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Articles by Astrid M. van der Sar in JoVE
JoVE Immunology and Infection
細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University
透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している
Other articles by Astrid M. van der Sar on PubMed
受容体蛋白質チロシン脱燐酸化酵素アルファ ノックダウン ゼブラフィッシュの目の欠陥。
受容体蛋白質チロシン脱燐酸化酵素 α (RPTP α) 別の種の発展途上の網膜で高発現しているですが、そこにその機能についてはほとんど知られていません。ここでは、インジェクション アンチセンス morpholinos ゼブラフィッシュ胚削減 RPTP アルファ式にほぼ nondetectable での 3 日間 postfertilization (dpf) レベルを報告します。RPTP アルファ以降 4 dpf 再度から検出されました。RPTP アルファ ノックダウン小さい目になりました。網膜のセクションの検討発達段階別既に 28 時間 postfertilization （hpf) でより少ないセル RPTP アルファ morpholino 注入された胚の網膜に存在ことを実証しました。3 の dpf で網膜の層状組織は欠席しました。また、形態とラベリング、アセチル化チューブリン、軸索特異抗体とほとんどの細胞が分化するのに見えた示した。驚くほど、5 dpf で網膜のラミネーションだった部分的に復元された、逆転 RPTP アルファ蛋白の併用。網膜細胞が分化した今が、網膜のレイヤリングが中断さで残った、大きなギャップ アマクリン細胞層で観察されました。したがって、ノックダウン ・ RPTP アルファ蛋白質の RPTP アルファが正常な網膜発達に不可欠であること証拠を提供します。
ゼブラフィッシュ胚サルモネラ ネズミチフス菌感染症のリアルタイム解析用モデルのホストとして。
細菌の病原性は最高動物モデルで検討しました。ただし、リアルタイム分析のための可能性の欠如と骨の折れると侵襲性のサンプル分析の必要性は実験動物の使用を制限します。現在研究 28 h 旧ゼブラフィッシュの胚サルモネラ菌の利用した DsRed 標識細胞と感染しました。正確な位置とこれら細菌の病原体脊椎動物ホストの生活での運命の 3 日間を決定することができた多次元のデジタル イメージング顕微鏡を用いた。サルモネラ野生型の低用量で致命的な伝染に居住し、乗算のマクロファージ様細胞および血管の上皮の両方の細菌と結果。リポポリサッカライド (LPS) 変異株のサルモネラ、マウスモデルで減衰して知られてゼブラフィッシュ胚における病原性のあることが証明されたもで血流を分離や、マクロファージ様細胞の低下が部分的にものとあります。しかし、LPS 卵黄は胚の突然変異系統の噴射制御不能の細菌の増殖の結果。熱殺された、野生型の細菌これらゼブラフィッシュ胚の血液すでに溶菌活性含まれてことを示しています注入後数分以内に完全に細胞外分離されました。結論として、ゼブラフィッシュ胚モデルは急速に非侵襲とリアルタイム分析の細菌感染症は、脊椎動物のホストことができます。
結核菌 Marinum 菌株は遺伝的多様性と病原性に基づく 2 つのタイプに分けることができます。
結核菌 marinum poikilothermic 動物の大規模な数で全身の結核のような疾患を引き起こすし、モデルとして抗酸菌の病因のために使用されます。本研究では、我々 異なる株の病原性変異を決定する M. marinum シマウマの魚 （ダニオ形態学） に感染。M. marinum 分離によって、魚は急性または慢性の病気を開発しました。慢性疾患別の臓器と動物の生存のために少なくとも 4 〜 8 週間の肉芽腫形成によって特徴づけられたに対し急性疾患病原体の制御不能な成長と 16 日以内のすべての動物の死によって特徴づけられました。増幅断片長多型による分離株の遺伝子解析 M. marinum 系統を 2 つのクラスターに分けることができることを示した。