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Articles by Barbara Leuchs in JoVE
JoVE Immunology and Infection
アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産
1Tumour Virology Division F010, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Inserm Unit 701, German Cancer Research Center (DKFZ)
ここでは、使用中の他のプロトコルに比べて100倍以上の組換えパルボウイルスの生産効率を向上させる細胞の感染に基づいて、プロトコルを記述します。このプロトコルは、パルボウイルスのVP転写ユニット（AD-VP）を含む新規のアデノウイルス5ベースのヘルパーの使用に依存しています。
Other articles by Barbara Leuchs on PubMed
アデノ随伴ウイルスベクターの標的転写と达によって改善心臓遺伝子の転送
組換えアデノ随伴ウイルス2（AAV-2）に基づくベクターは、心臓の遺伝子導入のための有望なツールです。しかし、潜在的な治療への応用は、AAV-2ベクターが全身循環に入ると肝臓の主な伝達を考慮する必要があります。そこで我々は標的転写と細胞表面を組み合わせることにより、心臓ベクトル配信の効率と特異性を高めることを目的とした。
ヒトパピ ローマ ウイルスに対する組換えアデノ随伴ウイルス 5 型と鼻腔内接種 16 L1 を入力します。
アデノ随伴ウイルス (AAV) が開発・遺伝子治療臨床試験だけでなく、多くの臨床研究で遺伝子組換えのベクトルとして評価します。ただし、いくつかアプローチだけワクチン抗原を配信するのに組換え AAV (rAAV) を使用しています。我々 は主要カプシド蛋白 L1 をエンコード、rAAV 生成 (L1h) からひと乳頭腫ウイルス 16 (HPV16) 入力世界の女性の子宮頸がんの主要な原因である HPV16 感染症に対する予防ワクチンの開発を目指します。L1h 鼻腔内投与した rAAV5 の単回投与は高価 L1 固有血清抗体として膣洗浄における粘膜の抗体を誘発するのに十分だった。セロコン バージョンは少なくとも 1 年間維持されました。さらに、細胞性免疫能 60 週間予防接種後に依然として検出されました。さらに、rAAV5 L1h を正常に凍結乾燥マウスの全身および粘膜免疫応答を誘発。これらのデータは明確に組換え rAAV5L1h ベクトルの補助を必要とせずに基づく HPV16 単回投与鼻腔内接種の有効性を示します。
腫瘍溶解性マウス自律パルボ ウイルス、候補ベクトル グリオーマの遺伝子治療が正常および免疫マウス グリア細胞に無害です。
脳腫瘍細胞に野生型または組換えパルボ ウイルス H1 PV と MVMp の感度星膠腫遺伝子療法のための候補者の有望なこれらのエージェントになります。このアプリケーションでは、パルボ ウイルスかどうか劇物発揮またはバイスタンダー効果腫瘍周囲正常のグリア細胞上の質問を発生させます。Balb/c、C57BL/6、VM/Dk 菌株培養細胞を使用してこの問題マウス モデルを検討しました。アストロ サイトとミクログリア文化の大きい割合 MVMp 取り込みの主務いた。感染症は、しかし、レプリケーション関連ウイルスのタンパク質合成アストロ サイトの 10 ％ 未満で起こったし、子孫ウイルス粒子が生産されたない失敗に終わっただった。この制限はさらにもっとミクログリアの宣告されたどのウイルス蛋白質の表現検出されなかったで、VM/Dk 由来細胞分画の保存します。感染 MVMp とグリア細胞の生存に重大な影響はなかったし、その免疫の可能性を妨害しなかった。