman micelas en agua. Concentración micelar crítica (CMC) se determinaron por el método de fluorescencia de pireno para Anfífilos de ácido fólico y el aumento en el método de la altura capilar para la fluorescencia etiquetada amphiphile. La CMC de los Anfífilos fueron estudiado en solución amortiguadora con pH 8 y osciló entre 2 y 64 microM. La formación de micelas incrementa la solubilidad de paclitaxel, un compuesto anticancerígeno lipofílico del modelo, de más del 80%. Una cantidad significativa de la fluorescencia de etiquetado amphiphile fue asimilada en células HeLa conocidas para expresar FRsalpha en comparación con células Caco-2 que no expresan FRalpha. Por lo tanto, marcado con folato Anfífilos prometen en dirigidos a agentes antitumorales a células de cáncer de FRalpha-expresión.
Expresión Y Caracterización De Leucocitos Secretores Humana Recombinante Proteasa Inhibidor (SLPI) Proteína De Pichia Pastoris
El inhibidor de proteasa de leucocito humano secretores (SLPI) ha demostrado poseer propiedades anti-proteasa, antiinflamatorias y antimicrobianas. Su presencia en la saliva se cree que es un importante elemento de disuasión para transmisión oral del virus de inmunodeficiencia humana-1. El 11.7kDa el péptido es una proteína secretada, de nonglycosylated rica en enlaces disulfuro. Actualmente, recombinante SLPI sólo está disponible como un producto caro expresión bacteriana. Hemos investigado la utilidad de la levadura metilotrófica Pichia pastoris producir y secretar SLPI con C-terminal c-myc y polyhistidine. El protocolo de amplificación del vector post-transformational fue utilizado para aislar cepas con número creciente de la copia, y parámetros de cultivo fueron variados para optimizar la expresión SLPI. Modificación del procedimiento de purificación permitió la proteína secretada, recombinante para aislarse del medio de fermentación sin células con cromatografía de afinidad de cobalto. Este derivado de levadura SLPI mostró tener una actividad anti-proteasa comparable al producto bacteriano comercialmente disponible. Así, p. pastoris proporciona un sistema eficiente y rentable para la producción de SLPI para estudios de análisis de la función de estructura, así como una amplia gama de posibles aplicaciones terapéuticas.
Codificación De Fase Gaseosa De Disulfuro De Bonos Durante El Análisis De Espectrometría De Masas De Desorción/ionización Láser Asistida Por Matriz
Se describe la evidencia para foto-inducida radical disulfuro luchando en la fase gaseosa en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS). El fenómeno fue observado durante el análisis de los péptidos trípticos de insulina y fue confirmado en la determinación de disulfuro en la lectina de unión a ramnosa SEL24K del salmón Chinook Oncorhynchus tshawytscha. Se propone un mecanismo posible para este sorprendente el revolver. A pesar de este hallazgo, el patrón de enlace de disulfuro en SEL24K fue asignado sin ambigüedad por una estrategia de digestión Multi-enzima en combinación con espectrometría de masas MALDI. El patrón fue encontrado para ser simétrica en la secuencia de repetición de tándem de SEL24K. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer informe de disulfuro luchando en la fase de gas durante el análisis por MALDI-MS. Esta observación tiene ramificaciones importantes para asignación inequívoca de disulfuro.
Secreción Y Proteólisis De Proteínas Heterólogas Fusionado a La Proteína De Unión De Maltosa De Escherichia Coli En Pichia Pastoris
La proteína de unión de maltosa de Escherichia coli (MBP) ha sido utilizada como un socio de fusión traslacional para mejorar la expresión de proteínas extrañas en e. coli. Cuando encuentra N-terminal a su proteína de carga, MBP aumenta la solubilidad de las proteínas intracelulares y mejora la exportación de proteínas secretadas en sistemas bacterianos. Inicialmente se analizó si MBP tendría el mismo efecto en la levadura metilotrófica Pichia pastoris, una popular presentadora eucariota para la expresión de proteínas heterólogas. Cuando MBP fue fundido como socio N-terminal a varias proteínas de carga C-terminal expresan en esta levadura, proteólisis ocurrió entre los dos péptidos, y MBP alcanzó la región extracelular desapegada a su cargo. Sin embargo, en dos de tres instancias, la proteína de carga alcanzó la región extracelular y su adhesión inicial a MBP reforzado su secreción de la célula. Mutagénesis extensa de la región de espaciador entre MBP y su proteína de carga C-terminal no podría inhibir el escote aunque provocaron cambios en la proteasa sitios de destino en las proteínas de fusión, según lo determinado por espectrometría de masas. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que una proteasa desacostumbrado p. pastoris atacado en distintos lugares de la región c-terminal del dominio MBP, incluyendo el espaciador y regiones de carga, pero el dominio MBP todavía podría actuar para aumentar la secreción de ciertas proteínas de carga.
