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Articles by Christopher R. Parish in JoVE

 JoVE Immunology and Infection

L'utilisation de carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes

1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University


JoVE 2259

CFSE étiquettes de façon covalente à long terme avec les molécules intracellulaires colorant fluorescent, carboxyfluorescéine. En tant que tel, quand une cellule se divise CFSE-étiquetés, sa descendance ont la moitié de la quantité de fluorescence, qui peut ainsi être utilisée pour évaluer la division cellulaire. Cet article décrit les procédures généralement utilisées pour le marquage des lymphocytes de souris avec CFSE.

 JoVE Immunology and Infection

L'utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l'évaluation des réponses des cellules T

1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University


JoVE 51627

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l'utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant> 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

Other articles by Christopher R. Parish on PubMed

Utilisation De La CFSE Dye Fluorescent Intracellulaire Pour Surveiller La Migration Des Lymphocytes Et La Prolifération

L'incorporation stable de la CSFE colorant intracellulaire dans les lymphocytes est un outil puissant pour surveiller la migration des lymphocytes in vivo et pour l'analyse quantitative de la division cellulaire à la fois in vivo et in vitro. Cette unité décrit des méthodes de marquage des numéros élevés ou faibles de lymphocytes avec CSFE. Les protocoles sont fournies pour pouvoir utiliser CSFE cellules marquées dans les études de transfert de cellules ou des cellules à être cultivées in vitro. Des lignes directrices détaillées pour le positionnement des lymphocytes CSFE-étiquetés dans les organes lymphoïdes ou d'autres tissus sont inclus pour ceux qui souhaitent utiliser cette approche pour étudier la migration des lymphocytes.

Synthèse Convergente Et Préliminaires évaluations Biologiques De L'Stilbenolignan (+ / -)-aiphanol Et Divers Congénères

Traitement d'un mélange équimolaire de stilbène 7 et 8, de l'alcool cinnamylique carbonate d'argent dans de l'acétone-benzène donné une env. 2:1:2:1 mélange de l'stilbenolignan (+ / -)-aiphanol (1) et 2-4 congénères dont chacun montrent un important anti-angiogénique et de la COX-2 propriétés inhibitrices.

Le Blocage De La Prolifération Vasculaire Des Cellules Musculaires Lisses Et épaississement De L'intima Après Une Blessure Ballon Par Le Oligosaccharide Sulfaté PI-88: Sulfate Phosphomannopentaose Se Lie Directement FGF-2, Les Blocs De Signalisation Cellulaire, Et Inhibe La Prolifération

Angioplastie coronarienne transluminale percutanée est une technique fréquemment utilisée interventionnelle de rouvrir les artères qui ont rétréci en raison de l'athérosclérose. La resténose, ou reprise du rétrécissement de l'artère peu de temps après l'angioplastie, est un obstacle majeur à la réussite de la procédure et est principalement due à l'accumulation de lisser des cellules musculaires dans la paroi artérielle au site de la lésion ballon. Dans la présente étude, nous démontrons que l'anti-angiogénique oligosaccharide sulfaté, PI-88, inhibe la prolifération vasculaire primaire des cellules musculaires lisses et réduit épaississement de l'intima 14 jours après l'angioplastie par ballonnet des artères de rat et de lapin. PI-88 réduit la teneur en sulfate d'héparane dans la paroi artérielle lésée et empêché le changement dans le phénotype du muscle lisse. Cependant, le mécanisme de la PI-88 inhibition n'a pas été simplement limité à l'activité antiheparanase de ce composé. PI-88 bloqué extracellular signal-regulated kinase-1/2 (ERK1 / 2) L'activité dans les procès-verbaux des blessures des cellules musculaires lisses. Il a facilité la libération du FGF-2 à partir de cellules musculaires lisses indemnes in vitro, et super-publié le FGF-2 après une blessure, tout en inhibant de ERK1 / 2 d'activation. PI-88 inhibait la diminution des niveaux de protéine FGF-2 dans la paroi de l'artère de rat dans les 8 minutes de blessures. PI-88 ont également bloqué la phosphorylation de ERK-inductible blessures, sans en altérer le temps de coagulation chez ces animaux. Optiques des études ont révélé que biocapteurs PI-88 inhibait (Ki 10,3 nmol / L) de l'interaction du FGF-2 avec l'héparane sulfate. Ces résultats montrent pour la première fois la capacité de cet oligosaccharide sulfaté à lier directement le FGF-2, bloc de signalisation cellulaire et la prolifération in vitro, et d'inhiber les blessures hyperplasie des cellules musculaires lisses dans deux modèles animaux. En tant que tel, cette étude démontre un nouveau rôle pour PI-88 comme un inhibiteur de la épaississement de l'intima après angioplastie par ballonnet. Le texte intégral de cet article est disponible en ligne à http://www.circresaha.org.

L'immunothérapie Contre Le Cancer: Le Passé, Le Présent Et L'avenir

L'une des questions les plus controversées en matière d'immunologie pour plus d'un siècle a été de savoir si une réponse immunitaire efficace peut être obtenue contre les tumeurs malignes. Que la communauté immunologie a cru l'immunothérapie du cancer est faisable, voire impossible, a été largement déterminé par les paradigmes dominants immunologiques à ce moment-là. En fait, au cours des 110 dernières années, il est possible de retracer au moins cinq des fluctuations dramatiques dans l'attitude envers l'immunothérapie du cancer. Il apparaît maintenant, cependant, que des preuves accablantes est disponible pour soutenir le point de vue que les deux réponses immunitaires innées et adaptatives capables de reconnaître et éliminer les tumeurs. D'autre part, il reste à voir si ces réponses immunitaires peuvent être exploitées pour lutter contre le cancer que, au moment du diagnostic, de nombreuses tumeurs ont déjà été immunoselected pour être très résistant à l'élimination immunitaire. Sur la base de ces observations, il est soutenu que les approches d'immunothérapie, autres que la génération de la tumeur-lymphocytes T cytotoxiques spécifiques, doivent être explorées. Des stratégies alternatives comprennent le recrutement de cellules myéloïdes tumoricides dans les tumeurs, générer des réponses immunitaires anti-angiogéniques et de diriger l'immunité innée à l'hypoxie induites par des ligands sur les cellules tumorales.

Un Inhibiteur De L'héparanase Synthétique Réduit Protéinurie Heymann Néphrite Passive

Le héparanase bêta-D-endoglycosidase a été proposé de jouer un rôle important dans la pathogenèse de la protéinurie en agissant de manière sélective dégrader les chaînes latérales chargées négativement de héparane sulfate protéoglycanes (HSPG) au sein de la membrane basale glomérulaire (GBM). Une perte de l'HSPG chargé négativement peut entraîner une altération des propriétés de la permsélectives GBM, la perte de glomérulaires épithéliales et endothéliales des points d'ancrage des cellules, et la libération de facteurs de croissance. Cette étude a examiné l'effet de la PI-88, un inhibiteur de héparanase sulfaté oligosaccharides, sur la fonction rénale, ultrastructure glomérulaire et une protéinurie. Continu PI-88 perfusion à 25 mg / kg par j n'a pas d'effet négatif sur le comportement animal, la croissance, ou taux de filtration glomérulaire. Corticale vacuolisation tubulaire, cependant, a été observé par microscopie optique, et l'épaisseur GBM a été significativement réduite chez ces animaux (P <0,0002). Études de distribution tissulaire en utilisant [(35) S] marqué PI-88 a révélé des niveaux élevés de radioactivité dans le rein après une seule injection sous-cutanée de 25 mg / kg, ce qui suggère l'accumulation prolongée; ailleurs, activement PI-88 a été détecté dans l'urine. Dans Heymann néphrite passive, PI-88 rendu en perfusion continue à 25 mg / kg par d significativement réduit autologue phase protéinurie, au jour 14 (P <0,009), en l'absence de dépôt de mouton anticorps modifié, C5b-9 dépôt, et la diffusion des titres d'anticorps anti-rat moutons. Glomérulaire facteur de croissance endothélial vasculaire et l'expression du facteur de croissance des fibroblastes n'a pas été affectée par le PI-88 l'administration. Toutefois, PI-88 l'administration de manière significative empêché la perte glomérulaire HSPG tel que démontré par des études quantitatives d'immunofluorescence (P <0,0001) en l'absence de distribution agrine altérée. Ces données confirment donc l'importance de l'héparanase dans le développement d'une protéinurie.

Le Ciblage Des Cellules Dendritiques Avec L'antigène Contenant Des Liposomes: Immunité Antitumorale

Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène qui jouent un rôle important dans la défense immunitaire de l'organisme contre le cancer. Les stratégies faisant appel antigène amorcées PED que les vaccins tumoraux prometteurs chez les patients, mais l'approche est difficile à utiliser cliniquement. Antigènes tumoraux solubles peuvent être ciblées sur des pays en développement in vivo, mais cela induit souvent de la tolérance antigénique plutôt que l'immunité. Les liposomes sont des structures lipidiques vésiculaires avec adjuvant des propriétés similaires. Il est important, les liposomes peuvent encapsuler des facteurs d'antigènes et immunomodulatrices, servant ainsi de puissants véhicules de livraison. Différentes stratégies sont explorées pour cibler des antigènes liposomales aux PED in vivo. Une approche a utilisé des fragments d'anticorps à chaîne unique à la surface de molécules DC CD11c et DEC-205, attaché à la surface des vésicules par chélateur de métaux de liaison, de cibler les membranes liposomales contenant l'antigène et de l'interféron-gamma ou lipopolysaccharide aux PED. De telles membranes induire des réponses antitumorales dramatiques et les effets d'immunothérapie lorsqu'il est utilisé comme un vaccin dans le modèle de tumeur murine B16-OVA mélanome. Liposomale ciblage des signaux d'antigènes et de la maturation directement aux PED in vivo, par conséquent, représente une stratégie beaucoup plus simple pour l'immunothérapie du cancer que l'antigène de chargement PED ex vivo.

Le Plasminogène Est Connecté Avec Une Haute Affinité à La Surface Cellulaire Par La Protéine Plasmatique, Glycoprotéine Riche En Histidine

Plasminogène a été impliquée dans la dégradation de la matrice extracellulaire par envahir les cellules, mais peu de récepteurs de haute affinité à la surface cellulaire de la molécule ont été identifiés. Des études antérieures ont rapporté que la protéine plasmatique, glycoprotéine riche en histidine (HRG), interagit avec les surfaces du plasminogène et de la cellule, ce qui soulève la possibilité que HRG peut immobiliser plasminogène / plasmine à la surface des cellules. Ici, nous montrons, sur la base des analyses optiques biocapteurs, qui interagit avec HRG immobilisés plasminogène soluble avec une haute affinité et avec un taux extrêmement lente dissociation. En outre, l'interaction HRG-plasminogène est la lysine-dissociable et comporte essentiellement du domaine amino-terminal de HRG, et le cinquième domaine kringle du plasminogène, mais pas la lysine carboxy-terminale de HRG. HRG a également été démontré que le plasminogène attache à la surface des cellules, avec cette interaction étant potentialisé par élévation de Zn (2 +) et les niveaux de pH bas, les conditions qui prévalent sur les sites de lésion tissulaire, la croissance tumorale et l'angiogenèse. Sur la base de ces données, nous proposons que HRG agit comme une molécule adaptateur soluble qui se lie aux cellules des sites de lésion tissulaire, la croissance tumorale, l'angiogenèse et, fournissant un récepteur de haute affinité pour attacher plasminogène à la surface cellulaire et d'accroître ainsi le potentiel migratoire des cellules .