確かに、どちらも、リポポリサッカライド (LPS)/インターフェロン （IFN-γ）-VM/Dk 派生ミクログリアに向かってマウス (MT539MG) の神経膠腫細胞株の細胞毒性誘発も腫瘍壊死因子アルファ生産 LPS 刺激または LPS/IFN-γ 刺激時のグリア細胞容量 MVMp 感染による影響を受けた。また、刺激能は LPS および IFN-γ とウイルス複製と細胞傷害性タンパク質 NS1 の減少の式で起因しました。一緒に、我々 のデータは、グリオーマ治療の自律パルボ ウイルスの対価にクレジットを与えて自然ホストで通常のグリア細胞の大部分はありません MVMp レプリケーションを主務とこれらの細胞のごく一部で開催中止になる感染を彼らの生存と免疫、阻害するが失敗することを示します。
アデノ随伴ウイルス 2 型キャプシドの外在 VP1/VP2 人身売買ドメインは細胞質を通して通過する前に生成され、核で Uncoating が発生するまで維持されます。
パルボ ウイルス キャプシドの共通機能ビリオン シェルをトラバース、対称軸対称で毛穴の開きです。限られた熱治療時に体外毛穴ホスホリパーゼ魔方陣の触媒ドメインなどの感染症関連の機能ドメインを抱く VP1/VP2 蛋白質 N 末端シーケンスを外部化するポータルとして機能できます。ここで型アデノ随伴ウイルス 2 (AAV2) が、その VP1/VP2 N テルミニの感染は、おそらくエンドソーム コンパートメントの中に in vivo で公開することを示します。この構造変化は、lysosomotropic 試薬による治療の影響を受けます。インキュベーション バフィロマイシン A1 と細胞の露出 VP1/VP2 N テルミニの減少が、インキュベーション クロロキンを外部化一過性刺激。N 末端にある塩基性アミノ酸クラスター核ローカリゼーション活動はまたこのプロセスにさらされるとなるし、細胞質に入るときにウイルス キャプシドにアクセス可能です。これは義務の手順 AAV2 感染症です。ただし、これらのシーケンスでウイルスのカプシドの核移行の直接的な役割野生型または変異ウイルスのマイクロインジェクションによって特定できませんでした。これはキャプシドの更なる変更をウイルス核のエントリを準備する precytoplasmic エントリのステップで行われるが提案しました。いくつかのキャプシド特異抗体は細胞核へのマイクロインジェクション AAV2 感染症は完全に、AAV2 カプシド感染ゲノム核にもたらすとの結論をサポートするブロック。
パルボ ウイルスの Oncosuppressive の能力を改善するために CpG のモチーフと武装させます。
腫瘍溶解性ウイルスはがん治療の新規ツールを表します。癌細胞 (ある) を具体的に殺すこと以外に、これらのエージェントも危険信号腫瘍ウイルス感染を排除する免疫システムを求める提供します。腫瘍溶解性イベントの結果としては, 自然免疫と適応免疫システム クロスプライミングとワクチン接種効果が生じる腫瘍抗原にアクセスできます。ここで目的は腫瘍溶解性パルボ ウイルス （H 1pv-one パワフル) の 1 本鎖ゲノムに免疫活性化 CpG モチーフを組み込むことによってこの補助容量を高めることができるかどうかを見ていた。我々 は 2 の CpG 濃縮 H 1pv-one パワフル亜種 (JabCG1 および JabCG2) リバース エンジニア リングのレプリケーション能力と親のウイルスの増殖型機能を維持し。その増加の CpG のコンテンツに合わせて JabCG1 および JabCG2 のゲノムは TLR 9 を介したシグナリング野生型 H 1pv-one パワフル DNA よりもより強力なトリガーする体外証明しました。抗腫瘍活性を評価したラット モデル MH3924A 肝癌肺転移, 保護者または変更ウイルス感染提供元としての in vivo アジュバント ワクチンは皮下投与自家細胞に。直接腫瘍溶解性に及ぼす転移を除く、このセットアップでは、JabCG2 ベクトル マーカーの細胞性免疫 (IFN γ) と (CD80, CD86） 樹状細胞の活性化を誘導する、強化された免疫原性 (腫瘍ドレイン) 縦隔のリンパ節に表示。これは、他の予防接種スケジュール (H - 1pv-one パワフル、JabCG1、JabGC またはモック処理細胞) と比較して大幅に削減の転移率 (50%) につながった。データ内腫瘍溶解性ウイルス免疫活性化 CpG モチーフの数を増やす抗ワクチン接種を誘導することによって彼らの全体的な抗癌剤の効果を改善することができます原則の証拠を提供します。
