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- Drosophile larvaire JNM Dissection
- Drosophile larvaire JNM immunohistochimie
- Méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile
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Articles by Brian D. McCabe in JoVE
JoVE General
Drosophile larvaire JNM Dissection
Ce protocole démontre comment disséquer
JoVE General
Drosophile larvaire JNM immunohistochimie
Ce protocole montre comment effectuer la larve de drosophile immunohistochimie sur disséqués.
JoVE General
Méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile
Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.
Other articles by Brian D. McCabe on PubMed
Wishful Thinking Encode Une BMP De Type II Receptor Qui Régule La Croissance Synaptique Chez La Drosophile
Nous avons effectué un écran de grande envergure pour les mutants de drosophile qui présentent des anomalies structurelles de la jonction des larves neuromusculaire (JNM). Nous avons récupéré des mutations dans un vœu pieux (d'esprit), un gène qui régule positivement la croissance synaptique. l'esprit code pour un récepteur de BMP de type II. Dans larves savoir mutante, la taille des NMJs est fortement réduite par rapport à la taille des muscles. NMJs wit ont réduit le potentiel de jonction excitateurs évoqués, une diminution des niveaux de la molécule d'adhésion cellulaire synaptique Fasciclin II, et le détachement membrane synaptique au niveau des zones actives. Savoir est exprimé par un sous-ensemble de neurones, y compris motoneurones. Le phénotype JNM est spécifiquement sauvé par l'expression transgénique de Wit seulement dans les motoneurones. Ainsi, Wit semble fonctionner comme un récepteur présynaptique qui régule la taille synaptique au niveau de la jonction neuromusculaire chez la drosophile.
Les Membres De La Synaptobrévine / Vésicules Associé Membrane Protein (VAMP) De La Famille Chez La Drosophile Sont Fonctionnellement Interchangeables in Vivo Pour La Libération De Neurotransmetteurs Et La Viabilité Cellulaire
Synaptobrevins ou jupon sont des vésicules associées protéines membranaires, souvent appelés v-Snares, qui sont importants pour le transport des vésicules et de la fusion à la membrane plasmique. Drosophile possède deux membres caractérisés de cette famille de gènes: synaptobrévine (SYB) et neuronale synaptobrévine (n-SYB). Phénotypes mutants et d'expression génique des modèles indiquent que le n-Syb est exclusivement neuronale et requise uniquement pour la sécrétion de la vésicule synaptique, alors que Syb est omniprésent et, comme indiqué ici, essentiel pour la viabilité des cellules. Lorsque les cellules précurseurs des yeux ont été faites homozygotes pour syb (-), l'œil n'a pas à se développer. En revanche, le n-syb (-) des clones oculaires conçues de manière appropriée, mais pas réussi à activer les neurones en aval. Pour déterminer si les deux protéines sont structurellement spécialisée pour accomplir ces fonctions in vivo distincte, nous avons poussé l 'expression de chaque gène en l' absence de l'autre à regarder pour le sauvetage phénotypique. Nous constatons que l'expression de n-syb au cours du développement des yeux peut sauver la létalité cellulaire des mutations SYB, comme on peut le rat et VAMP2 cellubrevin. Expression de syb pouvez restaurer la transmission synaptique à n-SYB mutants testés à la fois comme par l'électrorétinogramme et des enregistrements de courants jonctionnels excitateurs à la jonction neuromusculaire. Par conséquent, nous constatons que Syb, qui n'est généralement pas impliqués dans la fonction synaptique, peut servir de médiateur Ca (2 +)-a déclenché l'activité synaptique et que pas de spécialisation particulière de la v-SNARE est nécessaire de différencier l'exocytose synaptique à partir d'autres formes.
L'homologue BMP Gbb Fournit Un Signal Rétrograde Qui Régule La Croissance Synaptique à La Jonction Neuromusculaire Chez La Drosophile
Nous montrons que le BMP orthologue Gbb peut signaler par un mécanisme rétrograde pour réguler la croissance de la jonction synaptique chez la drosophile neuromusculaire (JNM). Gbb mutants ont une réduction de la taille NMJ synapse, une diminution de la libération de neurotransmetteurs, et aberrant ultrastructure présynaptique. Ces défauts sont similaires à celles que nous observons chez les mutants des récepteurs BMP et facteurs de transcription Smad. Cependant, alors que ces récepteurs BMP et des composants de signalisation sont obligatoires dans le motoneurone présynaptique, d'expression Gbb est nécessaire en grande partie dans les muscles post-synaptiques; expression gbb dans le muscle sauvetages aspects clés du phénotype mutant gbb. Conformément à cette notion, nous trouvons que le blocage de transport axonal rétrograde par la surexpression de position dominante-négative p150/Glued dans les neurones inhibe la signalisation BMP dans les motoneurones. Ces expériences révèlent que un signal BMP musculaire dérivé rétrograde participe à la coordination du développement synapse neuromusculaire et de la croissance.