Le Ciblage Des Cellules Dendritiques Avec L'antigène Contenant Des Liposomes: Une Procédure Très Efficace Pour L'induction De L'immunité Antitumorale Et Pour L'immunothérapie Des Tumeurs

Les cellules dendritiques (CD) sont de puissants stimulateurs de l'immunité, et les PED pulsées avec l'antigène in vivo ex tumeur ont des applications dans l'immunothérapie des tumeurs. Toutefois, les PED sont une petite population de cellules, et leur isolement et de pulsation avec l'antigène peut être impraticable. Nous montrons ici que d'une préparation brute de la membrane plasmique des vésicules (PMV) à partir du mélanome métastatique très murin (B16-OVA) et un antigène tumoral de substitution (OVA) peuvent être ciblées directement aux PED in vivo pour obtenir des effets fonctionnels. Un roman de métal-chélateur lipidique, 3 (acide nitrilotriacétique)-ditetradecylamine, a été incorporé dans B16-OVA dérivé VP, ce qui permet recombinantes formes hexahistidine-étiquetés de simples fragments d'anticorps à chaîne à la surface de molécules DC CD11c et DEC-205, pour être commodément «greffé» sur la surface des vésicules par chélateur de métaux de liaison. Le PMV modifié, ou même greffées liposomes furtifs synthétiques contenant l'antigène peptide OVA ou OVA, ont été trouvés pour cibler les PED in vitro et in vivo, dans des expériences utilisant la cytométrie en flux et microscopie confocale de fluorescence. Lorsqu'il est utilisé comme vaccins chez la souris syngéniques, les préparatifs stimulé fortes B16-OVA-réponses CTL spécifiques dans les cellules T spléniques et une protection contre la croissance tumorale marquée. La protection était dépendante de la livraison simultanée de l'antigène et une maturation des cellules dendritiques ou «signal de danger« signal (IFN-gamma ou lipopolysaccharide). L'administration du vaccin DC-ciblage à des souris avec des cellules B16 contestées-OVA induit un effet dramatique immunothérapeutique et prolongée la survie sans maladie. Les résultats montrent que le ciblage de l'antigène aux PED de cette façon est très efficace pour induire une immunité et la protection contre la tumeur, avec une protection étant au moins partiellement dépendante de la chimiokine éotaxine éosinophiles.

Le Faible Poids Moléculaire Héparane Sulfate-mimétique, PI-88, Inhibe Cellule à Cellule Propagation Du Virus Herpes Simplex

Bien qu'un certain nombre de polysaccharides sulfatés ont été montré pour empêcher l'infection des cellules par le virus herpès simplex (HSV), on sait peu au sujet de leurs effets sur la propagation de cellule à cellule du virus. Ces composés agissent en inhibant la liaison du virus à des cellules, et leurs puissances antiviraux augmentent habituellement avec un poids moléculaire et de la densité croissante de sulfatation. Nous avons constaté que le poids moléculaire faible HS-mimétique, PI-88, qui est un mélange de très sulfatée contenant du mannose di-à hexa-saccharides, inhibé l'infection au VHS de cellules et de cellule à cellule propagation du virus HSV-1 et HSV -2. Par rapport à un polysaccharide héparine relativement grande, PI-88 démontré plus faible inhibition de l'infectiosité HSV mais la réduction plus efficace de la cellule à cellule propagation de HSV. Une fraction d'tétrasaccharide PI-88 est le fragment minimum nécessaire pour inhiber l'infectiosité HSV-1, tandis qu'un trisaccharide est suffisante pour réduire de cellule à cellule propagation. Une réduction de la propagation latérale HSV a également été observée dans les cellules incubées avec un autre composé de faible poids moléculaire, polysulfate de pentosan, mais pas avec le polysaccharide sulfate de chondroïtine beaucoup plus E. Certaines différences en ce qui concerne les effets de la PI-88, l'héparine, la protamine, poly-L- chlorate de sodium et de la lysine sur la propagation intercellulaire du virus HSV-1 et HSV-2 ont été trouvés. Nous concluons que structurellement différents oligosaccharides sulfatés sont préférés pour l'inhibition de l'infectivité de HSV et la propagation de cellule à cellule. Ce dernier a été efficacement inhibée par un relativement petit mais densément sulfaté PI-88 oligosaccharide, très probablement due à la capacité du composé d'accéder à l'espace étroit intercellulaire.

Glycoprotéine Riche En Histidine Lié à L'héparane Sulfate Cell-surface Via Son Domaine N-terminal Après Zn2 + Par Chélation

Glycoprotéine riche en histidine (HRG) est une glycoprotéine alpha2-trouvé dans le plasma des mammifères à des concentrations élevées (environ 150 microg / ml) et se distingue par sa haute teneur en histidine et la proline. Structurellement, HRG est une protéine modulaire constitué d'une N-terminale de cystatine domaine de type (N1N2), une centrale riche en histidine région (FCR) flanquée par des séquences riches en proline, et un domaine C-terminal. HRG se lie à la surface des cellules et des ligands de nombreux tels que le plasminogène, le fibrinogène, la thrombospondine, C1q, l'héparine, et IgG, ce qui suggère qu'il peut agir comme une protéine adaptatrice soit en ciblant des ligands à la surface des cellules ou par réticulation ligands solubles. Malgré l'importance fonctionnelle de HRG a suggéré, les caractéristiques des cellules de liaison de la molécule sont mal définis. Dans cette étude, HRG a été montré pour se lier à la plupart des lignes de cellules dans un Zn (2 +) de manière dépendante, mais n'a pas réussi à interagir avec la lignée cellulaire d'ovaire de hamster chinois pgsA-745, qui manque de surface cellulaire glycosaminoglycanes (GAG). Le traitement ultérieur des GAG-positifs cellules ovariennes de hamster chinois avec héparanase mammifère ou bactérienne héparinase III, mais pas chondroïtinase ABC, a aboli HRG contraignant. En outre, des études de blocage avec des espèces différentes GAG a indiqué que l'héparine seule était un puissant inhibiteur de HRG contraignant. Ces données suggèrent que le sulfate d'héparane est la surface des cellules prédominent ligand pour HRG et que héparanase mammifère est un régulateur potentiel de HRG contraignant. En utilisant des formes recombinantes de pleine longueur HRG et le domaine N-terminal N1N2, il a été montré que le domaine N1N2 liée spécifiquement à l'héparine immobilisée et le sulfate d'héparane de surface cellulaire. En revanche, des peptides synthétiques correspondant à la Zn (2 +) de liaison HRR de HRG n'a pas interagir avec les cellules. En outre, la liaison de pleine longueur HRG, mais pas le domaine N1N2, a été grandement potentialisé par des concentrations physiologiques de Zn2 +. Sur la base de ces données, nous proposons que le domaine N1N2 se lie à l'héparane sulfate de la surface cellulaire et que l'interaction de Zn2 + avec le FCR peut améliorer indirectement la surface des cellules de liaison.

Sulfate Phosphomannopentaose (PI-88): Le Sulfate D'héparane Mimétique Avec Un Potentiel Clinique Dans De Multiples Pathologies Vasculaires

Le PI-88 sulfaté oligosaccharide est un anti-angiogénique puissant, anti-tumorale et anti-métastatique agent dérivé de la levure. Il est principalement composé de phosphomannopentaose sulfaté et phosphomannotetraose unités oligosaccharidiques et est actuellement en cours d'évaluation dans des essais cliniques de phase II pour l'efficacité anticancéreuse. PI-88 inhibe la héparanase enzyme héparane sulfate-dégradants, présente une activité anti-angiogénique et possède des propriétés anticoagulantes médiées par l'héparine cofacteur II. Il inhibe également la prolifération vasculaire des cellules musculaires lisses, de signalisation kinase et épaississement de l'intima artérielle suite à une blessure ballon. Beaucoup d'héparane sulfate de facteurs de croissance contraignants exigent l'héparane sulfate comme un co-récepteur afin de fournir efficacement des signaux de croissance pour les cellules. Ainsi, l'activité anti-angiogénique et antirestenotic de PI-88 peut être au moins partiellement en raison de cet oligosaccharide sulfaté très en concurrence avec l'interaction de facteurs de croissance, tels que le FGF-2 et le VEGF, avec surface de la cellule d'héparane sulfate. Ce sulfate d'héparane mimétique a, par conséquent, de multiples fonctions et le potentiel thérapeutique dans une variété de troubles vasculaires.

Héparane Sulfate Et L'inflammation

Glycoprotéine Riche En Histidine Se Lie Spécifiquement à Des Cellules Nécrotiques Via Son Domaine Amino-terminal Et Facilite La Phagocytose Des Cellules Nécrotiques

Les cellules qui deviennent nécrotiques ou apoptotiques par des dommages aux tissus ou pendant le renouvellement cellulaire normale sont en général rapidement éliminé de la circulation et des tissus par des cellules phagocytaires. Un certain nombre de protéines solubles ont été identifiés qui facilitent la phagocytose des cellules apoptotiques, mais peu de protéines ont été définis de manière sélective opsoniser cellules nécrotiques. Des études antérieures ont montré que la glycoprotéine riche en histidine (HRG), une abondante (environ 100 microg / ml) glycoprotéine plasmatique de 75 kDa, se lie à l'héparane sulfate de surface cellulaire sur les cellules viables et cross-links d'autres ligands, tels que le plasminogène, à l' surface de la cellule. Dans cette étude, nous avons démontré que HRG se lie également très fortement, dans un héparane sulfate manière indépendante de, au ligand cytoplasmique (s) exposés dans les cellules nécrotiques. Cette interaction est médiée par le domaine amino-terminal de HRG et les résultats de la phagocytose accrue des cellules nécrotiques par une lignée cellulaire monocytaire. En revanche, il a été constaté que HRG se lie mal et ne les opsoniser cellules à un stade précoce apoptotiques. Ainsi, HRG a la propriété unique de reconnaître sélectivement les cellules nécrotiques et peut jouer un rôle physiologique important in vivo en facilitant l'absorption et la clairance de la nécrose, mais pas apoptotique des cellules par les phagocytes.

Preuve Que Le Ligand Cellulaire Pour Le Récepteur Humain De Cellules NK Activation NKp30 N'est Pas Un Glycosaminoglycane Héparane Sulfate

NKp30 (NCR3, CD337) est un récepteur cytotoxicité naturelle, exprimé sous-ensembles de cellules humaines du sang périphérique NK, impliqués dans la destruction des cellules NK des cellules tumorales et des cellules dendritiques immatures. Le ligand cellulaire pour NKp30 est resté inaccessible, bien que les preuves que la membrane associée à l'héparane sulfate (HS) protéoglycanes sont impliqués dans la reconnaissance de cibles cellulaires par NKp30 a récemment été rapporté. Les données présentées dans ce rapport montrent de façon concluante que les glycosaminoglycanes (GAG SH) ne sont pas des ligands pour NKp30. On montre que la suppression SH complètement de la surface cellulaire de humaine 293-EBNA cellules de mammifère avec héparanase n'affecte pas la liaison de complexes rNKp30/human Fc d'IgG1 ou chimère liaison de multimères de liposomes-rNKp30 complexes. Enlever SH de 293 EBNA-cellules, la culture généré par courant continu, MM-170 cellules de mélanome malin, des cellules HeLa ou n'affecte pas la mise à mort NKp30-dépendante de ces cellules par des cellules NK. Nous montrons en outre que les GAG-déficientes hamster pgsA-745 cellules qui n'ont pas HS et le GAG ​​exprimant parents cellules CHO-K1 sont tous deux tués par les cellules NK, avec le meurtre de deux lignées de cellules inhibées dans la même mesure par les anti-NKp30 mAb. A partir de ces résultats, nous concluons que GAG ​​HS ne sont pas des ligands pour NKp30, laissant ouverte la question quant à la nature du ligand pour ce récepteur cellulaire importante des cellules NK activation.