クラスター クラスター II 系統の大半は poikilothermic の種から分離されたに対し、私は主に魚タンク肉芽腫と人間から分離された菌株に含まれます。急性疾患の進行すべての慢性疾患を引き起こす菌株クラスター II に属する一方私をクラスターに属する菌株のみが認められました。この病原性の違いも in vitro で認められた: Mma20 を特定のクラスターに感染し、ヒトのマクロファージ THP 1 をより効率的に生き残ることができたし、クラスター II よりも鯉白血球 CLC 細胞株 Mma11 を分離します。我々 は結論そのひずみ特性 M. marinum の病原性に重要な役割を再生します。また、そのクラスターの遺伝的変異とホスト起源の相関を示唆私は菌株は人間にとってより病原性。
マイコバクテリウムMarinum感染による慢性結核の後期段階でのアダルトゼブラフィッシュのトランスクリプトームプロファイリング
マイコバクテリウムmarinum-ゼブラフィッシュの感染モデルは生物レベルでの結核菌感染に対する宿主のトランスクリプトーム応答の解析のために本研究で使用されていました。 RNAはマイクロアレイ解析で健康魚からのRNAと比較したM. marinum慢性進行性の感染による魚の結核の典型的な兆候を示した成人ゼブラフィッシュから単離された。オリゴヌクレオチドセット（シグマCompugenとMWGによって設計されている）発見し、アフィメトリクスGeneChipsは45465ゼブラフィッシュ転写産物の注釈を含んで合計で、使用されました。詳細な比較分析と定量的逆転写酵素-PCR分析に基づいて、我々は、その規制を強く分析マイクロアレイの3種類のマイコバクテリア感染によって影響される159の遺伝子のセットを検証基準を提示します。さらに、我々は、免疫関連遺伝子の発現プロファイルに特別な重点を置いたマイクロアレイの別個のデータセットを分析した。アップレギュレートされた遺伝子は、以前に他の生物の細胞培養物中のマイコバクテリア感染症への応答に関与している炎症反応といくつかの遺伝子の多くは知られているコンポーネントが含まれています。ゼブラフィッシュで特徴づけられている骨髄細胞系列の異なるマーカー遺伝子も発現の増加を示した。さらに、免疫応答に関係を持つ多くのシグナル伝達遺伝子のゼブラフィッシュ同族体はM. marinumの感染によって誘導された。これらの遺伝子の将来の機能解析は、マイコバクテリアの病因のメカニズムを理解することに貢献するかもしれない。免疫応答にリンクされている遺伝子の大規模なグループは、感染動物における発現の変化を示さなかったので、これらの結果は、マイコバクテリウムによって誘発される疾患に特異的応答を示唆している。
ゼブラフィッシュ胚の感染モデルにおけるMyD88を自然免疫機能
脊椎動物の胚発生時に先天性免疫シグナル伝達機構はほとんど不明である。ゼブラフィッシュ胚のモデルで関数をシグナル伝達Toll様受容体（TLR）を勉強するために、我々は、細菌感染の条件下でのアンチセンスモルフォリノノックダウン実験を設計しました。サルモネラ血清型TyphimuriumのRaの細菌のクリアランスは有意に骨髄分化因子88（MyD88に）、TLRに共通のアダプタータンパク質とインターロイキン-1受容体シグナリングのノックダウンした後に障害されていた。これにより、我々は、胚の先天性免疫応答は、さらに脊椎動物の自然免疫の研究のためのモデルとしてゼブラフィッシュ胚を確立し、MyD88依存性シグナル伝達を、含むことを初めて示しています。
炎症とゼブラフィッシュにおける抗酸菌肉芽腫形成に関与するMycの発現好中球人口の同定とリアルタイムイメージング
エンハンサートラップスクリーニングによって、私たちは遅れて胚と初期発育中の白血球固有のYFPの発現を示すトランスジェニックゼブラフィッシュの行を同定した。そのエンハンサー検出の挿入は、人間の骨髄造血の調節に重要であることが知られている転写因子をコードする、mycプロトオンコジーンファミリーの新規メンバーの近くにマッピングされていました。ゼブラフィッシュmycの家族の特性は、この特定のmyc遺伝子が強く白血球に発現していることを示した。 MYC / YFPを発現する細胞の種類を識別するために、我々はLCP1は、一般的な白血球マーカー、マクロファージ特異的マーカーとしてcsf1rと、MPXとみなすことができることを示すと、in situハイブリダイゼーション蛍光多重化によって説明骨髄マーカーの特異性を再検討好中球特異的マーカーとしてLYZ。その後の共局在化分析では、好中球人口のサブセットとしてYFP陽性細胞を定義しました。リアルタイム共焦点イメージングを用いて、我々はこれらの細胞が炎症部位に移行し、菌marinum誘発性肉芽腫形成を含む感染に対する自然免疫応答に関与していることを示している。