Un Método Mejorado Para Mayor Producción Y Actividad Biológica De Inhibidor De La Proteasa De Leucocito Humano Secretores (SLPI) En Pichia Pastoris
El inhibidor de proteasa de leucocito humano secretores (SLPI) es una proteína de cisteína-rica de kD 11,7 que ha demostrado poseer propiedades anti-proteasa, antiinflamatorias y antimicrobianas. Utilizando una cepa de Pichia pastoris que produce isomerasa de proteína disulfuro (PDI), obtuvimos más de cinco veces mayores niveles de SLPI que en cepas que expresan niveles normales de PDI y que contiene múltiples copias del gen SLPI. Niveles elevados de PDI también ha mejorado la actividad específica de la SLPI secretada por lo ayuda a lograr una adecuada estructura terciaria. Análisis de espectrometría de masas indican un mayor número de enlaces disulfuro en la SLPI producida por la cepa de la sobreexpresión de PDI en comparación con la SLPI producido en cepas con niveles normales de PDI. Aunque otros han utilizado una estrategia similar para aumentar la producción, creemos que este es el primer ejemplo de sobreexpresión de PDI ser demostrado mejorar el plegamiento y así aumentar la actividad biológica de una proteína producida en la levadura p. pastoris.
Las Fibras De Seda De Araña Sintética Hilado a Partir De Piriformes Spidroin 2, Una Proteína De Seda Pegamento Descubierto En Orbe-discos De Fijación De Tejido De Araña
Araña de fijación fibras de seda de disco se hizo girar en un líquido viscoso que se solidifica rápidamente, encolado fibras de seda draga a sustratos de locomoción o construcción tela. Aquí se presenta la identificación y el giro artificiales de una novela de apego disco adhesivo de seda fibroína, piriformes Spidroin 2 (PySp2), de los de oro clavipes Nephila Orb Weaver. Estudios soporte MS PySp2 es un constituyente de la glándula piriforme que se hace girar en discos de fijación. Análisis de la arquitectura de la proteína PySp2 revela la secuencia de divergencia con respecto a los miembros de la familia de seda, como la mazorca tejedora de seda fibroína PySp1 pegamento. PySp2 contiene repeticiones internas de bloques que consisten en dos unidades subrepeat: uno dominado por Ser, Gln, Ala y Pro y el otro rico. Hilatura artificiales de recombinantes PySp2 truncamientos muestra que el subrepeat Ser-Gln-Ala-rico es suficiente para el montaje de subunidades poliméricas y la formación de fibras posterior. Estos estudios apoyan que tanto el orbe-y mazorca de tejido de las arañas han evolucionado muy polares repetición de bloques de secuencias con la capacidad de auto-ensamblan para formar las fibras, lo que sugiere una estrategia para permitir la fabricación de fibras en el medio líquido de los discos de fijación.
Análisis De La 5' Región Sin Traducir (5'UTR) De La Alcohol Oxidasa 1 (AOX1) Gene En La Expresión De Proteínas Recombinantes En Pichia Pastoris
Pichia pastoris es una levadura metilotrófica que ha sido genéticamente modificada para expresar proteínas heterólogas 1 mil más valoradas para la investigación industrial, farmacéutica y básico. En la mayoría de los casos, el 5' región sin traducir (UTR) de la alcohol oxidasa 1 (AOX1) gene está fusionada a la secuencia de codificación del gen recombinante de la expresión de proteínas en esta levadura. Porque no se conoce el efecto de la AOX1 5'UTR en expresión de la proteína, mutagénesis sitio-dirigida fue realizada con el fin de disminuir o aumentar la longitud de esta región. Ambos tipos de cambios mostraron afecta la eficiencia traduccional, no estabilidad de transcripción. Mientras que aumentando la longitud de la 5'UTR disminuido claramente la expresión de un reportero de la β-galactosidasa en forma proporcional, un análisis de la canceladura demostró que la AOX1 5'UTR contiene una mezcla compleja de elementos de acción cis tanto positivas como negativas, sugiriendo que la construcción de un sintético 5'UTR optimizado para un mayor nivel de expresión puede ser desafiante.
