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- Drosophila larval NMJ Disección
- Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica
- Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila
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Articles by Brian D. McCabe in JoVE
JoVE General
Drosophila larval NMJ Disección
Este protocolo muestra cómo diseccionar
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Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica
Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.
JoVE General
Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila
A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.
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Wishful Thinking Codifica Un Receptor De BMP Tipo II Que Regula El Crecimiento De Synaptic En Drosophila
Hemos llevado a cabo una pantalla de gran escala para los mutantes de Drosophila que tienen anomalías estructurales de la unión neuromuscular larvaria (UNM). Se recuperaron las mutaciones en las ilusiones (el ingenio), un gen que regula positivamente el crecimiento sináptico. el ingenio codifica un receptor de BMP tipo II. En larvas ingenio mutante, el tamaño de las NMJs se reduce considerablemente con relación al tamaño de los músculos. NMJs ingenio han reducido los potenciales evocados de unión de excitación, disminución de los niveles de la molécula de adhesión celular sináptica II fasciclin, y el desprendimiento de la membrana sináptica en las zonas activas. El ingenio se expresa en un subconjunto de neuronas, incluidas las neuronas motoras. El fenotipo NMJ está específicamente rescatado por la expresión transgénica de Ingenio sólo en las neuronas motoras. Así, Wit parece funcionar como un receptor de presináptica que regula el tamaño sináptica en la NMJ de Drosophila.
Los Miembros De La Sinaptobrevina / Vesícula Asociada a La Proteína De Membrana (VAMP) Familia En Drosophila Son Funcionalmente Intercambiables En Vivo Por La Liberación De Neurotransmisores Y La Viabilidad Celular
Synaptobrevins o VAMPS son vesículas asociadas a las proteínas de membrana, a menudo llamados V-Snares, que son importantes para el transporte de vesículas y la fusión en la membrana plasmática. Drosophila tiene dos miembros caracterizados de esta familia de genes: sinaptobrevina (SYB) y neuronal sinaptobrevina (n-SYB). Fenotipos mutantes y los patrones de expresión génica indican que el n-Syb es exclusivamente neuronal y requiere únicamente para la secreción de las vesículas sinápticas, mientras que Syb es ubicuo y, como se muestra aquí, esencial para la viabilidad celular. Cuando las células precursoras de los ojos se hicieron homocigotos para syb (-), el ojo no se desarrollaron. En contraste, el n-SYB (-) clones oculares desarrollado adecuadamente, pero no para activar las neuronas descendentes. Para determinar si las dos proteínas son estructuralmente especializado para llevar a cabo estas funciones en distintos in vivo, hemos llevado a la expresión de cada gen en la ausencia de la otra para buscar rescate fenotípica. Encontramos que la expresión de n-SYB durante el desarrollo del ojo puede rescatar la letalidad de células de las mutaciones SYB, como puede rata VAMP2 y cellubrevin. Expresión de syb puede restaurar la transmisión sináptica a la N-SYB mutantes como ensayadas tanto por electrorretinograma y grabaciones de las corrientes de excitación de unión en la unión neuromuscular. Por lo tanto, nos encontramos con que Syb, que por lo general no participa en la función sináptica, puede mediar Ca (2 +), activado por la actividad sináptica y que ninguna especialización de la v-SNARE se requiere para diferenciar la exocitosis sináptica de otras formas.
El Homólogo De BMP Gbb Proporciona Una Señal Retrógrada Que Regula El Crecimiento Sináptica En El Cruce De Drosophila Neuromuscular
Se demuestra que el BMP ortholog Gbb puede indicar mediante un mecanismo retrógrado a regular el crecimiento de las sinapsis de la unión neuromuscular de Drosophila (UNM). Gbb mutantes tienen un reducido tamaño de la UNM sinapsis, la disminución de la liberación de neurotransmisores, y la ultraestructura presináptica aberrante. Estos defectos son similares a los que se observa en los mutantes de receptores BMP y factores de transcripción Smad. Sin embargo, mientras estos receptores BMP de señalización y se requieren en la motoneurona presináptica, la expresión Gbb se requiere en gran parte en los músculos postsinápticos, expresión GBB en el músculo rescata los aspectos clave del fenotipo mutante GBB. En consonancia con esta idea, nos encontramos con que el bloqueo del transporte axonal retrógrado por la sobreexpresión de dominante negativo en las neuronas p150/Glued inhibe la señalización de BMP en las motoneuronas. Estos experimentos muestran que una señal derivada de músculo BMP retrógrada participa en la coordinación de desarrollo de la sinapsis neuromuscular y el crecimiento.