Contrôle De La Transmission Synaptique Rétrograde Par CaMKII Postsynaptique à La Jonction Neuromusculaire Chez La Drosophile
Signalisation rétrograde joue un rôle important dans l'homéostasie synaptique, la croissance, et la plasticité. Un signal rétrograde à la jonction neuromusculaire (JNM) de la drosophile contrôle de l'homéostasie de la libération de neurotransmetteurs. Ici, nous montrons que ce signal rétrograde est réglementée par l'activité post-synaptique de Ca2 + / calmoduline-dépendante protéine kinase II (CaMKII). Réduire l'activité CaMKII dans les muscles améliore le rapport signal et augmente la libération de neurotransmetteurs, tandis que l'activation constitutive de la CaMKII dans les muscles inhibe le signal et diminue la libération de neurotransmetteurs. L'inhibition post-synaptique de la CaMKII augmente le nombre de présynaptiques, barres en T vésicules associées à des zones actives. Constamment, nous montrons que les mutants des récepteurs de glutamate ont également un plus grand nombre de barres en T; cette augmentation est supprimée par l'activation postsynaptique de la CaMKII. En outre, nous démontrons que la pensée pré-synaptique des récepteurs BMP pieux est nécessaire pour le signal rétrograde de fonctionner. Nos résultats indiquent que CaMKII joue un rôle clé dans le contrôle rétrograde de l'homéostasie de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de la drosophile.
Highwire Régule Présynaptiques De Signalisation BMP Essentielle à La Croissance Synaptique
Highwire (DID), une ligase putative RING finger E3 ubiquitine, régule négativement la croissance synaptique à la jonction neuromusculaire (JNM) chez la drosophile. mutants ont considérablement hiw plus grande taille synaptique et une augmentation du nombre de boutons synaptiques. Ici, nous montrons que Hiw lie à la protéine Smad Médée (Med). Med fait partie d'une protéine morphogénétique osseuse présynaptique (BMP) cascade de signalisation composé de trois sous-unités des récepteurs, l'esprit, TKV, et Sax, en plus du facteur de transcription Smad Mad. Par rapport à la souche sauvage, les mutants de composants de signalisation BMP ont plus petite taille NMJ, réduit la libération de neurotransmetteurs, et aberrant ultrastructure synaptique. BMP mutants de signalisation de supprimer la croissance excessive synaptique chez les mutants hiw. Activation de la BMP signalisation, qui, dans type sauvage ne pas provoquer une croissance supplémentaire, dans les mutants hiw conduise à l'expansion synaptique en outre. Ces résultats révèlent un équilibre entre la signalisation BMP positifs et négatifs de régulation par HighWire, qui régit la croissance des synapses neuromusculaires.
Tous Les Neuropathies Grande Et Petite
Autosomique dominant pur paraplégie spastique héréditaire (AD-HSP) est caractérisée par la dégénérescence des axones longs dans les secteurs de cortico et des colonnes dorsales, résultant de la spasticité et de la difficulté à marcher. Des mutations dans le gène SPG4 produit spastin sont les lésions prédominantes génétiques associés à cette maladie héréditaire. Dans ce numéro, Orso et al. examiner et concilier existants mutants de drosophile de spastin et de générer un nouveau modèle de HSP par la surexpression d'un transgène mouche spastin qui porte une mutation répandue dans AD-HSP humaine (voir l'article connexe début à la page 3026). L'expression de cette protéine mutante produit spastin pathologie chez les mouches qui rappellent de la maladie humaine, y compris les défauts de locomotion adultes, en plus de causer la morphologie aberrante synaptique et la stabilité des microtubules altérée. Les deux mouvements et les défauts synaptiques des mutants ont été améliorés par la mouche de traitement avec la vinblastine agent de microtubules modifier. Les résultats sont cohérents avec mutations pathogènes chez l'homme spastin producteurs dominants négatifs des protéines et de confirmer l'utilité des techniques génétiques chez la drosophile pour comprendre HSP et d'autres maladies neurodégénératives.