Un Sulfate D'héparane Mimétique Fonctionnelle Implique Deux Héparanase Et Le Sulfate D'héparane Dans L'angiogenèse Tumorale Et L'invasion Dans Un Modèle Murin De Cancer à Plusieurs étages

Protéoglycanes de sulfate d'héparane font partie intégrante de la matrice extracellulaire qui entoure toutes les cellules de mammifères. En plus de fournir l'intégrité structurale, ils agissent comme un dépôt de stockage pour une variété de l'héparane sulfate (HS)-protéines de liaison, y compris les facteurs de croissance et des chimiokines. Héparanase est une enzyme dégradant la matrice qui clive les chaînes héparane sulfate latérales des protéoglycanes de base, libérant ainsi de telles protéines de liaison SH, ainsi que susceptibles de contribuer à la dégradation de matrice extracellulaire. Ici, nous déclarons que l'ARNm et l'expression protéique héparanase sont augmentés dans les stades néoplasiques progressivement se déroulent dans un modèle murin de îlots pancréatiques à plusieurs étages cancérogenèse. Notamment, héparanase est livré à des lésions néoplasiques, en grande partie par l'infiltration Gr1 + ou + de MAC1 cellules immunitaires innées. Un mimétique sulfaté oligosaccharide de sulfate d'héparane, PI-88, a été utilisé pour inhiber simultanément l'activité héparanase et les fonctions effectrices du SH. PI-88 a eu des effets significatifs à des stades distincts de la tumorigenèse, produisant une réduction du nombre de lésions souches précoces et une altération de la croissance tumorale à des stades ultérieurs. Ces réponses ont été associés à la prolifération des cellules a diminué, l'apoptose a augmenté, l'angiogenèse avec facultés affaiblies, et une réduction substantielle du nombre de cancers invasifs. En outre, nous montrons que la réduction dans l'angiogenèse tumorale est corrélée avec une association réduite du VEGF-A avec son récepteur VEGF-R2 sur l'endothélium tumoral, impliquant héparanase dans la mobilisation de la matrice associée à VEGF. Ces données encouragent les applications cliniques des inhibiteurs tels que PI-88 pour les cancers de l'homme où l'expression de nombreux héparanase est élevé ou la mobilisation de HS-contraignants facteurs réglementaires est impliqué.

Glycoprotéine Riche En Histidine: Une Protéine Dans Le Plasma Adaptateur Roman Qui Module Le Système Immunitaire, Vasculaires Et De Coagulation

Glycoprotéine riche en histidine (HRG) est une glycoprotéine plasmatique abondante qui a une structure multidomaine, interagit avec de nombreux ligands, et a été montré pour réglementer un certain nombre de processus biologiques importants. Ligands HRG comprennent Zn (2 +) et l'hème, la tropomyosine, de l'héparine et d'héparane sulfate, le plasminogène, la plasmine, le fibrinogène, la thrombospondine, IgG, et le complément FcgammaR. Dans de nombreux cas, la région riche en histidine de la molécule améliore ligand interaction de liaison suivant avec Zn (2 +) ou l'exposition à faible pH, les conditions associées aux sites de lésion des tissus ou la croissance tumorale. La nature multidomaine de HRG indique qu'il peut agir comme une protéine adaptatrice extracellulaire, réunissant ligands disparates, en particulier sur les surfaces cellulaires. HRG se lie à la plupart des cellules principalement par héparane sulfate protéoglycanes, la liaison qui est également potentialisée par surélevée sans Zn (2 +) et les niveaux de pH bas. Des rapports récents ont montré que HRG peut moduler l'angiogenèse et des études supplémentaires ont montré qu'il peut réglementer d'autres processus physiologiques tels que l'adhérence et la migration cellulaire, la fibrinolyse et la coagulation, l'activation du complément, le système immunitaire jeu complexe et la phagocytose des cellules apoptotiques. Cette revue décrit les moléculaires, propriétés structurales, biologiques et cliniques de HRG ainsi que la description du rôle de HRG dans divers processus physiologiques.

L'utilisation De Sulfatés CYCLITOLS Liés Comme Mimétiques De Sulfate D'héparane Pour Sonder La Spécificité Du Sulfate D'héparine / Héparane Liaison Des Protéines

Sulfate d'héparine et d'héparane (HS) sont structurellement différents glycosaminoglycanes (GAG) qui sont connues pour interagir, par l'intermédiaire uniques motifs structuraux, avec un large éventail de protéines fonctionnellement distinctes et de moduler leur activité biologique. Pour définir les motifs de GAG ​​qui interagissent avec des protéines, nous avons évalué la capacité de 15 mimétiques SH totalement synthétiques pour interagir avec 10 protéines fonctionnellement diverses qui lient l'héparine / SH. Les mimétiques du SH se composait de cyclitol à base de pseudo-sucres couplés par linkers de longueur variable de la chaîne, la flexibilité, l'orientation, et l'hydrophobie, avec des variations de sulfatation également introduits dans certaines molécules. Trois des protéines testé, le facteur de croissance des hépatocytes à savoir, l'éotaxine, et l'élastase, pas interagir avec l'une quelconque des cyclitols sulfatés liés. En revanche, chacun des sept autres protéines testées présentaient une réactivité unique motif avec le panneau de mimétiques du SH, avec cyclitols tétramères liés par les différentes chaînes alkyles de longueur étant particulièrement instructif. Ainsi, composés avec de courtes entretoises alkyle de 2-3 atomes de carbone) effectivement bloqué l'interaction de facteur de croissance des fibroblastes-1 (FGF-1) et la lipoprotéine lipase avec de l'héparine / SH, tandis entretoises plus longues chaînes (7-10 atomes de carbone) sont tenus pour l'inhibition optimale du FGF-2 et du facteur de croissance vasculaire endothéliale de liaison. Cet effet été la plus prononcée avec la chimiokine, l'interleukine-8, où alkyle liés cyclitols tétramères sont essentiellement inactif moins une entretoise de plus de 7 atomes de carbone a été utilisé. Les enzymes héparine-inhibée héparanase et la cathepsine G a également affiché des profils d'inhibition caractéristiques, la cathepsine G interagir pêle-mêle avec la plupart des cyclitols sulfatés, mais l'activité héparanase étant inhibée plus efficacement par mimétiques du SH qui ressemblent structurellement un pentasaccharide sulfaté. Ces données indiquent que un simple panneau de mimétiques du SH peut être utilisé pour sonder le SH spécificité de liaison des protéines, avec la position des groupes anioniques dans les mimétiques SH étant critique.

Les Vaccins Liposomiques - Le Ciblage De La Prestation De L'antigène

Les vaccins qui peuvent amorcer le système immunitaire adaptatif pour une réponse rapide et efficace contre un pathogène ou d'une tumeur des cellules, exiger la production de l'antigène (Ag)-T spécifiques de la mémoire et les cellules B. La capacité unique de cellules dendritiques (CD) pour activer les cellules T naïves, implique un rôle clé pour les PED dans ce processus. La génération d'une tumeur-spécifique CD8 (+) des cellules T cytotoxiques (CTL) dépend à la fois une stimulation des cellules T avec Ag (peptide-CMH-complexes) et la costimulation. Fait intéressant, les cellules tumorales qui n'ont pas l'expression de molécules co-stimulatrices T cellules deviennent hautement immunogène lorsque transfectées pour exprimer de telles molécules à leur surface. L'immunothérapie adoptive avec Ag-pulsé PED est également une stratégie prometteuse pour le traitement de cancer. L'utilisation de ces cellules à base de vaccins, cependant, est difficile et coûteux à utiliser cliniquement, et / ou peut comporter des risques dus à des manipulations génétiques. Les liposomes sont des structures vésiculaires de lipides particules qui peuvent intégrer Ag, les facteurs immunomodulateurs et des molécules de ciblage, et peut donc servir de vaccins puissants. De même, Ag plasma contenant des vésicules membranaires (PMV) dérivés de cellules tumorales peut être modifié pour incorporer une molécule co-stimulatrice des cellules T à fournir à la fois la stimulation du TCR, et la costimulation. PMV peut également être modifié pour contenir l'IFN-gamma et molécules pour le ciblage PED, permettant la livraison des deux Ag et un signal de maturation des cellules dendritiques pour initier une réponse immunitaire efficace. Nos résultats montrent que l'utilisation d'agents tels que les vaccins peuvent induire des réponses anti-tumorales immunitaire et des effets immuno-thérapeutiques dans des modèles tumoraux, et prévoir une stratégie pour le développement de vaccins efficaces et d'immunothérapies contre le cancer et les maladies infectieuses.

Le Rôle De L'héparane Sulfate Dans L'inflammation

Le sulfate d'héparane polysaccharide est exprimée de manière ubiquitaire comme un protéoglycane dans des matrices extracellulaires et la surface des cellules. Héparane sulfate a marqué la diversité des séquences qui lui permet d 'interagir spécifiquement avec de nombreuses protéines. Cet examen se concentre sur les rôles multiples de l'héparane sulfate dans les réponses inflammatoires et, en particulier, sur sa participation à presque toutes les étapes de la transmigration des leucocytes à travers la paroi des vaisseaux sanguins. Sulfate d'héparane est impliqué dans l'adhésion initiale des leucocytes à l'endothélium enflammé, la chimiokine ultérieure médiée par la transmigration à travers la paroi de la cuve et la mise en place d'aigus et chroniques des réactions inflammatoires.

Inhibition De Plasmodium Falciparum in Vitro La Croissance Et L'adhésion à La Chondroïtine-4-sulfate Par Les Héparane Sulfate Mimetic PI-88 Et D'autres Oligosaccharides Sulfatés

Un panel d'oligosaccharides sulfatés a été testé pour son activité antipaludique et l'inhibition de l'adhérence au récepteur paludisme placentaire chondroïtine-4-sulfate (CSA). Le sulfate d'héparane mimétique PI-88, actuellement en phase II des essais anticancéreux, affiché le plus grand in vitro une activité antipaludique contre Plasmodium falciparum (50% de concentration inhibitrice de 7,4 microM) et ont démontré une inhibition adhérence modeste à la norme CSA surface de la cellule.

C8c-C15 Monoseco-analogues De Phenanthroquinolizidine Alcaloïdes Du Julandine Et Cryptopleurine Exposantes Puissants Propriétés Anti-angiogéniques

Quatre énantiomériquement purs monoseco-analogues, 5, 7, 9 et 11, de la julandine phenanthroquinolizidine alcaloïde (1) et quatre congénère cryptopleurine (2), à savoir. composés 6, 8, 10, et 12, ont été préparés et soumis à l'évaluation biologique préliminaire. Ces analogues montrent de façon spectaculaire la cytotoxicité réduite par rapport au système parent 2, mais ils sont, néanmoins, de puissants agents anti-angiogéniques.

Surveillance De La Prolifération Des Lymphocytes in Vitro Et in Vivo Avec Le Colorant Fluorescent Intracellulaire Carboxyfluorescéine Diacétate Succinimidyl Ester

Ce protocole décrit la carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) méthode pour la suite de la prolifération des lymphocytes humains in vitro dans les lymphocytes et de la souris à la fois in vitro et in vivo. La méthode repose sur la capacité de CFSE de façon covalente étiqueter longue durée de vie des molécules intracellulaires avec le colorant fortement fluorescent, carboxyfluorescéine. Après chaque division cellulaire, la répartition égale de ces molécules fluorescentes aux cellules descendance des résultats dans une réduction de moitié de la fluorescence des cellules filles. Le protocole de marquage CFSE décrit, ce qui prend généralement <1 h pour effectuer, permet la détection d'un maximum de huit divisions cellulaires avant de fluorescence CFSE est diminuée à la fluorescence de fond de cellules non marquées. Les protocoles sont décrits pour l'étiquetage des numéros de grandes et petites de lymphocytes humains et de souris, l'étiquetage des conditions étant identifiés qui réduisent au minimum la toxicité CFSE, mais de maximiser le nombre de divisions cellulaires détectées. Une caractéristique importante de cette technique est que la division qui dépendent des changements dans l'expression de marqueurs de surface cellulaire et les protéines intracellulaires sont facilement quantifiables par cytométrie de flux.

