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Articles by Brenda L.K. Coles in JoVE
JoVE General
Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse
Molecular Genetics, University of Toronto
In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.
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Facile Isolamento E Caratterizzazione Di Cellule Staminali Della Retina
Questo studio identifica e caratterizza le cellule staminali della retina (RSCs) in anticipo postnatale agli occhi umani settimo decennio. Diverse subregioni di occhi umani erano dissociati e coltivate usando un dosaggio di sfera-formando clonale. Le cellule staminali sono state derivate solo della pars plicata pars plana del margine ciliare della retina, con una frequenza di circa 1:500. Per verificare a lungo termine di auto-rinnovamento, sia il dosaggio di sfera e monostrato seminando sono stati utilizzati. Utilizzando la sfera singola seminando dosaggio, primarie sfere sono state dissociate e ricoperto, e individuo sfere dimostrata 100% auto-rinnovamento, con sfere singole dando origine a una o più nuove sfere in ogni passaggio successivo. Le sfere della retina clonale erano placcate in condizioni di differenziazione per analizzare il potenziale di differenziazione della loro progenie. Le sfere sono state prodotte tutte le diversa della retina cellule tipi, dimostrando multipotentiality. Pertanto, l'occhio umano contiene una piccola popolazione di cellule (approssimativamente uguale a 10.000 cellule per occhio) che hanno caratteristiche di cellule staminali retiniche (proliferazione, auto-rinnovamento e multipotentiality). Per testare il potenziale in vivo delle cellule staminali e loro progenie, abbiamo trapiantato le cellule dissociate sfera della retina umana, contenente sia le cellule staminali e progenitori, gli occhi dei topi NOD/SCID 1 giorno postnatale e occhi pulcino embrionale. La progenie della RSCs sono stati in grado di sopravvivere, migrano, integrare e differenziare in retina neurale, soprattutto come fotorecettori. Loro facile isolamento, integrazione e differenziazione suggeriscono che RSCs umano alla fine potrebbero essere utili nel trattamento di malattie della retina umane.
Perdita Di Cellule Progenitrici Della Retina Provoca Un Aumento Della Popolazione Di Cellule Staminali Retiniche in Vivo
Le cellule staminali della retina [con il potenziale per produrre o progenitori della retina neurale o progenitori (RPE) epiteliali pigmentato retinico] esiste nell'occhio dei mammiferi per tutta la vita, e infatti il più grande incremento assoluto della popolazione di staminali si verifica dopo la nascita. Le cellule staminali proliferare embryonically e quindi può aiutare a costruire la retina inizialmente, ma nei mammiferi postnatale chiaramente non proliferano per rigenerare la retina in risposta alla lesione. Usando i mouse Chx10(orJ/orJ) e Mitf(mi/mi), con fenotipi occhio piccolo a causa della riduzione del progenitore della retina neurale popolazione e la retina pigmentata popolazione progenitrici epiteliali, rispettivamente, riportiamo ora che la popolazione di cellule staminali della retina, quando analizzati dal margine ciliare, aumenta di 3-8 volte in entrambi mutanti. Questi risultati suggeriscono che la popolazione delle cellule staminali della retina dei mammiferi può essere in grado di rispondere ai segnali geneticamente indotte da popolazioni progenitore.
La Proliferazione E L'espansione Di Cellule Staminali Retiniche Richiedono Pax6 Funzionale
Cellule staminali della retina (RSCs) esiste come rare cellule epiteliali pigmentate ciliare negli occhi dei mammiferi adulti. Abbiamo ipotizzato che RSCs sono al top del lignaggio delle cellule retiniche. Così, geni espressi precocemente nello sviluppo embrionale per stabilire il campo retinico nel proencefalo neuroectoderma possono giocano un ruolo importante nella RSCs. Pax6, un dominio paired e contenenti homeodomain fattore di trascrizione, è uno dei primi geni espressi nel campo degli occhi ed è considerato un gene di controllo master per lo sviluppo della retina e l'occhio. Qui, ci dimostrano che Pax6 è arricchita in RSCs. inattivazione di Pax6 in vivo si traduce in perdita di RSCs competenti come dosati dal fallimento a formare sfere RSC clonale dalle vescicole ottiche degli embrioni di knockout Pax6 convenzionali e dalle cellule epiteliali ciliare di topi knockout condizionale di Pax6 adulti. In vitro inattivazione clonale di Pax6 nella RSCs adulto si traduce in un difetto grave proliferazione, suggerendo che Pax6 è necessaria per la proliferazione e l'espansione di RSCs.
Margine Ciliare Transdifferenziazione Dalla Retina Neurale è Controllata Da Segnalazione Wnt Canonico
Gli strati epiteliali del corpo ciliare (CB) e iris sono strutture non-neurali che differenziano dalla regione anteriore dell'oculare, il margine ciliare (CM). Mostriamo qui tale attivazione del Wnt canonico signaling pathway è sufficiente e necessario per il normale sviluppo delle strutture occhio anteriore. Attivazione farmacologiche di beta-catenina segnalazione con litio (trattamento Li(+)) in retiniche espianti in vitro indotto l'espressione ectopica della neurogenesi marcatori Otx1 e Msx1. Cre-mediata stabilizzazione della beta-catenina espressione nella retina periferica in vivo indotta da una cellula autonoma sovraregolazione di marcatori CM a scapito dei marcatori di retina neurale (NR) e inibito CM. Coerente con una conversione autonoma cell fates occhio periferico, l'indice di proliferazione nella regione della retina che espresso stabilizzato beta-catenina era identico a quello del selvaggio-tipo CM e c'era un'espansione del CB-come le strutture nelle fasi successive. Al contrario, Cre-mediata inattivazione della beta-catenina ridotta espressione marcatore CM così come le dimensioni di CM e CB/iris. Aberrante sviluppo CB in entrambi i modelli del mouse era anche associato con una riduzione del numero di cellule staminali retiniche in vitro. In sintesi, attivazione di segnalazione Wnt canonico è sufficiente per promuovere lo sviluppo di destini periferici oculare a scapito della NR ed è anche necessaria per il normale sviluppo delle strutture oculare anteriore.
Massimizzando La Differenziazione Funzionale Fotorecettore Da Cellule Staminali Adulte Della Retina Umane
Cellule staminali della retina (RSCs) sono presenti nel margine ciliare dell'occhio umano adulto e possono dare origine a tutti i tipi di cellule della retina. Qui vi mostriamo che modulazione della trascrizione retinica fattore gene expression in human RSCs arricchisce notevolmente progenie di fotorecettori, e che forte arricchimento è stato ottenuto con la trasduzione combinata di OTX2 e CRX insieme con la modulazione di CHX10. Quando queste progenie RSC umani geneticamente modificati vengono trapiantate negli occhi del mouse, loro integrazione della retina e la differenziazione è superiore alla progenie RSC non modificato. Inoltre, prove elettrofisiologiche e comportamentali mostrano che queste cellule trapiantate promuovano il recupero funzionale in transducina topi mutanti. Questo studio suggerisce che modulazione genica in RSCs umano può fornire una fonte di cellule fotorecettrici per il trattamento della malattia di fotorecettori.