L'échelle Du Génome P-élément D'écran Pour Mutants Synaptogénèse Drosophile
Une compréhension moléculaire de la synaptogenèse est une étape cruciale vers l'objectif de comprendre comment le cerveau se «câbler», puis «recâbler» au cours du développement et de l'expérience. Les récents progrès de la génomique et moléculaire ont permis d'étudier la synaptogenèse à l'échelle génomique. Ici, nous décrivons les résultats d'un écran pour les gènes impliqués dans la formation et le développement de la jonction glutamatergique Drosophila neuromusculaire (JNM). Nous avons examiné 2185 mutants de transposons P-élément représentant insertions dans environ 16% de l'ensemble du génome chez la drosophile. Nous avons d'abord identifié récessifs mutants létaux, basée sur l'hypothèse que les mutations qui causent de graves perturbations dans la synaptogenèse sont susceptibles d'être mortel. Deux cent vingt (10%) de toutes les insertions étaient homozygotes létale. Deux cent cinq (93%) de ces mutants létaux développés au moins jusqu'à la fin de l'embryogenèse et neuromusculature formé. Nous avons examiné NMJs embryonnaires / larvaires dans 202 de ces mutants homozygotes en utilisant la microscopie confocale et immunocytochimie. Nous avons identifié et classé 88 mutants avec NMJ morphologie altérée. Loci d'insertion dans ces mutants coder pour plusieurs types différents de protéines, y compris ATP et GTPases, les régulateurs du cytosquelette, molécules d'adhésion cellulaire, les kinases, les phosphatases, régulateurs d'ARN, des régulateurs de la formation des protéines, des facteurs de transcription, et les transporteurs. Treize pour cent des insertions sont dans les gènes qui codent pour des protéines de fonction inconnue roman ou. Tests de complémentation et RT-PCR suggèrent qu'environ 51% des lignées d'insertion sont porteuses de mutations de fond. Nos résultats révèlent que la synaptogenèse nécessite l'action coordonnée des différents types de protéines - peut-être autant que 44% de la totalité du génome - et que mutagénèses transposons effectuer importantes mises en garde qui doivent être respectés lors de l'interprétation des résultats générés par cette méthode.
Le SLA-protéines Associées FUS Et TDP-43 Fonctionnent Ensemble Pour Affecter Locomotion Drosophile Et Durée De Vie
Le moteur fatale maladie du neurone adulte la sclérose latérale amyotrophique (SLA) partage un certain chevauchement cliniques et pathologiques avec la démence frontotemporale (DFT), un trouble précoce neurodégénérative. Les protéines ARN / ADN de liaison fusionnés dans le sarcome de (FUS; également connu comme TLS) et TAR DNA binding protein-43 (TDP-43) ont été récemment révélées génétiquement et pathologiquement associé à des formes familiales de la SLA et la DFT. Il ne sait pas si la perturbation de ces protéines entraîne la maladie à travers des mécanismes qui sont indépendants de la fonction normale des protéines ou via la perturbation physiopathologique des processus moléculaires dans lesquels ils sont à la fois critique. Ici, nous déclarons que les mutants de drosophile dans laquelle le FUS est homologue de perturbé exposition diminution de la viabilité des adultes, la vitesse locomotrice réduite, et la durée de vie réduite par rapport aux témoins. Ces phénotypes ont été entièrement sauvé par type sauvage FUS de l'homme, mais pas la SLA-associé protéines mutantes du FUS. Un mutant de l'homologue chez la drosophile de TDP-43 étaient similaires, mais plus grave, des déficits. Grâce à croix de sauvetage analyse, nous avons démontré que le FUS ont agi de concert avec et en aval de la protéine TDP-43 dans une voie génétique commune dans les neurones. En outre, on a constaté que ces protéines associées entre elles dans un complexe ARN-dépendante. Nos résultats établissent que la fonction FUS et TDP-43 ainsi que in vivo et suggèrent que les voies moléculaires qui nécessitent des activités combinées de ces deux protéines pourraient être perturbés dans la SLA et la DFT.