Control De Retrógrado De La Transmisión Sináptica Postsináptica CaMKII En El Cruce De Drosophila Neuromuscular
Señalización retrógrada desempeña un papel importante en la homeostasis sináptica, el crecimiento y la plasticidad. Una señal de retroceso en la unión neuromuscular (UNM) de Drosophila controla la homeostasis de la liberación de neurotransmisores. Aquí, mostramos que esta señal retrógrada está regulada por la actividad postsináptica de Ca2 + / calmodulina dependiente de la proteína quinasa II (CaMKII). La reducción de la actividad de CaMKII en los músculos mejora la señal y aumenta la liberación de neurotransmisores, mientras que la activación constitutiva de la CaMKII en los músculos inhibe la señal y disminuye la liberación de neurotransmisores. La inhibición postsináptica de CaMKII aumenta el número de asociados presináptica, la vesícula barras de T en las zonas activas. Constantemente, nos muestran que los mutantes del receptor del glutamato también tienen un mayor número de barras de T, este aumento es suprimida por la activación postsináptica de CaMKII. Por otra parte, se demuestra que el pensamiento pre-sináptica de receptores BMP ilusión es necesaria para la señal de retroceso para funcionar. Nuestros resultados indican que CaMKII juega un papel clave en el control de la homeostasis retrógrada de la transmisión sináptica en la NMJ de Drosophila.
Highwire Regula Presinápticos De Señalización BMP Esencial Para El Crecimiento Synaptic
Highwire (Hiw), un dedo supuesta ANILLO E3 ligasa de ubiquitina, regula negativamente el crecimiento sináptica en la unión neuromuscular (UNM) en Drosophila. hiw mutantes tienen un tamaño considerablemente más grande sináptica y un mayor número de botones sinápticos. Aquí nos muestran que Hiw une a la proteína Smad Medea (Med). Med es parte de una proteína morfogenética ósea presináptica (BMP) cascada de señalización que consta de tres subunidades del receptor, el ingenio, TKV, y Sax, además del factor de transcripción Smad Mad. En comparación con los de tipo salvaje y mutantes de señalización BMP componentes tienen un tamaño más pequeño NMJ, la reducción de la liberación de neurotransmisores, y la ultraestructura sináptica aberrante. BMP mutantes de señalización suprimir el crecimiento excesivo sináptica en mutantes hiw. La activación de la señalización de BMP, que en la de tipo salvaje no produce un crecimiento adicional, en los mutantes hiw conduce a la expansión sináptica más. Estos resultados revelan un equilibrio entre los positivos de señalización BMP y la regulación negativa de Highwire, que regula el crecimiento de las sinapsis neuromusculares.
Todas Las Neuropatías Grandes Y Pequeñas
Autosómica dominante pura paraplejia espástica hereditaria (AD-HSP) se caracteriza por la degeneración de los axones largos en los tractos corticoespinal y las columnas dorsales, lo que resulta en la espasticidad y la dificultad para caminar. Las mutaciones en el gen del producto espastina SPG4 son las lesiones predominantes genéticos asociados con esta enfermedad hereditaria. En esta edición, Orso et al. examinar y reconciliar a los actuales Drosophila mutantes de espastina y generar un nuevo modelo de HSP por la sobreexpresión de un transgén mosca espastina que lleva una mutación frecuente en humanos AD-HSP (véase el artículo que comienza relacionado en la página 3026). La expresión de esta proteína mutante espastina produce patología en las moscas que recuerdan a la enfermedad humana, incluyendo defectos de locomoción para adultos, además de causar aberrante morfología sináptica y la estabilidad de los microtúbulos alterado. Tanto el movimiento y defectos sinápticos en moscas mutantes se mejoran por el tratamiento con el agente de vinblastina microtúbulos modificar. Los resultados son consistentes con mutaciones causantes de enfermedad en humanos espastina productores dominante negativo proteínas y confirmar la utilidad de las técnicas genéticas de Drosophila para entender HSP y otras enfermedades neurodegenerativas.