P53 欠損肝癌細胞におけるパルボ ウイルス H 1 および化学療法剤の殺害前骨髄球性白血病タンパク質が必要です。
相乗的ターゲティングとひと肝細胞の殺害を評価するには、癌 (HCC) 欠けて p53 腫瘍溶解性自律パルボ ウイルス （PV） H 1 と化学療法剤とその機能性前骨髄球性白血病タンパク質 (PML) 依存によって細胞します。
膵癌腫瘍溶解性パルボ ウイルス H 1pv-one パワフルによるゲムシタビン療法の改善。
膵癌は予後不良な消化器悪性腫瘍です。この最新のがんに対する化学療法の治療とゲムシタビン、最も強力な治癒ではないと抵抗が表示ことがあります。ラット パルボ ウイルス感染ですがヒトの非病原性は、H-1pv-one パワフルなどの腫瘍溶解性ウイルスと相補的な治療は、革新的なオプションとして現れます。
予防及び治療に対するひと乳頭腫ウイルス タイプ-16 異なるアデノ随伴ウイルス血清型ベクトルを用いた鼻腔内の予防接種を組み合わせます。
子宮頸がんは、世界中の女性の間で 2 番目の最も頻度の高い癌であるし、ハイリスクの乳頭腫ウイルス感染によって引き起こされると考えられています。組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) ベクトルを用いた遺伝的予防接種は、(HPV) 感染症ヒトパピ ローマ ウイルス ワクチン接種の偉大な約束を示しています。
パルボ ウイルス H1 は選択的にひと神経芽腫細胞に対する細胞毒性を誘導します。
マルチ モーダルの治療概念にもかかわらず、高度なローカライズされたとハイリスク神経芽細胞腫長期生存率 50 ％ 以下の治療上の挑戦のままです。その結果、新しいモダリティ腫瘍溶解性 virotherapy 例えば、神経芽細胞腫の治療のために緊急に必要です。H 1pv-one パワフル齧歯類のパルボ ウイルス感染した大人の動物における関連する病原性効果を欠いているです。対照的に、ウイルスは増殖型プロパティを持つ、特にひと由来の細胞を含む様々 な種の変換済みまたは腫瘍由来細胞に対して細胞毒性です。ここでは、増殖型 H 1pv-one パワフル治療神経芽細胞のためのアプリケーションの前臨床 in vitro 評価を行った。感染効率、ウイルス複製および H 1pv-one パワフル溶菌活性異なる MYCN ステータス 11 神経芽細胞腫細胞株における分析を行いました。Oncoselectivity ウイルスの短期的な文化の異なる起源の非悪性乳児細胞の感染によって確認されました。H-1pv-one パワフル生存率に及ぼす影響や、細胞の形態これらトランス フォームされない細胞では認められなかった。対照的に、0.001 10 pfu/セル間でアンゴルを検討すべての神経芽細胞腫細胞株における溶菌感染が誘導されました。H-1pv-one パワフル積極的に最大 5,000-fold 感染後 48 96 時間以内を増やすウイルス価をレプリケートします。H 1pv-one パワフルの溶解効果 MYCN 遺伝子増幅や分化状態の独立を認めた.また、重要な G2 逮捕とアポトーシスの誘導がみとめられました。感染効率、急速なウイルスの複製と神経芽細胞腫細胞 H 1pv-one パワフルの低毒性のトランス フォームされないセルと一緒に徹底的な溶解効果レンダリングこのパルボ ウイルスは神経芽細胞腫の腫瘍溶解性 virotherapy の有望な候補。
組換えアデノ随伴ウイルスの解析 2 参照標準材料を入力します。