非常に若い子に魚からヒト型結核菌 Marinum の伝送。
結核菌 marinum 結核で魚と人が汚染された水で泳ぐや感染した魚との直接接触がヒトの皮膚感染症を引き起こすことができます。汚染されたバケットと間接的な接触を通じて感染を取得 M. marinum 膿瘍と 18 ヶ月歳の少女の事例を報告します。適切なクリーニングの水族館機器、家庭での小さなお子様連れ特に非常に重要です。
急性および慢性マイコバクテリア感染にゼブラフィッシュのホストトランスクリプトーム応答の特異性と自然免疫と獲得免疫成分の役割
マイコバクテリア病原体はマクロファージ内で生存し、肉芽腫の内部に保持する能力を持っています。宿主遺伝子発現プロファイルのマーク変更中のマイコバクテリア感染過程の結果の結果を決定する複雑な宿主 - 病原体相互作用。それぞれ、マイコバクテリウムmarinum株Mma20とE11に起因する早期の致死性または肉芽腫形成を伴う慢性疾患と急性疾患、：ここでは、個別の疾患の転帰を与える2つのマイコバクテリウムの菌株による感染に対する宿主応答の特異性を調査するためにゼブラフィッシュモデルを使用。私たちは、大人のゼブラフィッシュの疾患進行の異なる段階のマイクロアレイ研究を行い、急性および慢性の株は部分的に彼らは大いに異なる病気の表現型を誘導するにもかかわらず、ホストのトランスクリプトームのシグネチャを重複誘発ことがわかった。両系統は、WntとTLR経路を含む多くのシグナル伝達カスケードを、影響を受けた。興味深いことに、最強の違いは病気の初期段階で観察された。急性株への即時応答は、MHCクラスIタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼ、転写因子、サイトカインおよび他の一般的な免疫応答タンパク質をコードする遺伝子の高発現によって特徴付けられた。対照的に、低分子量GTPaseとヒストン遺伝子群は、慢性的な歪みに応じてより高い発現を示した。また、肉芽腫形成の異なるステージで感染したゼブラフィッシュの大人と胚の発現シグネチャとの間で重複して約1000マイコバクテリア応答遺伝子が見つかりました。大人のゼブラフィッシュは、哺乳類とゼブラフィッシュの胚に似て適応免疫系を持っているので、先天性免疫に頼って、この重なりはマイコバクテリア感染に応答して免疫系の生得的なコンポーネントの主要な寄与を示しています。一緒になって、急性対慢性感染症や胎児の対成人状況に関与してトランスクリプトーム応答の我々の比較は、マイコバクテリアの病因のメカニズムを調べるための重要な新しいリードを提供しています。
ゼブラフィッシュの開発と再生：生物医学研究のための新しいツール
パターン形成の基礎研究は、表現型や組織の生成に関係しています。したがって、医学研究のための新しいツールにつながることができます。これらは表現型のスクリーニングアッセイ、組織工学への応用だけでなく、医学知識の一般的な進歩が含まれています。ここで我々の目的は、ゼブラフィッシュの発生生物学に基づいたツールへの特別参照して、この新興分野を議論することである。我々は、我々自身と他のラボで開発された表現型のスクリーニングアッセイを説明します。私たちのアッセイが含まれる：（i）の試験化合物または薬剤の全身または局所投与がin vivoでゼブラフィッシュには、定義された表現型の変化（ⅱ）その後の検出または "読み出し"。正の読み出しは、試験化合物の結合から発達経路に関与する分子標的になる可能性があります。我々は、骨格パターニング、骨代謝、免疫応答、炎症、早期寿命のストレスを調節する化合物のアッセイの予備的データを提示する。アッセイは、尾鰭の再生を受けて生きてゼブラフィッシュの胚および幼虫だけでなく、大人の魚を使用しています。我々はマイクロを使用して再生blastemasに化合物のローカライズされたターゲット上のproof-of-concept試験について説明します。ゼブラフィッシュは、げっ歯類よりも維持するために安価である、透明な卵を大量生産し、いくつかのゼブラフィッシュのアッセイは、培地およびハイスループットスクリーンにアップスケーリングすることができます。しかし、自動化とイメージングの進歩が必要となります。ゼブラフィッシュは、医薬品の開発パイプラインで、哺乳動物のモデルを置き換えることはできません。それにもかかわらず、彼らは、セルベースアッセイおよび哺乳類の全生物のモデル間の費用対効果のブリッジを提供することができます。