Genoma Toda La P-elemento De La Pantalla Para Los Mutantes De Drosophila Sinaptogénesis
Una comprensión molecular de la sinaptogénesis es un paso crítico hacia el objetivo de comprender cómo el cerebro "a sí mismos cablear," y luego "recableado" durante el desarrollo y la experiencia. Recientes avances de la genómica y molecular han hecho posible el estudio de la sinaptogénesis en una escala genómica. A continuación, describimos los resultados de una pantalla de genes implicados en la formación y el desarrollo de la Drosophila glutamatérgica unión neuromuscular (UNM). Se seleccionaron 2185 P-elemento transposón mutantes que representan inserciones en aproximadamente el 16% de todo el genoma de Drosophila. En primer lugar, identificar mutantes recesivos letales, sobre la base de la hipótesis de que las mutaciones que causan graves trastornos en la sinaptogénesis es probable que sean letales. Doscientos veinte (10%) de todas las inserciones eran homocigotos letal. Doscientos cinco (93%) de estos mutantes letales desarrollados al menos durante la embriogénesis tardía y neuromusculatura formado. Hemos examinado NMJs embriones / larvas en 202 de estos mutantes homocigotos mediante microscopía confocal y la inmunocitoquímica. Se identificaron y clasificaron 88 mutantes con alteración de la morfología NMJ. Loci de inserción en estos mutantes codificar los diferentes tipos de proteínas, incluyendo ATP y GTPasas, reguladores del citoesqueleto, las moléculas de adhesión celular, quinasas, fosfatasas, reguladores de ARN, los reguladores de la formación de proteínas, factores de transcripción, y los transportistas. El trece por ciento de las inserciones en los genes que codifican proteínas de función nueva o desconocida. Pruebas y ensayos de complementación de RT-PCR indican que aproximadamente el 51% de las líneas de inserción son portadores de mutaciones de fondo. Nuestros resultados revelan que la sinaptogénesis requiere la acción coordinada de muchos tipos diferentes de proteínas, tal vez tanto como el 44% de la totalidad del genoma - mutagénesis de transposones y que llevan advertencias importantes que deben respetarse a la hora de interpretar los resultados generados mediante este método.
La Esclerosis Lateral Amiotrófica Asociada a Proteínas FUS Y La Función De TDP-43, Junto a La Locomoción Afectan Drosophila Y Duración De La Vida
El motor fatal enfermedad de la neurona adulta esclerosis lateral amiotrófica (ELA) comparte algunas coincidencias clínicas y patológicas con demencia frontotemporal (DFT), un trastorno neurodegenerativo de aparición temprana. Las proteínas del ADN / ARN de unión fundidos en el sarcoma (FUS, también conocida como TLS) y la proteína de unión del ADN TAR-43 (TDP-43) han sido recientemente demostrado ser genéticamente y patológicamente asociado con formas familiares de ELA y FTD. Actualmente se desconoce si la perturbación de estas proteínas resulta en la enfermedad a través de mecanismos que son independientes de la función normal de las proteínas o por medio de la alteración fisiopatológica de los procesos moleculares en los que son a la vez crítico. En este caso, nos informan de que los mutantes de Drosophila en el que se interrumpe el homólogo de FUS exposición disminución de la viabilidad de adultos, la velocidad del aparato locomotor disminuido, y su vida útil reducida en comparación con los controles. Estos fenotipos fueron rescatados totalmente por la de tipo salvaje FUS humanos, pero no asociada a la ELA proteínas mutantes del FUS. Un mutante del homólogo de Drosophila TDP-43 tuvo similar, pero más graves, los déficits. A través del análisis transversal de rescate, hemos demostrado que actuó junto con el FUS y aguas abajo de la TDP-43 en una vía común genética en las neuronas. Además, hemos encontrado que estas proteínas asociadas entre sí en un complejo ARN-dependiente. Nuestros resultados establecen que la función FUS y TDP 43-juntos en vivo e indican que las vías moleculares que requieren las actividades combinadas de ambas de estas proteínas pueden ser interrumpidos en la ALS y FTD.