Éotaxine Se Lie Sélectivement L'héparine. Une Interaction Qui Protège éotaxine De Protéolyse Et Potentialise L'activité Chimiotactique in Vivo

Une caractéristique importante de chimiokines est leur capacité à se lier à des chaînes de glycosaminoglycanes (GAG secondaires) de protéoglycanes, principalement l'héparine et l'héparane sulfate. À jour, toutes les chimiokines testé lient à l'héparine immobilisée in vitro, ainsi que le sulfate d'héparane de surface cellulaire in vitro et in vivo. Ces interactions jouent un rôle important dans la modulation de l'action de chimiokines en facilitant la formation de gradients de chimiokines stables au sein de l'endothélium vasculaire et de diriger la migration des leucocytes, en protégeant les chimiokines de la protéolyse, en induisant oligomérisation chimiokine, et en facilitant la transcytose. Malgré l'importance de l'éotaxine dans la différenciation des éosinophiles et de recrutement étant bien établies, peu est connu sur l'interaction entre l'éotaxine et GAG et les conséquences fonctionnelles d'une telle interaction. Rapportent ici que l'éotaxine se lie sélectivement à l'héparine immobilisée avec une haute affinité (K (j) = 1,23 x 10 (-8) M), mais pas à l'héparane-sulfate ou une plage de GAG ​​autres. L'interaction de l'éotaxine avec de l'héparine ne favorise pas oligomérisation éotaxine, mais protège éotaxine de la protéolyse par la plasmine directement et indirectement par la cathepsine G et élastase. In vivo, la co-administration de l'éotaxine et l'héparine est en mesure d'améliorer considérablement l'éotaxine-médiation du recrutement des éosinophiles dans une poche d'air de la souris modèle. En outre, lorsque l'héparine est co-administré avec l'éotaxine à une concentration qui n'entraîne normalement pas de l'infiltration des éosinophiles, le recrutement des éosinophiles se produit. En revanche, l'héparine ne renforce pas l'éotaxine-médiées par chimiotactisme des éosinophiles in vitro, suggérant la protection de protéase ou de la formation gradient haptotactic que le mécanisme par lequel l'héparine augmente l'action éotaxine in vivo. Ces résultats suggèrent un rôle pour le mât dérivé des cellules d'héparine dans le recrutement des éosinophiles, ce qui renforce la polarisation Th2 de la réponse inflammatoire.

Règlement Du Ou Des Auteurs Par L'IL-5 Et CCL11: Un Rôle Potentiel Pour Les éosinophiles Dans La Surveillance Immunitaire Des Tumeurs

Le rôle du système immunitaire dans la surveillance des cellules transformées a vu un regain d'intérêt dans les 10 dernières années, avec un corps considérable de données chez la souris et les humains un rôle de soutien pour le système immunitaire dans la protection de l'hôte du développement de la tumeur et dans l'élaboration de immunogénicité tumeur. Un certain nombre d'études antérieures ont démontré que les éosinophiles, lorsqu'il est recruté dans les tumeurs, peut très efficacement éradiquer des tumeurs transplantables. Dans cette étude, nous avons examiné si les éosinophiles jouent également un rôle dans la surveillance immunitaire des tumeurs par la détermination de l'incidence de la méthylcholanthrène (MCA)-induites fibrosarcomes dans IL-5 souris transgéniques qui ont des niveaux d'éosinophiles grandement améliorées en circulation, CCL11 (éotaxine-1) - les souris déficientes qui n'ont pas une chimiokine clé qui recrute éosinophiles dans les tissus, et les souches de souris déficientes en éosinophiles, IL-5/CCL11 (- / -) et DeltadblGATA. Il a été constaté que l'incidence des tumeurs MCA-induite et la croissance étaient significativement atténuée chez l'IL-5 souris transgéniques à la fois de la souris BALB / c et C57BL / 6 origines. L'examen histologique a révélé que l'effet protecteur de l'IL-5 a été associée à un nombre massivement améliorées d'éosinophiles dans les tumeurs et l'entourent. A l'inverse, il y avait une incidence plus élevée de tumeurs chez CCL11 (- / -) souris BALB / c, ce qui a été associée à un afflux d'éosinophiles réduite dans les tumeurs. Cette corrélation a été confirmée dans le IL-5/CCL11 éosinophiles déficients (- / -) et des souches de souris DeltadblGATA, où l'incidence des tumeurs a considérablement augmenté en l'absence totale d'éosinophiles. En outre, après des études in vitro ont trouvé que les éosinophiles pourrait tuer directement les cellules de fibrosarcome MCA-induites. Collectivement, nos données confirment le rôle potentiel de l'éosinophile comme une cellule effectrice dans la surveillance immunitaire des tumeurs.

Règlement Spectaculaire De L'activité Héparanase Et L'expression Génique Angiogenèse Dans La Synoviale De Patients Atteints De Polyarthrite Rhumatoïde

Bien que héparanase est reconnue comme un facteur pro-angiogénique, l'implication de l'héparanase dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) n'est pas claire. Dans cette étude, nous avons évalué l'activité héparanase dans le liquide synovial (SF) et du tissu synovial (ST) de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde ou l'arthrose (OA), et analysé l'expression de angiogéniques voie axées sur les gènes en ST de la PR et les patients arthrosiques.

Les Cellules B Adjacentes Acquérir Rapidement Des Récepteurs D'antigènes Des Lymphocytes B Activés Par Transfert Membranaire

Le récepteur d'antigène de cellule B (BCR) facilite efficacement la capture et le traitement d'un antigène spécifique pour la présentation sur les molécules du CMH de classe II à l'antigène-spécifiques CD4 +) des cellules T (1). Malgré cela, la majorité des cellules B sont supposés jouer qu'un rôle limité dans les CD4 (+) l'activation des cellules T, car RCO sont clonotypically exprimé. Ici, nous montrent, cependant, que les cellules B activées peut, à la fois in vitro et in vivo, rapidement faire don de leur BCR à cellules B adjacentes, un processus qui est médiée par le transfert direct entre la membrane des cellules B adjacentes et est amplifiée par l'interaction de la BCR avec un antigène spécifique. Il en résulte une expansion spectaculaire du nombre de cellules B de liaison d'antigène in vivo, avec les cellules transférées attributives B BCR bénéficiaires avec la possibilité de présenter un antigène spécifique de l'antigène-spécifiques CD4 (+) des cellules T.

L'activation De La Cathepsine D Par Glycosaminoglycanes

Nous avons précédemment montré que l'héparine peut augmenter l'activité de la forme proenzyme la maladie d'Alzheimer bêta-site de la protéine précurseur amyloïde enzyme de clivage 1 (BACE1). Cathepsine D (CD) est un élément de la famille des protéases aspartiques et a une similarité de séquence d'BACE1. Par conséquent, nous avons examiné si les glycosaminoglycanes héparine et d'autres (GAG) peuvent influencer l'activité de CD. GAG héparine et d'autres ont été trouvés pour stimuler l'activité de PROCD recombinant. Désulfatation de l'héparine a pratiquement aboli la stimulation, ce qui indique que les groupes de sulfate étaient importants pour l'effet stimulant. En outre, la stimulation était dépendante de la longueur de la chaîne GAG, que les grandes GAG ont été plus puissants dans leur capacité à stimuler PROCD que des fragments plus courts. En présence d'héparine, limitée protéolyse autocatalytique de la proenzyme a été augmenté, ce qui suggère que l'héparine augmente l'activité de PROCD en accélérant la conversion de PROCD, qui a peu d'activité, à pseudoCD, une forme active manque résidus 1-26 sur la prodomaine. En outre, l'activité de la rate dérivé CD matures, qui manque de l'ensemble de 44 prodomaine résidu d'acide aminé, a également été augmenté par l'héparine, ce qui indique que le domaine catalytique de CD-ROM contient au moins une région à laquelle GAG ​​lier et de stimuler l'activité enzymatique. Parce que l'héparine a également stimulé l'activité de pseudoCD, l'activation a été probablement accéléré proenzyme par l'interaction de l'héparine avec le domaine catalytique de pseudoCD. Cependant, il est possible que l'héparine peut également activer la proenzyme directement. Sur la base de cette étude, nous proposons que GAG ​​peut réguler l'activité in vivo de CD.

Interaction Entre Remodelage De La Chromatine Et Les Changements épigénétiques Pendant Lineage Spécifique Engagement à Granzyme B Expression

Le rôle de remodelage de la chromatine et modifications post-traductionnelles des histones et comment ils sont intégrés pour contrôler l'expression des gènes lors de l'acquisition de la cellule des fonctions spécifiques est mal comprise. Nous montrons ici que, suite à l'activation in vitro des lymphocytes CD4 (+) et CD8 (+) des lymphocytes T, les deux types cellulaires montrent une perte rapide de l'histone H3 au granzyme B (gzmB) région promotrice proximale. Cependant, malgré le promoteur gzmB proximale train d'être rénové dans les deux sous-ensembles de lymphocytes T, seul CD8 (+) des cellules T expriment des niveaux élevés de gzmB et afficher un profil distinct des principaux marques épigénétiques, notamment différentielle acétylation de H3 et la méthylation. Ces données suggèrent que des niveaux élevés de la transcription de se produire un ensemble distinct de modifications des histones doit être établi dans plus de la perte des histones au niveau du promoteur proximal de gzmB.

Immunologie Et Biologie Cellulaire De Publication De L'année 2008

Règlement De L'histidine Riche En Glycoprotéine (HRG) Fonction Via Clivage Protéolytique Par La Plasmine Médiation

Le système plasminogène / plasmine est impliqué dans une variété de processus physiologiques normaux et pathologiques, y compris le remodelage des tissus, l'angiogenèse et la métastase des tumeurs. Activateurs du plasminogène et les récepteurs pour plasminogène / plasminogène activateurs sont essentiels pour la transformation du plasminogène en plasmine former l'sérine protéase connexion. Plasmine peut à son tour réguler positivement ou négativement l'activation du plasminogène en outre par l'intermédiaire plasmine clivage médié par des récepteurs activateurs et. HRG (riche en histidine glycoprotéine), une abondance relative (environ 100 à 150 pg / ml) glycoprotéine plasmatique, a une structure multi-domaine qui peut interagir avec des ligands, y compris plusieurs Zn 2 +, l'héparine, SH (sulfate d'héparane) et le plasminogène. HRG a été montré pour fonctionner comme une molécule adaptatrice au plasminogène d'attache pour GAG (glycosaminoglycanes) les surfaces portantes et de réglementer l'activation du plasminogène par l'intermédiaire de divers mécanismes. Comme lui-même HRG est sensible à la plasmine clivage, la présente étude examine en détail le clivage de HRG humaine par la plasmine et l'effet de ce clivage sur les fonctions diverses de HRG. Des fragments HRG, générées par clivage plasmine, sont maintenues ensemble par des liaisons disulfure et ne sont pas libéré de la molécule sous des conditions non réductrices. Plasmine clivage médié partiellement inhibée HRG HRG se liant à la surface des cellules HS, mais amélioré la liaison aux cellules nécrotiques et de plasminogène. Toutefois, à la fois intact et plasmine-clivée HRG augmente la liaison du plasminogène à l'héparine surfaces revêtues d'une mesure similaire. En outre, la présence d'héparine, Zn 2 + ou pH acide a été trouvée pour protéger HRG de clivage plasmine. Ainsi le clivage protéolytique de HRG par la plasmine peut fournir un mécanisme de rétroaction pour réguler les effets de HRG sur le système plasminogène / plasmine et d'autres fonctions de HRG.

Partage Récepteur De Cellules T Par Les Lymphocytes T Cytotoxiques Facilite Le Contrôle Efficace Du Virus

Une caractéristique remarquable du système immunitaire adaptatif est la vitesse à laquelle un petit nombre de lymphocytes spécifiques de l'antigène peut négocier une réponse immunitaire efficace. L'expansion rapide de T et B clones de lymphocytes qui possèdent des récepteurs spécifiques d'un antigène particulier est l'un des principaux moyens par lesquels une réponse rapide est généré. Bien qu'une grande partie de cette expansion clonale est causée par la division de cellules spécifiques de l'antigène, ici, nous démontrons un mécanisme supplémentaire par lequel le pool de cellules T effectrices contre une infection virale peut rapidement agrandir. Nos données montrent que le virus-CD8 + spécifiques de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) peuvent transférer leurs récepteurs des cellules T (TCR) au destinataire CTL d'une spécificité non lié qui, par conséquent, gagner la spécificité de l'antigène de la cellule T du donneur. Ce processus se produit en quelques minutes via la membrane échangeuse et les résultats dans le CTL destinataire acquérir la capacité à reconnaître et à éliminer les cellules ciblées par le TCR des bailleurs de fonds, tout en conservant la spécificité antigénique de son propre TCR. Partage un tel récepteur permet rapide, la prolifération indépendante expansion de virus spécifiques à des clones de cellules T de basse fréquence et joue un rôle très important antiviral qui peut protéger l'hôte contre une infection mortelle autrement.