ゼブラフィッシュ胚における自然免疫における γ インターフェロンの役割。
ゼブラフィッシュ ゲノムにはエンコード クラス II のサイトカインのようなペプチドの IFN-gamma1 と IFN gamma2 哺乳類のインターフェロン ガンマ (IFN-γ) 最も密接に関連して、2 つが命名された、10 の遺伝子が含まれています。ゼブラフィッシュ免疫のメカニズムを研究する人気モデル システムとなっていますとインターフェロン ゼブラフィッシュ サイトカイン機能的哺乳類の IFN-γ に対応する免疫の中央レギュレータですが確立されていません。アッセイの IFN-gamma1 と IFN-gamma2 の機能とゼブラフィッシュ胚における IFN γ ターゲットとしてゼブラフィッシュ ホモログ哺乳類の IFN-応答性遺伝子群のサブセットを特定するゼブラフィッシュ胚を使用する: これらの遺伝子の IFN-gamma1 または IFN gamma2 の発生レベルへの応答で亢進です。2 つの異なる病原体による感染症研究の IFN-γ シグナル伝達は若い胚における細菌感染に対する抵抗性が必要で、IFN-γ のレベルが堅く調整される必要があることを表示: IFN-γ のレベルを上げる魚の胚細菌感染に対する感受性を高めます。大腸菌の高用量で注入された胚が日以内に、細菌をオフにすることあり、γ-インターフェロンがこの防衛反応のために必要です。エルニシア、低用量で致命的である天然の魚病原体に対する防護レスポンスも IFN-γ が必要です。標的遺伝子の誘導と同様に、2 つのインターフェロンを少なくとも部分的冗長的行動します。以前に実証されたタイプ III インターフェロン応答と共にこれら結果哺乳類のウイルスや細菌のインターフェロン依存防衛機能のカウンター パートは、ゼブラフィッシュ胚内の場所で、そのゼブラフィッシュ IFN gamma1 を示唆し、IFN gamma2 は哺乳類の IFN-γ を機能的に同等. します。
ゼブラフィッシュ) インターロイキン 23 アルファ (IL 23α) チェーン、Th17 細胞と炎症の開発に関与のサイトカイン IL 23 の形成に重要なサブユニットの発見。
クローニングと非哺乳類種、シンテニーのアプローチを使用して発見された、ゼブラフィッシュ), 内初めてのインターロイキン (IL)-23 p19 サブユニットのシーケンシングを報告します。IL 23 p19 サブユニットもあったためまた、アミノ酸配列されたゲノム ハリヨからは、ふぐとミドリフグを予測、この検討に含まれて。ゼブラフィッシュ IL 23 p19 cDNA 66bp 5' UTR、249bp 3' UTR と予測された 188 aa IL 23 p19 分子を与える単一の開いたリーディング ・ フレームの 567bp の構成です。ゼブラフィッシュ IL 23 p19 他既知の IL 23 p19 および 4 つの予測の α らせん、システインがジスルフィド結合形成の重要な受容体との対話を知られるトリプトファンの保全の存在などのアミノ酸保全の IL 12 p35 アミノ酸シーケンス明らかに領域を持つ複数の配置です。アミノ酸の相同性と系統解析魚 IL 23 p19 サブユニットの哺乳類の同族体との関係を確認しました。IL 23 p19 サブユニット ミニシンポジウム魚 4 エクソンとは人間およびマウス IL 23 p19 とシンテニーの限られた程度の IL 23 p19 遺伝子のみ PAB に依存したポリ (A) を含む地域の有機体の間で発見された 3 のイントロンと同様にあった-特定のリボヌクレアーゼ サブユニット 2 (PAN2) と IL-23 p19 ひと染色体 12 とすべて魚ゲノムを見たで同じ順序で発見します。リアルタイム PCR を使用して最後に、IL 12 p40 および IL 23 p19 の発現、腎臓、肝臓、腸、筋 IL 12 p40 式 IL 23 p19 よりも高いとみられた.LPS, 刺激は後 1 時間としてすぐに IL 23 p19 ゼブラフィッシュ白血球の増加と il-1, IL 12 p40 の増加があったし、IL-23 p19 式 1 または 6 日間 Mycobaterium marinum ひずみ E11 ゼブラフィッシュの感染後に見つかりませんでした。