組換えのアデノ随伴ウイルス血清型標準物質 (rAAV2 RSM) プロデュース ・参照標準粒子価、ベクトル ゲノム価および感染力価の AAV2 遺伝子の転送ベクトルを提供する目的が特徴の 2 参照。生産と精製参考資料のヘルパー ウイルス無料過渡トランスフェクションとクロマトグラフィー精製が実施されました。浄化されたバルク材料だった、vialed 微生物汚染の負確認され、キャラクタリゼーション標準試金のプロトコルとアッセイ用試薬 16 室世界と一緒に配布。統計的変換を使用して、raw データのモデリングを意味価と信頼区間のキャプシド粒子を決定した ({X} 9.18 x 10 粒子/ml; 95% 信頼区間 [CI]、1.05 に 7.89 x 10 x 10 粒子/ml)、ベクターのゲノム ({X} 3.28 x 10¹⁰ ベクトル ゲノム/ml; 95 %ci、2.70 x 10¹⁰ 4.75 x 10¹⁰ にベクター ゲノム/ml)、単位 ({x} を伝達、10⁸ 変換ユニット/ml x 5.09;95 %Ci、2.00 x 10⁸ 9.60 x 10⁸ ユニット/ml を伝達する）、および感染ユニット ({X} 4.37 x 10⁹ TCID₅₀ IU/ml; 95 %ci、2.06 x 10⁹ 9.26 x 10⁹ TCID₅₀ に IU/ml)。さらなる分析参考資料として AAV2 と病タンパク質として 94% 以上の相対的な純度の身元を確認。定量的データに 1 つの明白な傾向にもかかわらず、比較的タイトな相関機関内のアッセイの結果のそれぞれの試金のための機関との間の変化の程度だった。詳しいプロトコルおよび一般的な試薬を提供することにより、試金を標準化する試みが行われたにもかかわらず、この技能試験の精度と確度の相対的貧困度は明らかだった。これは、研究所間の変動がそのような徹底的に記載されている最初の時間と調査結果のフィールド必要性の普遍的な基準を強調します。RAAV2 RSM はアメリカンタイプ カルチャー コレクションに預託されている、研究室に固有の内部価基準をキャリブレーションする科学のコミュニティに利用可能です。RAAV2 RSM の予期される使用方法を説明します。
HLA トランスジェニック マウス、組換えアデノ ウイルス抗原ペプチド ライブラリの組み合わせによるひと腫瘍抗原の Cd4 陽性 T 細胞エピトープのスクリーニング
腫瘍抗原特異的 cd4 陽性 T 細胞が悪性黒色腫患者の強い治療抗腫瘍反応調停できるよう我々 腫瘍固有の cd4 陽性 T 細胞エピトープ検出、分離、および患者の腫瘍反応性 T 細胞の拡大に適しての同定のための包括的なスクリーニング戦略の確立に着手します。
AAV9 ベクトルの保護のための IL-10 とビル 7 MCP-1 の遺伝子導入マウス自己免疫性心筋炎からの比較。
炎症のサイトで具体的に潜在的な病気を制限することの効果と治療用遺伝子の過剰発現は主要な臨床的課題のままです。本研究では, アデノ随伴ウイルス (AAV)-9 の潜在性を調査する-抗炎症メディエーター インターロイキン (IL)-10 の発現とドミナント ネガティブ阻害剤単球化学誘因物質蛋白質-1 (MCP1 ビル 7) 自己免疫性心筋炎の予防上の仲介します。
神経膠腫シンイ パルボ ウイルス H 1 によるラット モデル内の回帰。
以前の研究では、我々 弱毒ラット パルボ ウイルス H-1 (H 1pv-one パワフル) が、ウイルスの腫瘍 （頭蓋） 注入すると高度な症候性ラットとひと神経膠腫ラット モデルの回帰を誘導する能力があることを示しているまたは静脈内。H 1pv-one パワフルと感染症は、任意の nontumor 組織病理を引き起こさなかった。またこの腫瘍溶解性ウイルス シンイ適切かつ十分なこの動物モデルの神経膠腫を治療するためかどうかこの研究を問います。
心臓 AAV9 S100A1 遺伝子治療臨床大動物モデルにおける虚血後心不全を救助します。