Le Répresseur Transcriptionnel De Bcl-6 Dirige T Helper Folliculaire Lignée Cellulaire Engagement

Folliculaires T helper (TFH) des cellules de fournir des signaux de sélection pour les cellules germinales centre B, ce qui est essentiel pour les réponses d'anticorps à vie longue. Haute et basse CXCR5 CCR7 expression facilite leur ralliement aux follicules de cellules B et les distingue des T helper 1 (Th1), Th2, et les cellules Th17. Ici, nous avons montré que Bcl-6 dirige la différenciation des cellules TFH: les cellules T Bcl-6-déficientes échoué à se développer en cellules TFH et ne pouvait pas soutenir des réponses du centre germinatif, tandis que l'expression forcée de Bcl-6 de CD4 (+) des cellules T promu expression des molécules de cachet des cellules TFH CXCR5, CXCR4, et PD-1. Bcl-6 lié à des promoteurs de la réglementation des cellules Th1 et Th17 transcription T-bet et RORgammat et réprimé l'IFN-gamma et IL-17 de production. Bcl-6 a également expression refoulée de microARN (miARN nombreux) prédit pour contrôler la signature cellule Tfh, y compris miR-17-92, qui réprimée CXCR5 expression. Ainsi, Bcl-6 dirige positivement la différenciation des cellules Tfh, par la répression combinée des miARN et des facteurs de transcription.

Ciblée De Livraison Liposomale De TLR9 Ligands Active Immunité Antitumorale Spontanée Dans Un Modèle De Cancer Autochtone

Accessibilité des tumeurs pour le traitement local très efficace représente un défi majeur pour la thérapie anticancéreuse. Oligodésoxynucléotides immunostimulant (ODN) avec des motifs CpG sont des ligands de TLR9, où l'immunité antitumorale spontanée premier, mais ils sont moins efficaces lorsqu'ils sont appliqués de manière systémique. Nous avons donc développé un agent à base de liposomes pour la livraison sélective d'ODN-CpG dans l'environnement tumoral. Un peptide qui cible spécifiquement les cellules endothéliales angiogéniques dans un modèle de tumeur des îlots de Langerhans transgéniques pour la cancérogenèse a été greffé en CpG ODN-liposomes contenant. L'injection intraveineuse de ces liposomes a entraîné une accumulation spécifique autour des vaisseaux tumoraux, ont augmenté l'absorption par la tumeur-résidents macrophages, et le maintien dans le temps. En revanche, les liposomes non ciblés ne se localiser au niveau de la vascularisation de la tumeur. Par conséquent, seul ciblage vasculaire de CpG ODN-liposomes a provoqué une réponse inflammatoire au niveau des parois du navire dans le renforcement de CD8 (+) et CD4 (+) infiltration de cellules T et, surtout, l'activation de spontanée, spécifique de la tumeur cytotoxicité. Dans un cadre thérapeutique, 40% des porteurs de tumeurs, les souris transgéniques ont survécu au-delà de la semaine 45 après l'administration systémique d'origine vasculaire dirigées CpG ODN-liposomes. En revanche, les souris témoins ont survécu jusqu'à 30 sem. L'efficacité thérapeutique a été encore améliorée en augmentant la fréquence des tumeurs spécifiques des cellules effectrices par des transferts adoptifs. Les cellules NK et T CD8 (+) des cellules T effecteurs majeurs qui étaient mort cellulaire induite par la tumeur et a agi en conjonction avec des effets antivasculaires. Ainsi, une tumeur de ralliement avec CpG ODN-liposomes chargés est aussi puissant que l'injection directe de libre CpG-ODN et a le potentiel de surmonter certaines limitations majeures de classique ODN-CpG monothérapie.

Utilisation De La CFSE Dye Fluorescent Intracellulaire Pour Surveiller La Migration Des Lymphocytes Et La Prolifération

L'incorporation stable du colorant fluorescent intracellulaire 5 - (et -6)-carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) dans les cellules fournit un outil puissant pour surveiller la migration des cellules, et de quantifier la division cellulaire, en raison de la baisse séquentielle de marquage fluorescent à la fille cellules. Lymphocytes CFSE-étiquetés ont été utilisés pour analyser la relation entre la division cellulaire et la différenciation de la fonction cellulaire et la prolifération cellulaire par rapport à l'apoptose, à la fois in vivo et in vitro, et ont permis l'analyse du site de la réponse à des antigènes in vivo.

Échange Dynamique Variant D'histone Accompagne L'induction De Gènes Dans Les Cellules T

Changements dans la composition de chromatine sont souvent une condition préalable à l'induction de gènes. Non alléliques des histones variantes ont récemment émergé comme des acteurs clés dans le contrôle transcriptionnel et la modulation chromatine. Bien que les changements dans l'accessibilité et la chromatine modification post-traductionnelle des histones (PTM) qui accompagnent la distribution induction de gènes sont bien documentés, les dynamiques d'échange variant d'histone qui ces événements parallèles sont encore mal définies. Dans cette étude, nous avons examiné les changements dans la répartition variant d'histone qui accompagnent l'activation de la CD69 et inductible des gènes dans les cellules T héparanase. Nous démontrons que les augmentations d'accessibilité chromatine qui accompagnent l'induction de ces deux gènes ne sont pas associés à une perte nucléosome mais sont mis en parallèle par des changements dans la répartition variant d'histone. Plus précisément, l'induction de ces gènes a été de pair avec l'appauvrissement de la variante de H2A.Z histone et le dépôt concomitant de H3.3. En outre, H3.3 dépôt a été accompagnée de changements dans les modes compatibles avec PTM H3.3 enrichissement ou appauvrissement PTM différents lors de la constitution dans la chromatine. Néanmoins, nous présentons des preuves que ces MEA H3.3 d'origine peut être annulé par recrutés activités enzymatiques. A partir de ces observations, nous proposons que H3.3 dépôt peut à la fois de faciliter l'accessibilité de la chromatine par des augmentations nucléosomes déstabilisation et de rivaliser avec recrutés modificateurs histones à modifier les modèles PTM lors de l'induction de gènes.

Immunologie Et Biologie Cellulaire De Publication De L'année 2009

Fonctions Glycoprotéine Riche En Histidine En Collaboration Avec La Surface Cellulaire Héparane Sulfate Sur Les Phagocytes Pour Promouvoir L'adoption Des Cellules Nécrotiques

Les cellules mourantes, comme les cellules apoptotiques et nécrotiques, sont rapidement éliminés à partir du site de la mort cellulaire pour prévenir l'exposition des antigénique intracellulaire et molécules immunostimulantes qui peuvent provoquer des lésions tissulaires ou de faciliter le développement de maladies auto-immunes. Pour le système immunitaire à reconnaître et à éliminer les cellules mortes de manière efficace, les phagocytes professionnels utilisent une variété de mécanismes qui permettent de distinguer les cellules saines à partir de cellules qui meurent. HRG, une héparine relativement abondante / HS-binding protein dans le plasma humain, a été montré récemment pour attacher IgG spécifiquement aux cellules nécrotiques et aider l'absorption phagocytaire des cellules nécrotiques par une voie FcgammaRI-dépendante. Dans cette étude, nous fournissent des preuves directes que HRG peut fonctionner en collaboration avec HS surface de la cellule sur la lignée cellulaire monocytaire THP-1 pour favoriser l'élimination des cellules nécrotiques. En outre, nous avons constaté que la présence de l'héparine peut inhiber nettement améliorée HRG-élimination des cellules nécrotiques par cellules THP-1, peut-être en bloquant la capacité de HRG d'interagir avec des cellules nécrotiques ainsi que les cellules THP-1. Ainsi, ces données suggèrent que HRG peut aider à la phagocytose des cellules nécrotiques par une voie dépendante de HS, et ce processus peut être réglé par la présence de ligands HRG certains, tels que l'héparine.

Une Thrombopénie Médicamenteuse: Développement D'un Roman NOD / Modèle De Souris SCID Pour évaluer Apurement Des Plaquettes Circulantes Par La Drogue Dépendants Anticorps Et L'efficacité Des IgIV

Induite par les médicaments thrombopénie immune (DITP) est un effet indésirable médiée par les anticorps toxicomanes. Les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) est fréquemment utilisé pour traiter DITP et primaire thrombopénie immune (PTI). Malgré IgIV éprouvées de effets bénéfiques dans le PTI, son efficacité dans DITP n'est pas claire. Nous avons établi un diabétique non obèse / combiné sévère modèle immunodéprimé souris (NOD / SCID) des DITP dans lequel les plaquettes humaines survivre pendant plus de 24 heures, permettant le passage des plaquettes par dITP / ITP anticorps à étudier. Rapide jeu de plaquettes humaines a été observée de façon uniforme avec tous les thrombocytopénie induite par la quinine (QITP) sérums de patients étudiés (moyenne la durée de vie des plaquettes: QITP 1,5 ± 0,3 heures vs 16,5 ± 4,3 contrôle heures), compatible avec la présentation clinique de DITP. En revanche, les taux de classement avec des anticorps anti-PTI étaient plus variables. IgIV traitement partiellement empêché la clairance des plaquettes par des anticorps dITP et ITP. Nos résultats suggèrent que le NOD / modèle de souris SCID est utile pour étudier l'efficacité des thérapies dITP actuels et futurs, un domaine dans lequel il ya peu de preuves expérimentales pour guider le traitement.

Glycoprotéine Riche En Histidine Lié Héparanase Et Régule Son Activité Enzymatique Et Les Interactions De Surface Cellulaire

Héparanase, une endo-beta-D-glucuronidase, est impliqué dans de nombreux processus physiologiques normaux et pathologiques, tels que la cicatrisation l'inflammation, et la tumeur métastatique / angiogenèse, grâce à sa capacité de médiation de la dégradation de l'héparane sulfate, un composant clé de la structure du la matrice extracellulaire et à la surface de cellules. Identifier les molécules endogènes qui peuvent réguler l'activité héparanase aidera la compréhension de sa fonction moléculaire en matière de santé et de la maladie et de fournir le potentiel pour le développement de nouveaux traitements anti-cancéreux et anti-inflammatoire. La capacité de l'héparanase extracellulaire d'attache sur les protéoglycanes de sulfate de surface de cellules et d'héparane récepteurs autre (s), tels que le cation-indépendante du mannose-6-phosphate, est la clé de son activation, la fonction et l'absorption dans des compartiments intracellulaires. Ici, nous décrivent des expériences démontrant que la glycoprotéine plasmatique relativement abondante, riche en histidine glycoprotéine, interagit directement avec platelet-derived héparanase et renforce son activité enzymatique. Les conclusions de cette étude montrent également que la glycoprotéine riche en histidine interfère avec héparanase se liant aux récepteurs de surface cellulaire, sulfate protéoglycanes héparanes particulier. Ainsi, l'interaction entre la glycoprotéine riche en histidine et héparanase peuvent potentiellement réglementer le rôle des héparanase dans une variété de conditions physiologiques et pathologiques.

Macrophage Sinon Activé Posséder Cytotoxicité Anti-tumorale Qui Est Induite Par L'IL-4 Et Médiatisé Par Arginase-1

Des études antérieures ont montré que le transfert adoptif de Th2 polarisées cellules T CD4 peut effacer des tumeurs établies chez la souris d'une manière spécifique de l'antigène. Bien que les éosinophiles ont été impliqués dans ce processus, le mécanisme exact de la clairance de la tumeur et les cellules immunitaires effectrices qui ont été impliqués, restent à définir. Par conséquent, les expériences ont été menées pour élucider le mécanisme de médiation Th2-destruction des cellules de mélanome B16-F1 en examinant in vitro activité antitumorale de leucocytes dans un infiltrat inflammatoire de type-2. Les données expérimentales montrent que l'activation des macrophages activés alternativement (aaMacs) dans type 2 s'infiltre par l'IL-4 ou IL-13 peut inhiber B16-F1 prolifération de cellules de mélanome à travers un mécanisme qui dépend de l'arginase-1 épuisement de la L-arginine dans le microenvironnement des cellules tumorales. Il est intéressant, tandis que plus à E: les ratios T AAMAC ont présenté une activité antitumorale, à moindre E: T aaMacs ratios ont été observés à améliorer, plutôt que de l'inhiber B16-F1 de croissance de cellules de mélanome. Cela met en évidence l'équilibre délicat entre la stimulation des propriétés antitumorigenic et protumorigenic de aaMacs dans les protocoles d'immunothérapie tumorales.