抗酸菌遺伝子肉芽腫形成の開始に関与するゼブラフィッシュ胚スクリーニングでは新たに同定された ESX 1 コンポーネントを明らかにします。
結核 (TB) の認刻極印に囲まれて、感染させた大食細胞によって追加大食細胞, 好中球およびリンパ球のクラスターでは肉芽の形成であります。それくらい、肉芽腫がホストに有益であることと考えられているが、証拠の抗酸菌はまたこれらの構造の形成を促進することです。本研究では, 肉芽腫形成の初期段階で関与する新しい抗酸菌要因を識別することを目的しました。肉芽腫形成の開始を勉強するゼブラフィッシュ胚結核菌 marinum 感染モデルを悪用し、肉芽腫形成を効率的に誘導することができませんでしたランダム M. marinum 変異を選択するには、in vivo でスクリーンを開発しました。200 変異体のスクリーニングに繰り返して開始 3 つの変異体は肉芽腫形成を削減しました。1 つの変異体の ESX 1 クラスター内に位置しています espL 遺伝子は、欠陥があることがわかった。ESX 1 クラスター マイコバクテリウム bovis BCG ワクチン株で破壊され、肉芽腫形成と病原性のために重要であると知られている特殊な分泌システムをエンコードします。EspL 前にタンパク質の分泌に関与していないが、我々 ESX 1 基板イースト オテル 6 と EspE の分泌に強い影響を観察しました。私たちゼブラフィッシュ胚 M. marinum 画面肉芽腫形成の初期段階で関与するマイコ バクテリアの遺伝子を識別する便利なツールであり、ESX 1 分泌システムの新しいコンポーネントを識別していることを締結します。我々 は、我々 のアプローチは、抗酸菌病原性の知識に貢献するための新しい結核ワクチンの開発に役立つことができると確信しています。
さらに関与する Lipooligosaccharides での Caryophyllose 部位の結核菌 Marinum から糖転移酵素の同定
結核菌 marinum MMAR2333 の削除 lipooligosaccharides （損失） の 4 つのサブクラスの 3 つの損失をもたらした.変異体は中間を拡張することができませんでした （ロサンゼルス-II ※) caryophyllose の添加による。これらのデータと予測されたドメイン構造 MMAR2333 糖転移酵素の脂質リンク caryophyllose ドナーの世代の関与が示唆されました。
ESX 5 欠損結核菌 Marinum 的大人のゼブラフィッシュでです。
ESX 5 抗酸菌タイプ VII タンパク質分泌輸送を担当のシステム多数の PE と PPE タンパク質です。それは、ホスト細胞死の誘導と変調の in vitro でのサイトカイン応答に関与しています。この作業では、結核菌 marinum を用いた胎児および成体のゼブラフィッシュの ESX 5 の効果を勉強しました。我々 は、ESX 5 欠損 M. marinum ゼブラフィッシュ胚で若干減衰されたことを発見しました。驚いたことに、同じ変異増加高病原性アダルト ゼブラフィッシュで示した細菌負荷の増大と肉芽腫形成の早期発症えそセンターの急速な発展によって特徴づけられます。この早発性肉芽腫形成のプロ炎症性サイトカインと組織のリモデリング ESX 5 突然変異により感染ゼブラフィッシュにおける遺伝子の発現を伴っていた。ぼろ 1 欠損ゼブラフィッシュを用いた実験は、ESX 5 変異の増加の病原性は適応免疫システムに依存ではなかった示した。野生型および変異バクテリア ESX 5 との混合感染実験後者アダルト ゼブラフィッシュと outcompeted 野生型細菌の特定の利点を持っていたことを示した。一緒に我々 の実験は、ESX 5 を介するタンパク質の分泌 M. marinum による中等度と持続感染の確立に使用を示します。