臨床応用のための前提条件として、我々 は長期的な治療の効果と安全性アデノ随伴ウイルス (AAV) の決定-S100A1 遺伝子治療心不全の臨床大動物モデルで。S100A1、正の変力作用レギュレータ心筋収縮性心筋細胞、人間と動物での失敗で枯渇になるし、筋小胞体カルシウム (Ca(2+)) 急性と慢性的な小動物モデルにおける心の失敗で処理します。 復元する心臓の収縮機能心筋ターゲット S100A1 遺伝子導入を救助心筋梗塞に伴う左回旋枝冠動脈のバルーン閉塞による心不全国内豚の誘導されます。とき豚は重要な左心室収縮機能障害を表示、2 週間後に、我々、逆行性の冠静脈配信によって AAV 血清型 9 (AAV9) 投与-S100A1 左心室、非梗塞群の心筋に。AAV9 ホタルルシフェラーゼと生理食塩水治療コントロールとして務めた。14 週で両方のコントロールのグループは、有意な減少の心筋 S100A1 の蛋白質の表現とともに心機能の進歩的な低下を示したし、左心室リモデリングします。AAV9 S100A1 治療防止、心臓 S100A1 蛋白質のレベルを復元することによってこれらの構造と機能の変更を逆転しました。S100A1 トリートメント処理、心筋細胞カルシウム サイクリング, 筋小胞体カルシウムおよびエネルギー恒常性正規化。導入遺伝子発現が心臓の組織を制限され、心外臓器機能が妥協だった。このトランスレーショナル研究長期治療の有効性の前臨床の可能性と良好な安全性プロファイルを心臓 AAV9 S100A1 遺伝子治療心不全の臨床モデルで示しています。我々 の結果 S100A1 潜在的終末期心不全を治療するために現在の戦略を補完することが人間の心臓障害の遺伝子治療の臨床試験の強力な理論的根拠を提示します。
インターフェロン γ 腫瘍溶解性膵癌における癌性腹膜炎の治療のため H 1pv-one パワフル パルボ ウイルスの予防接種の可能性を向上させます。
具体的に複製し、腫瘍細胞を殺す能力を腫瘍溶解性ウイルスは癌治療の新しいクラスとして浮上しました。ラット腫瘍溶解性パルボ ウイルス （H 1pv-one パワフル) 前臨床設定で異なったタイプの癌を治療するために使用され、最近正常ラットの膵管癌 （PDAC） の治療の標準ゲムシタビン療法と結合されました。私たちの前の仕事は免疫システムとインターフェロン-γ (肝腎） のリリースでは特に H 1pv-one パワフル モデルで抗腫瘍効果を仲介するように見えることを示した。したがって、我々 は H 1pv-one パワフルのプロパティ治療は肝腎と PDAC の不治後期よう癌性腹膜炎の治療のために上げることができますと推論しました。同所性同種膵癌腹膜転移を有する単一腫瘍 (i.t.) または 5 x 10⁸ プラーク形成ユニット H 1pv-one パワフルの併用肝腎アプリケーションの有無の腹腔注入治療された軸受ラットを設立しました。腫瘍内注入主膵腫瘍ウイルスの移行によってプライマリから預金の転移伴う癌性腹膜炎の成長を制御するで腹腔内のルートよりもより効果的なことが分かった。RecIFNγ と併用 i. p. 治療 H 1pv-one パワフルの i. p. H-1pv-one パワフル単独治療と比較して、拡張の動物の生存を降伏治療効果の改善の結果。肝腎アプリケーション H 1pv-one パワフル誘発腹腔マクロファージおよび脾細胞応答腫瘍細胞に対する腹水の H1 PV 中和の抗体価の大幅な削減を起こしながら強化。したがって、肝腎 co-application H 1pv-one パワフルとともに PDAC 癌性腹膜炎患者の生存を改善するために新規の治療オプションとして考えられるかもしれません。
化学療法またはターゲット エージェントによる人間の免疫システムの活性化、腫瘍溶解性パルボ ウイルス H 1 結合。