Héparanase Dans Les Ostéoblastes Humains Primaires

Héparanase (HPSE) est connue pour être impliquée dans la réparation des fractures chez la souris, mais sa présence et la fonction dans la formation de l'os humain reste incertaine. Notre objectif était de déterminer l'expression de HPSE dans l'os humain formant ostéoblastes et de mieux comprendre son rôle dans l'ostéogenèse. Expression de la protéine et l'activité enzymatique HPSE ont été démontrées dans les ostéoblastes isolés à partir d'échantillons d'os trabéculaire de patients atteints d'ostéoporose (OP) et de sujets sains, bien que les niveaux différaient de façon marquée. Ainsi, de faibles niveaux d'expression HPSE ont été observées dans les ostéoblastes ostéoporotiques, y compris dans le noyau par rapport à celles de sujets sains. Notamment, l'expression des gènes HPSE a été associée à la phosphatase alcaline (ALP) l'activité, le marqueur du remodelage osseux. Études sur le profil des gènes a démontré que les gènes étaient régulés à la baisse ostéogéniques dans les ostéoblastes ostéoporotiques. Nous avons en outre exposée à des ostéoblastes HPSE exogène et a constaté que le niveau de phosphorylation des histones H3 a été augmenté. Nous apportons des preuves, pour la première fois, démontrant que HPSE exprime et fonctions dans les ostéoblastes humains. Nos données suggèrent que la loupe en fonction de HPSE médiée ostéoblastogenèse par la réglementation de l'expression du gène ostéogénique et histone H3 modification. Régulation à la hausse HPSE peut être une nouvelle approche thérapeutique dans la prévention et le traitement de l'OP.

A Novel Fluorescent Assay Basé Révèle Que Thrombopoïétine De Signalisation Et De Bcl-X (L) Influence, Respectivement, La Durée De Vie Des Plaquettes Et Des érythrocytes

Les facteurs qui déterminent la durée de vie des plaquettes et des érythrocytes ne sont pas complètement compris, malgré une étude approfondie. Le manque de succès peut être attribué à des méthodes utilisées pour mesurer la cinétique de la durée de vie, qui tous nécessitent un traitement des cellules avant l'analyse, et l'utilisation incohérente et potentiellement inapproprié de modèles mathématiques pour l'analyse des données. Le but de cette étude était d'établir une méthode d'étiquetage in vivo des plaquettes et des érythrocytes à l'aide carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE), déterminer le modèle le plus approprié pour l'analyse mathématique durée de vie, et s'appliquent à la fois à l'étude des facteurs qui contrôlent la durée de vie des plaquettes et des érythrocytes.

Glycoprotéine Riche En Histidine Est Une Molécule Innovante De Plasma Pattern Recognition Qui Recrute IgG Pour Faciliter Le Dédouanement Des Cellules Nécrotiques Via FcgammaRI Sur Les Phagocytes

Sous des conditions physiologiques normales, les cellules nécrotiques résultant de lésions tissulaires sont rapidement éliminés de la circulation et des tissus par les phagocytes, empêchant ainsi l'exposition des antigénique intracellulaire et molécules immunostimulantes qui peuvent aider le développement de la maladie auto-immune. Glycoprotéine riche en histidine (HRG), une glycoprotéine plasmatique relativement abondante, a une structure multidomaine qui peut interagir avec de nombreux ligands, y compris les composants des systèmes fibrinolytiques et le système immunitaire. Récemment, il a été rapporté que HRG peut se lier fortement à un ligand cytoplasmique (s) exposés dans les cellules nécrotiques pour améliorer la clairance par les phagocytes. Nous décrivons ici les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus. Un complexe comprenant à la fois HRG et l'immunoglobuline G (IgG) a été trouvée comme nécessaire pour faciliter l'absorption cellulaire nécrotique par les monocytes, essentiellement par l'intermédiaire d'un mécanisme FcgammaRI-dépendante. Les conclusions de cette étude montrent également que HRG peuvent potentiellement interagir avec les phospholipides anioniques exposés dans les cellules nécrotiques. En outre, la phagocytose accrue des cellules nécrotiques induites par HRG-IgG déclenche les phagocytes pour libérer des cytokines pro-inflammatoires comme l'interleukine-8 et du facteur de nécrose tumorale. Ainsi, HRG a la propriété unique de se complexer avec des IgG et de faciliter une pro-inflammatoire réponse immunitaire innée pour promouvoir le jeu de cellules nécrotiques.

Reprise Du Phénotype Glycolytique Par Dichloroacétate Inhibe La Croissance Des Cellules Métastatique Du Cancer Du Sein in Vitro Et in Vivo

Le phénotype glycolytique est un phénomène répandu dans les formes de cancer solides, y compris le cancer du sein. Dichloroacétate (DCA) a récemment été proposé comme un roman et relativement non toxique agent anti-cancéreux qui peuvent inverser le phénotype glycolytique dans les cellules cancéreuses par l'inhibition de la kinase pyruvate déshydrogénase. Nous avons examiné l'effet de DCA contre les cellules cancéreuses du sein, y compris dans un très métastatique modèle in vivo. La croissance des lignes cellulaires du cancer du sein de plusieurs a été trouvé à être inhibée par la DCA in vitro. Un examen plus approfondi de 13762 cellules de rat adénocarcinome MAT mammaires trouvé que l'inversion du phénotype glycolytique par la DCA en corrélation avec l'inhibition de la prolifération sans aucune augmentation de la mort cellulaire. Et ce, malgré une augmentation faible mais significative de la caspase 3/7 l'activité, ce qui peut sensibiliser les cellules cancéreuses à d'autres déclencheurs de l'apoptose. In vivo, la DCA a provoqué une réduction de 58% du nombre de métastases pulmonaires observées macroscopiquement après l'injection de cellules 13762 MAT dans la veine de la queue de rats (P = 0,0001, n> ou = 9 par groupe). Ces résultats démontrent que le DCA a propriétés anti-prolifératives, en plus de propriétés pro-apoptotiques, et peut être efficace contre la maladie métastatique très in vivo, en soulignant son potentiel pour une utilisation clinique.

Importer Nucléaire De La Croissance Rapide De Réponse-1 Comporte Importin-7 Et Le Signal De Localisation Nucléaire Novel Sérine-proline-sérine

Une séquence de trois acides aminés, Ser / Thr-Pro-Ser / Thr, a été récemment identifié et caractérisé comme un signal de localisation nucléaire roman (Chuderland et al., 2008). Le produit du gène précoce immédiat, la croissance au début de réponse-1 est un doigt de zinc contenant trois facteur de transcription impliqué dans une grande variété de pathologies, et dispose d'un domaine de localisation nucléaire bipartite identifié il ya deux décennies. Efficaces de localisation nucléaire de Egr-1 est vital à sa fonction en tant que facteur de transcription. Fait intéressant, Egr-1 contient également un C-terminale du domaine SPS (résidus 482-484 dans murin Egr-1). Nous avons supposé que (482) SPS (484) peut aussi servir comme un signal de localisation nucléaire roman en Egr-1. Nous avons constaté que cette séquence dirige Egr-1 dans le noyau en transfectées cellules ovariennes de hamster chinois et de montrer par co-immunoprécipitation analyse qui Egr-1 forme un complexe avec importine-7. (482) SPS (484) est nécessaire pour l'interaction Egr-1 avec importine-7. En outre, importine-7 knockdown avec l'ARNi a montré que Egr-1 est la translocation nucléaire importine-7-dépendante. Cette étude démontre que la translocation nucléaire de Egr-1 est en partie tributaire de (482) SPS (484) et implique importine-7, et nous éclaire sur les mécanismes moléculaires régulant la localisation cellulaire de ce facteur de transcription physiopathologique important.

Protein Kinase Chromatine Associée à C-θ Réglemente Un Programme D'expression Inductible Des Gènes Et MicroARN Dans Les Lymphocytes T Humains

Les études chez la levure montrent que les kinases de signalisation ont un rôle étonnamment active dans le noyau, où ils attache à la chromatine et de moduler les programmes d'expression génique. En dépit de ces études fondamentales, le mécanisme de signalisation nucléaire de la façon dont la transcription de contrôle kinases de gènes de mammifères est à ses balbutiements. Ici, nous apportons la preuve d'une fonction jusque-là inconnu de la protéine kinase C thêta (PKC-θ), qui s'associe physiquement avec les régions régulatrices des gènes inductibles de la réponse immunitaire des cellules T humaines. Chromatine ancrée PKC-θ forme un complexe actif nucléaire en interagissant avec l'ARN polymérase II, l'histone kinase MSK-1, et la molécule adaptatrice 14-3-3ζ. ChIP-on-chip révèle que la PKC-θ lie aux promoteurs et aux régions transcrites des gènes, ainsi qu'aux promoteurs de microARN qui sont cruciaux pour la régulation des cytokines. Nos résultats fournissent une explication moléculaire pour le rôle de la PKC-θ non seulement dans la fonction des cellules T normales, mais aussi dans des circonstances de son expression ectopique dans le cancer.

Une Synthèse One-pot Et De L'activité Biologique Des Ageladine A Et Analogues

Une synthèse d'un pot de ageladine A et analogues sont signalés. La clé Pictet-Spengler réaction entre aldéhydes 2-aminohistamine et aryle a bien été utilisé pour la synthèse du produit naturel et 14 analogues. Ces composés ont été sélectionnés pour leur métalloprotéase matricielle (MMP) et inhibition de la kinase de développer le premier relation structure-activité de ageladine A analogues. Un composé, qui a montré une activité kinase significatif mais peu l'activité des MMP inhibitrice, a été jugée très actif dans un écran anti-angiogénique, suggérant que l'activité angiogénique des ageladine A n'est pas associée à une inhibition de MMP mais plutôt kinase activité inhibitrice. La cytotoxicité a été exclu en tant que mode d'action par le dosage de ageladine A et un analogue contre 60 lignées cellulaires humaines.

L'homologue De Levure De L'hème Oxygénase-1 Offre Une Protection Antioxydante Cellulaire Via La Régulation Transcriptionnelle De Gènes Antioxydants Connus

Hème oxygénase-1 (HO-1) se dégrade l'hème et protège les cellules de défi oxydatif. Cette activité antioxydante est pensé pour résulter de l'activité HO-1 enzymatique, qui se manifeste par une diminution de la concentration de l'hème substrat pro-oxydant, et une augmentation de la bilirubine produit antioxydant. En utilisant une approche globale de la transcription, et la levure comme modèle, nous montrons que HO-1 offre une protection cellulaire via la régulation positive de transcrits codant pour des enzymes impliquées dans la défense antioxydante cellulaire, plutôt que par son activité oxygénase. Comme les cellules de mammifères, de levure répond à un stress oxydatif en exprimant son homologue HO-1 et, par rapport au type sauvage, l'hème oxygénase-nulles cellules mutantes ont une sensibilité accrue envers les oxydants qui est sauvé par la surexpression de HO-1 humain ou de son homologue de levure. La sensibilité accrue oxydant de l'hème oxygénase-nulles des cellules mutantes est expliqué par une diminution de l'expression de gènes codant pour l'γ-glutamylcystéine synthétase, la glutathion peroxydase, la catalase, et la réductase sulfoxyde de méthionine, parce surexpression de l'un de ces gènes permet partielle, et la surexpression de tous les quatre gènes fournit une protection complète et le mutant nul. Les gènes codant pour des enzymes anti-oxydantes ne représentent qu'une petite partie des 480 gènes différentiellement exprimés dans l'hème oxygénase-nulles mutants. Régulation de la transcription peut être expliquée par la localisation nucléaire de l'hème oxygénase observée dans les cellules-oxydant contestées. Nos résultats remettent en question la notion selon laquelle HO-1 fonctions, il suffit que d'une enzyme catabolique et antioxydant. Ils indiquent les fonctions beaucoup plus larges pour HO-1, le dénouement de ce qui peut aider à expliquer les réponses multiples biologiques rapportés chez les animaux à la suite de modifications de l'expression de HO-1.

Glycoprotéine Riche En Histidine: Le Couteau Suisse Du Plasma Des Mammifères

Glycoprotéine riche en histidine (HRG), également connu sous le nom histidine-proline-riche glycoprotéine, est une protéine abondante et bien caractérisé du plasma chez les vertébrés. HRG a une structure multi-domaine qui permet la molécule d'interagir avec des ligands, y compris plusieurs héparine, les phospholipides, du plasminogène, du fibrinogène, de l'immunoglobuline G, C1q, hème et Zn ² (+). La capacité de HRG d'interagir avec différents ligands simultanément a suggéré que HRG peut fonctionner comme une molécule adaptatrice et de réglementer de nombreux processus biologiques importants, tels que le complexe immun / nécrotique cellules / agent pathogène jeu, l'adhésion cellulaire, l'angiogenèse, la coagulation et la fibrinolyse. Le présent examen couvre les rôles proposés multifonctionnels de HRG avec un accent sur les récentes découvertes qui ont conduit à son émergence comme un régulateur clé de l'immunité et de la biologie vasculaire. On y trouve aussi une discussion sur les similitudes frappantes entre les fonctionnels et d'autres importants HRG protéines multifonctionnelles trouvés dans le plasma, comme la protéine C réactive, C1q, β ₂ glycoprotéine I, et la thrombospondine-1.

Yin Yang-1 Inhibe La Croissance Cellulaire Tumorale Et Inhibe P21WAF1/Cip1 Formation De Complexe Avec CDK4 Et Cycline D1

Le zinc-GLI Krüppel doigt facteur yin yang-1 (YY1) est une protéine complexe qui régit une variété de processus, y compris la transcription, la prolifération, le développement et la différenciation. YY1 inhibe la croissance cellulaire dans une cellule spécifique de type manière. Le rôle joué par YY1 dans son contrôle de la croissance des cellules tumorales n'est pas claire et controversée. Nous montrons ici que YY1 peut inhiber la croissance des différents types de cellules tumorales in vitro, y compris les cellules humaines de cancer du sein et des cellules de glioblastome. YY1 également bloqué la croissance de 13762 isogreffes MAT adénocarcinome mammaires chez les rats. YY1 inhibé la croissance tumorale 13762 MAT d'environ 80% par rapport au groupe GFP seule 21 jours après l'injection. YY1 inhibé la prolifération de cellules antigène nucléaire (PCNA) expression et la phosphorylation pRbSer249/Thr252 sans influencer la densité microvasculaire tumorale. En outre, YY1 inhibée p21WAF1/Cip1 formation de complexe avec la cycline D1 et CDK4. Ces résultats démontrent que YY1 peut réguler négativement la croissance de plusieurs types de cellules malignes.

Héparane Sulfate Et L'héparanase Jouent Un Rôle Clé Dans La Survie Cellulaire Et La Souris β Diabète Auto-immun

Le type 1, diabète auto-immune (DT1) qui naît spontanément chez la souris NOD est considéré comme un modèle du DT1 chez l'homme. Elle est caractérisée par l'invasion des îlots pancréatiques par les cellules mononucléaires (MNC), ce qui conduit finalement à la destruction des cellules ß productrices d'insuline. Bien que dépendant des cellules T, les mécanismes moléculaires de déclenchement mort cellulaire β n'ont pas été entièrement élucidé. Ici, nous déclarons que d'un glycosaminoglycane, l'héparane sulfate (HS), est exprimée à des niveaux extraordinairement élevés au sein des îlots de souris et est essentielle pour la survie des cellules β. In vitro, les cellules ß rapidement perdu leur HS et il est mort. La mort cellulaire β a été empêché par le remplacement du SH, un traitement qui a également rendu les cellules ß résistant aux dommages causés par les ROS. In vivo, la destruction auto-immune des îlots de souris NOD a été associée à la production de l'héparanase catalytiquement actif, une enzyme HS-dégradant, par îlot infiltrant les multinationales et la perte de l'îlot HS. En outre, le traitement in vivo avec l'inhibiteur de héparanase PI-88 conserve intraislet HS et des souris NOD protégées de DT1. Nos résultats identifiés SH comme une exigence essentielle pour la survie moléculaire de cellules d'îlots β et de la dégradation du SH comme un mécanisme de destruction des cellules β. Nos résultats suggèrent que la préservation de l'îlot HS pourrait être une stratégie thérapeutique pour la prévention DT1.

Analyses De Calcul Des Sites Catalytiques Et Liaison à L'héparine Et De Leurs Interactions Avec Les Glycosaminoglycanes Dans La Famille Glycoside Hydrolase 79 Endo-β-D-glucuronidase (héparanase)

Héparanase mammifère est une endo-β-glucuronidase associé à l'invasion des cellules dans les métastases du cancer, l'angiogenèse et l'inflammation. Héparanase protéoglycanes clive sulfate d'héparane dans la matrice extracellulaire et la membrane basale, en libérant des oligosaccharides de sulfate d'héparine / héparane d'une taille appréciable. Cela provoque la libération de facteurs de croissance, qui accélèrent la croissance tumorale et les métastases. Héparanase a deux domaines de liaison des glycosaminoglycanes, mais aucune information sur la structure tridimensionnelle est disponible pour héparanase humaine qui peut fournir des indications sur la façon dont les deux domaines interagissent pour dégrader fragments d'héparine. Nous avons construit un modèle d'homologie nouvelle héparanase qui prend en compte les données les plus récentes structurelles et de la bioinformatique disponibles. Analogues et des mimétiques d'héparine ont été glycosaminoglycane calcul amarré dans le site actif avec des conformations annulaires énergiquement stables et leurs énergies d'interaction ont été comparés. Les structures qui en résultent à quai ont été utilisées pour proposer un modèle de sélectivité et de substrats conformère basé sur les dimensions du site actif. L'amarrage de substrats et inhibiteurs indique l'existence d'un des sites de liaison à grande s'étendant au moins deux unités saccharidiques au-delà du site de clivage (direction de l'extrémité non réductrice) et au moins trois saccharides vers l'extrémité réductrice (vers l'héparine site de liaison 2). L'amarrage de substrats indique que héparanase reconnaît les glucosamines N-sulfatés et O-sulfaté à sous-site 1 et de l'acide glucuronique au site de clivage, alors qu'en l'absence de la 6-O-sulfatation dans la glucosamine, l'acide glucuronique est ancré au sous-site 2 . Ces résultats nous aideront à mettre l'accent sur la conception rationnelle de molécules inhibitrices de héparanase pour le développement de médicaments anticancéreux en ciblant l'héparine deux / domaines d'héparane sulfate de reconnaissance.

Heparanase and Vascular Endothelial Growth Factor Expression is Increased in Hypoxia-induced Retinal Neovascularization

Heparanase and VEGF are related closely to angiogenesis in cancer. The purpose of our study was to evaluate the expression and correlation of heparanase and VEGF in hypoxia-induced retinal neovascularization.

Platelets and P-selectin Control Tumor Cell Metastasis in an Organ-specific Manner and Independently of NK Cells

The prometastatic role of platelets has long been recognized with proposed mechanisms of action including shielding tumor cells from natural killer (NK) cell destruction and aiding endothelial attachment and extravasation of tumor cells with platelet P-selectin being implicated in these processes. However, many aspects of the prometastatic function of platelets remain unclear. In this study, we used mouse models of metastatic breast cancer and melanoma to investigate the platelet effect, focusing on organ specificity, the relationship with NK cells and the relative importance of platelet-derived versus endothelial-derived P-selectin. We found that platelets promote lung metastasis in the absence of NK cells in both acute and spontaneous metastasis models. In addition, the prometastatic action of platelets was found to be organ specific, clearly enhancing lung metastasis but not affecting B16F1 liver metastasis, in fact, liver metastasis was enhanced in the absence of platelets. Furthermore, the profound antimetastatic activity of NK cells was equally effective in the presence or absence of platelets and chronologically distinct from the prometastatic role of platelets. Finally, it was shown that endothelial-derived P-selectin is just as important as platelet-derived P-selectin in promoting lung metastasis and also plays an important role in liver metastasis. Taken together, our findings help clarify the roles of platelets, NK cells and P-selectin in metastasis, and they identify P-selectin as an attractive therapeutic target for preventing metastasis in multiple organs.

Reduced Retinal Microvascular Density, Improved Forepaw Reach, Comparative Microarray and Gene Set Enrichment Analysis with C-jun Targeting DNA Enzyme

Retinal neovascularization is a critical component in the pathogenesis of common ocular disorders that cause blindness, and treatment options are limited. We evaluated the therapeutic effect of a DNA enzyme targeting c-jun mRNA in mice with pre-existing retinal neovascularization. A single injection of Dz13 in a lipid formulation containing N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl-sulfate and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine inhibited c-Jun expression and reduced retinal microvascular density. The DNAzyme inhibited retinal microvascular density as effectively as VEGF-A antibodies. Comparative microarray and gene expression analysis determined that Dz13 suppressed not only c-jun but a range of growth factors and matrix-degrading enzymes. Dz13 in this formulation inhibited microvascular endothelial cell proliferation, migration and tubule formation in vitro. Moreover, animals treated with Dz13 sensed the top of the cage in a modified forepaw reach model, unlike mice given a DNAzyme with scrambled RNA-binding arms that did not affect c-Jun expression. These findings demonstrate reduction of microvascular density and improvement in forepaw reach in mice administered catalytic DNA.

Destroying C-jun Messenger: New Insights into Biological Mechanisms of DNAzyme Function

The study by Cai and co-workers provided novel insights into the mechanism of action of DNAzymes. Dz13 rendered c-jun mRNA unstable, reduced growth factor expression and increased apoptosis in the tumors without apparent induction of oxidative stress. Interestingly, Dz13-mediated tumor decay was more profound in immunocompetent mice syngeneic to the tumor compared with immunocompromised animals. Immunohistological inspection revealed increased immune and inflammatory cells in Dz13-treated tumors in the immunocompetent mice. In addition, Dz13 mediated tumor regression was prevented by the administration of CD4 or CD8 antibodies, which depleted the mice of the respective T cell subsets. Thus, inhibition of tumor growth by a DNAzyme involves the induction of tumor immunity. These findings suggest that c-Jun inhibition in tumors stimulates apoptosis and adaptive immune mechanisms that attack the tumor. Underpinned by a favorable preclinical safety profile, DNAzymes could provide a new treatment option combining both direct and indirect mechanisms to prevent the growth and spread of non-melanoma skin cancer.

Upregulation of Heparanase in High-glucose-treated Endothelial Cells Promotes Endothelial Cell Migration and Proliferation and Correlates with Akt and Extracellular-signal-regulated Kinase Phosphorylation

The objectives of this study were to determine whether high-glucose-induced upregulation of heparanase (HPSE) expression and differential heparanase expression in human retinal vascular endothelial cells (HRECs) can alter HREC migration and proliferation. We also aimed to determine whether HREC migration and proliferation correlate with the levels of protein kinase B (Akt) and extracellular-signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation and activation.