パルボ ウイルス H-1 (H 1pv-one パワフル） に感染し、悪性黒色腫、肝癌、胃、大腸、子宮頸部、膵臓癌を含むひと腫瘍細胞を溶かします。我々 は、化学療法のエージェントまたは標的薬の有益な効果は H 1pv-one パワフルの腫瘍溶解性および immunostimmulatory プロパティを組み合わせることができるかどうか評価します。
ウイルスキャプシドの遺伝子工学によって癌細胞にH-1PVラットパルボウイルスのターゲット変更
ラットパルボウイルスH-1PVそのoncosuppressiveプロパティを与えられた有望な抗がん剤やヒトの既知の副作用のないことである。 H-1PVは、形質転換細胞に優先的に複製されますが、ウイルスは、通常、がん細胞の両方を入力することができます。正常細胞への取り込みは、離れて腫瘍標的から投与ウイルス量のかなりの部分を隔離。したがって、腫瘍細胞に特異的にH-1PVエントリをターゲットとするパルボウイルスベースの治療の有効性を増加させることが重要である。本研究では、まず、シアル酸は、H-1PVのエントリで重要な役割を果たしていることがわかった。我々は、遺伝的にヒト腫瘍細胞に対する親和性を向上させるためにH-1PVのカプシドを設計した。マウスの密接に関連したパルボウイルスの分のウイルスの解決の結晶構造から類推して、我々は、H-1PV野生型カプシドのin silicoで3次元（3D）モデルを開発しました。このモデルに基づいて、我々は、いわゆるディンプル領域内で、カプシドの対称性の2倍の軸のレベルで細胞膜の認識やウイルスの侵入に関与する推定アミノ酸を同定した。これらの残基のin situ突然変異生成が大幅に寛容な細胞にH-1PVの結合とエントリを減少させた。次に、エントリ欠損ウイルスキャプシドを設計し、その3倍の軸スパイクのレベルで、環状RGD-4Cペプチドを挿入します。このペプチドは、癌細胞と成長して血管内に過剰発現しているα（v）のβ（3）とα（v）のβ（5）インテグリンを、バインドされます。ペプチドの挿入は、再設計、ウイルスによってこれらの細胞の効率的な殺害、その結果、細胞が過剰発現しているα（v）のβ（5）インテグリンに向かってウイルス感染を救助した。この作品は、H-1PVが遺伝的に癌治療におけるこのウイルスの効率的な使用のために偉大な約束を示し、そのカプシドの変更によってターゲットを変更することができることを示しています。
アカゲザルにおける人間の乳頭腫ウイルス タイプ 16 の鼻腔内接種 AAV5 と 9 のベクトル。
抽象子宮頸がんは、世界の女性で 2 番目に多いがんです。このタイプの癌の開発のための使役事象として永続的なハイリスクひと乳頭腫ウイルス (HPV) 感染が発見されました。組換えアデノ随伴ウイルス (rAAVs) は、現在、開発、評価としてのワクチン ベクトルされて。以前の仕事、鼻腔内投与マウスにおける rAAVs 高価誘発し、長期的な HPV に対する中和抗体は 16 (HPV16) 入力を示した。多くの人間関連種へのこのアプローチを拡張するには、我々 rAAV5 と 9 ベクトルは鼻腔内の予防的雰囲気の中を用いた HPV16 L1 蛋白質を表現する通気でアカゲザル （マカク) を免疫しました。RAAV9 L1 とブーストが続きます rAAV5 L1 ベクトル L1 固有血中抗体単一 rAAV5 L1 予防接種よりも高価を誘導しました。AAV9 によって誘発される L1 特異抗体は中和 HPV16 型ベクトルし、予防接種に少なくとも 7 ヶ月間投稿が永続化します。興味深いことに、鼻のアプリケーション rAAV9 の存在下における reimmunization 遺伝子発現の予防せず同じ血清型でことができますも高 AAV9 抗体、免疫原性だった。彼らは寛容で、HPV16 ウイルス様粒子ワクチンの筋肉内接種後抗体の両方としてではないものの 6 動物の 2 つ AAV を介した鼻腔内接種には応答しませんでした。これらのデータは明確にアジュバントを必要とせず rAAV9 L1 ベクトルを使用して、鼻腔内接種の有効性を示します。我々 は我々 の結果から rAAV9 ベクトル非侵襲的鼻ワクチン戦略が有望な候補です締結します。