The Endoglycosidase Heparanase Enters the Nucleus of T Lymphocytes and Modulates H3 Methylation at Actively Transcribed Genes Via the Interplay with Key Chromatin Modifying Enzymes

The methylation of histones is a fundamental epigenetic process regulating gene expression programs in mammalian cells. Dysregulated patterns of histone methylation are directly implicated in malignant transformation. Here, we report the unexpected finding that the invasive extracellular matrix degrading endoglycosidase heparanase enters the nucleus of activated human T lymphocytes and regulates the transcription of a cohort of inducible immune response genes by controlling histone H3 methylation patterns. It was found that nuclear heparanase preferentially associates with euchromatin. Genome-wide ChIP-on-chip analyses showed that heparanase is recruited to both the promoter and transcribed regions of a distinct cohort of transcriptionally active genes. Knockdown and overexpression of the heparanase gene also showed that chromatin-bound heparanase is a prerequisite for the transcription of a subset of inducible immune response genes in activated T cells. Furthermore, the actions of heparanase seem to influence gene transcription by associating with the demethylase LSD1, preventing recruitment of the methylase MLL and thereby modifying histone H3 methylation patterns. These data indicate that heparanase belongs to an emerging class of proteins that play an important role in regulating transcription in addition to their well-recognized extra-nuclear functions.

Fluorescent Target Array Killing Assay: a Multiplex Cytotoxic T-cell Assay to Measure Detailed T-cell Antigen Specificity and Avidity in Vivo

Here we describe a multiplex, fluorescence-based, in vivo cytotoxic T-cell assay using the three vital dyes carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, cell trace violet, and cell proliferation dye efluor 670. When used to label cells in combination, these dyes can discriminate >200 different target cell populations in the one animal due to each target population having a unique fluorescence signature based on fluorescence intensity and the different emission wavelengths of the dyes. This allows the simultaneous measurement of the in vivo killing of target cells pulsed with numerous peptides at different concentrations and the inclusion of many replicates. This fluorescent target array killing assay can be used to measure the fine antigen specificity and avidity of polyclonal cytotoxic T-cell responses in vivo, immunological parameters that were previously impossible to monitor.

DNAzyme Targeting C-jun Suppresses Skin Cancer Growth

Worldwide, one in three cancers is skin-related, with increasing incidence in many populations. Here, we demonstrate the capacity of a DNAzyme-targeting c-jun mRNA, Dz13, to inhibit growth of two common skin cancer types-basal cell and squamous cell carcinomas-in a therapeutic setting with established tumors. Dz13 inhibited tumor growth in both immunodeficient and immunocompetent syngeneic mice and reduced lung nodule formation in a model of metastasis. In addition, Dz13 suppressed neovascularization in tumor-bearing mice and zebrafish and increased apoptosis of tumor cells. Dz13 inhibition of tumor growth, which required an intact catalytic domain, was due in part to the induction of tumor immunity. In a series of good laboratory practice-compliant toxicology studies in cynomolgus monkeys, minipigs, and rodents, the DNAzyme was found to be safe and well tolerated. It also did not interfere in more than 70 physiologically relevant in vitro bioassays, suggesting a reduced propensity for off-target effects. If these findings hold true in clinical trials, Dz13 may provide a safe, effective therapy for human skin cancer.

New and Improved Methods for Measuring Lymphocyte Proliferation in Vitro and in Vivo Using CFSE-like Fluorescent Dyes

The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to measure lymphocyte proliferation by flow cytometry has become one of the most widely utilised assays for assessing lymphocyte responses. The properties of CFSE make it ideal for such a task, covalently labelling cells with a long-lived fluorescence of high intensity and low variance with minimal cell toxicity. No dye in the last 20 years has been capable of replicating CFSE in these respects. However, currently CFSE is limited to following a maximum of 7 cell divisions and is not compatible for use with ubiquitously available fluorescein conjugates or other fluorescent molecules with spectral properties similar to fluorescein, such as EGFP. Here we characterise two new fluorescent dyes for measuring lymphocyte proliferation, Cell Trace Violet (CTV) and Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD), which have different excitation and emission spectra to CFSE and, consequently, are compatible with fluorescein conjugates. We found that while both CTV and CPD can label cells to a high fluorescence intensity, which is long-lived and has low variability and low toxicity and makes them ideal for long-term tracking of non-dividing lymphocytes in vivo, CTV offers possibly the best available alternative to CFSE in the analysis of cell divisions. We also describe how intercellular dye transfer and cell autofluorescence can affect division resolution with the three different dyes and describe labelling conditions for the three dyes that produce ultra-bright lymphocytes for in vivo tracking studies and allow up to 11 cell divisions to be detected when using CFSE and CTV as the fluorescent dyes.

Heparanase and Autoimmune Diabetes

Heparanase (Hpse) is the only known mammalian endo-β-d-glucuronidase that degrades the glycosaminoglycan heparan sulfate (HS), found attached to the core proteins of heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). Hpse plays a homeostatic role in regulating the turnover of cell-associated HS and also degrades extracellular HS in basement membranes (BMs) and the extracellular matrix (ECM), where HSPGs function as a barrier to cell migration. Secreted Hpse is harnessed by leukocytes to facilitate their migration from the blood to sites of inflammation. In the non-obese diabetic (NOD) model of autoimmune Type 1 diabetes (T1D), Hpse is also used by insulitis leukocytes to solubilize the islet BM to enable intra-islet entry of leukocytes and to degrade intracellular HS, an essential component for the survival of insulin-producing islet beta cells. Treatment of pre-diabetic adult NOD mice with the Hpse inhibitor PI-88 significantly reduced the incidence of T1D by ~50% and preserved islet HS. Hpse therefore acts as a novel immune effector mechanism in T1D. Our studies have identified T1D as a Hpse-dependent disease and Hpse inhibitors as novel therapeutics for preventing T1D progression and possibly the development of T1D vascular complications.

Heparan Sulfate: a Ubiquitous Glycosaminoglycan with Multiple Roles in Immunity

Heparan sulfate (HS) is a highly acidic linear polysaccharide with a very variable structure. It is ubiquitously expressed on cell surfaces and in the extracellular matrix and basement membrane of mammalian tissues. Synthesized attached to various core proteins to form HS-proteoglycans, HS is capable of interacting with various polypeptides and exerting diverse functions. In fact, a bioinformatics analysis of mammalian proteins that express a heparin/HS-binding motif and are associated with the immune system identified 235 candidate proteins, the majority having an intracellular location. This simple analysis suggests that HS may, in fact, interact with many more components of the immune system than previously realized. Numerous studies have also directly demonstrated that HS plays multiple prominent functional roles in the immune system that are briefly reviewed in this article. In particular, the molecule has been shown to regulate leukocyte development, leukocyte migration, immune activation, and inflammatory processes.

Comment On: Korpos Et Al. The Peri-islet Basement Membrane, a Barrier to Infiltrating Leukocytes in Type 1 Diabetes in Mouse and Human. Diabetes 2013;62:531-542

The Antiangiogenic Properties of Sulfated β-cyclodextrins in Anticancer Formulations Incorporating 5-fluorouracil

Sulfated β-cyclodextrins (S-β-CDs) are useful excipients for improving the solubility of drugs. One such formulation incorporating 5-fluorouracil (5-FU), termed FD(S), showed improved efficacy over 5-FU alone in orthotopic carcinoma xenograft models. S-β-CDs have heparin-like anticoagulant properties, which may have contributed toward the improved antitumor effect of FD(S). S-β-CDs have also been reported to modify a number of processes involved in angiogenesis. Although the anticoagulant nature of S-β-CDs was established, the antiangiogenic properties of S-β-CDs within FD(S) were unknown. The effect of S-β-CD and FD(S) on the proliferation and migration of endothelial cells in live-cell kinetic assays, and the reorganization of human umbilical vein endothelial cells into tubule structures in vitro was assessed. The effects of S-β-CD on angiogenesis in vitro were validated ex vivo using the rat aorta ring assay and the chick embryo chorioallantoic membrane assay. S-β-CD does not alter proliferative endothelial cell sensitivity to 5-FU cytotoxicity. S-β-CD alone and within FD(S) significantly inhibited angiogenesis by impeding endothelial cell migration, resulting in the inhibition of tubule formation and hence new vasculature. In addition to the cytotoxic action of the drug 5-FU, therapeutic inhibition of angiogenesis by S-β-CDs within FD(S) could potentially limit local invasion and metastases. This has important implications for the exploitation of S-β-CDs for drug formulation improvements or for drug delivery of anticancer biologics.

The Accumulation of Circulating Histones on Heparan Sulphate in the Capillary Glycocalyx of the Lungs

Recent findings on the role of circulating histone proteins in mediating acute lung injury prompted us to investigate whether there is a specific mechanism for accumulation of histones in the lungs. Binding sites for polycations are already known in the vasculature of the lungs, and we postulated that these could also be involved in histone accumulation, since histones have a high content of positively charged amino acids. Using a histone-coated colloid of a radiolabelled nanocomposite to track histone biodistribution with imaging techniques, it was found that histones bind avidly in the lungs of rabbits after intravenous injection. Blocking experiments with competing polycations in vivo characterised histone lung binding as dependent on a charge interaction with microvessel polyanions. Pretreatment of rabbits with a specific heparinase confirmed that the lung binding sites consist of heparan sulphate in the endothelial glycocalyx. A range of heparan sulphate analogues was accordingly shown to prevent histone accumulation in the lungs by neutralising histones in blood. These findings provide a rational basis for the design of polyanions that can prevent accumulation of cytotoxic histones in the lungs and thereby intervene at an early key step in the development of acute lung injury.

Fluorescent Target Array T Helper Assay: a Multiplex Flow Cytometry Assay to Measure Antigen-specific CD4+ T Cell-mediated B Cell Help in Vivo

CD4(+) T cells play a central role in regulating the immune response. Their effector function is commonly assessed by their capacity to secrete cytokines detected by ELISPOT and intracellular cytokine staining. However, one aspect of their effector function that is often overlooked is their ability to help activation of cognate B cells directly, a process that is initiated through the engagement of their T cell-receptor (TCR) with cognate peptide presented on major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules by B cells. Here we report a method to monitor CD4(+) T cell-mediated B cell help in vivo using a multiplex high throughput assay. This assay utilizes a fluorescent target array (FTA), which is composed of lymphocytes labeled with numerous (>200) unique fluorescence signatures that can be delineated in a single recipient animal based on combination labeling with the three vital dyes carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), CellTrace Violet (CTV) and Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD). By pulsing different B cell populations in a FTA with titrated amounts of cognate MHC-II binding peptides, CD4(+) T cell help could be assessed by measuring induction of the B cell activation markers CD69 and CD44 by antibody labeling and flow cytometry. We call this the "FTA T helper assay", and have found it to be a robust and sensitive assay to measure CD4(+) T cell helper activity across a multitude of peptide-pulsed B "target" cells in real time in vivo. Furthermore, the technique can be used simultaneously with the FTA killing assay that measures cytotoxic T cell function, to provide a comprehensive tool for measuring both CD4(+) and CD8(+) T cell activity during an immune response in vivo.

Mice Deficient in the Putative Phospholipid Flippase ATP11C Exhibit Altered Erythrocyte Shape, Anemia and Reduced Erythrocyte Lifespan

Transmembrane lipid transporters are believed to establish and maintain the phospholipid asymmetry in biological membranes; however, little is known about the in vivo function of the specific transporters involved. Here we report that developing erythrocytes from mice lacking the putative phosphatidylserine (PS) flippase, ATP11C showed a lower rate of PS translocation in vitro compared to erythrocytes from wild-type littermates. Furthermore, the mutant mice had an elevated percentage of PS-exposing mature erythrocytes in the periphery. While erythrocyte development in ATP11C-deficient mice was normal, the mature erythrocytes had an abnormal shape (stomatocytosis), and the lifespan of mature erythrocytes was shortened relative to that in littermate controls resulting in anemia in the mutant mice. Thus, our findings uncover an essential role for ATP11C in erythrocyte morphology and survival and provide a new candidate for the rare inherited blood disorder stomatocytosis with uncompensated anemia.

New Insights into Intracellular Locations and Functions of Heme Oxygenase-1

Heme oxygenase-1 (HMOX1) plays a critical role in the protection of cells, and the inducible enzyme is implicated in a spectrum of human diseases. The increasing prevalence of cardiovascular and metabolic morbidities, for which current treatment approaches are not optimal, emphasizes the necessity to better understand key players such as HMOX1 that may be therapeutic targets.

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