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Articles by Cindy A. Morris in JoVE
JoVE Bioengineering
Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de
1Department of Microbiology and Immunology, Tulane University Medical School, 2Physician/Scientist Program, Tulane University Medical School, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.
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Inducción De La Activación De P53 Dependiente De Proliferación Celular Antígeno Nuclear Gene Humano En Cromatina Por Radiación Ionizante
Una línea celular de fibroblastos humano con la expresión de p53 condicionales muestra un aumento dependiente de p53 en los niveles de la proteína y el ARNm del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) después de la exposición a la radiación ionizante (IR). La combinación de inducción p53 e IR cooperó para activar un transitorio expresado gene humano de promotor-reportero PCNA mediante un elemento sensible al p53. Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina con anticuerpos específicos para p53 o proteína p300/CREB revelado específica dependiente de p53 enriquecimiento de secuencias de promotor PCNA en immunoprecipitates de la cromatina esquilada preparada a partir de las células irradiadas. Asociación específica y máxima de acetilado histona H4 con el promotor PCNA también dependía de inducción de p53 y la exposición a ir Estos datos demuestran p53 enlace a un sitio de destino en el promotor PCNA, reclutamiento de proteína p300/CREB y localizada la acetilación de la histona H4 en una forma dependiente de IR. Estos eventos moleculares son capaces de desempeñar un papel en la mediación de la activación de la expresión génica PCNA por p53 durante la respuesta celular al daño del ADN. Los análisis indican que la combinación de inducción p53 e IR activar el gen PCNA a través de mecanismos similares a la de p21/salvaje-tipo p53-activado factor pero en menor medida. Esta regulación diferencial de PCNA y p21/salvaje-tipo p53-activado factor podrá establecer la proporción adecuada de las dos proteínas para coordinar la reparación del ADN con la detención del ciclo celular.
Infección Por Citomegalovirus Humano Permisiva De Una Línea De Células Primer Trimestre Cytotrophoblast Extravillous
El citomegalovirus humano (HCMV) es la principal causa de infección viral congénita en los Estados Unidos y Europa. A pesar de la importante morbilidad asociada con la infección prenatal de HCMV, poco se sabe sobre cómo el virus infecta al feto durante el embarazo. Hasta la fecha, citotrofoblastos humanos primarios (CTBs) han sido utilizados para estudiar placentaria HCMV infección y replicación; sin embargo, el potencial mitótico mínimo de estas células restringe la experimentación a unos pocos días, que puede ser problemático para estudios mecanísticos del virus lento-replicar. El objetivo de este estudio fue determinar si el ser humano primer trimestre CTB células SGHPL-4 fue permisivo para infección HCMV y por lo tanto podría superar tales limitaciones. HCMV inmediata temprana (IE) expresión de la proteína fue detectada tan pronto como post-infección de 3 horas en SGHPL-4 células y progresivamente creciente en función del tiempo. HCMV crecimiento análisis revelaron la presencia de virus infeccioso en ambos lisados celulares y sobrenadantes de cultura, indicando que la replicación viral y la liberación de virus de progenie ocurrieron. En comparación con fibroblastos humanos, replicación viral fue retrasada en CTBs, consistente con estudios previos informes retrasado cinética viral en infectados HCMV CTBs primarios. Estos resultados indican que las células de SGHPL-4 son totalmente permisivas para el ciclo replicativo HCMV. Nuestros resultados sugieren que estas células pueden servir como herramientas útiles para futuros estudios mecanicistas de la patogenesia HCMV durante el embarazo temprano.
Proteína De Membrana Latente De EBV-1 Protege Las Células De B De Apoptosis Por La Inhibición De BAX
Proteína de membrana latente 1 (LMP-1) del virus de Epstein - Barr (EBV) promueve la tumorigénesis mediante la inhibición de la apoptosis. Demostramos que una actividad importante antiapoptótico de LMP-1 es la inhibición de la proteína Bcl2 X (Bax), una proteína potente proapoptóticas. Expresión de BAX fue regulada por LMP-1 activación del factor nuclear kappa b (NF-kappaB) vía la región c-terminal de activación 1 (CTAR-1) y CTAR-2. Curiosamente, p65/p50 inhibida, mientras que aumentó p50/p50, actividad de promotor BAX según lo demostrado por sobreexpresión y la inhibición selectiva de estas isoformas de NF-kappaB. Análisis de cambio de movilidad electroforética reveló que LMP-1 activa 2 de los sitios de unión 3 NF-kappaB (kappaB1-kappaB3) en el promotor BAX. LMP-1 inducida por el atascamiento de la NF-kappaB heterodímero p65/p50 al sitio kappaB2 y de la p50/p50 homodímero al sitio kappaB3. Análisis de la mutación del promotor reveló que el sitio kappaB2 es necesario para la inhibición de la actividad del promotor BAX y el sitio de kappaB3, para su activación. Sin embargo, la activación del promotor BAX de LMP-1 se observó sólo en presencia de inhibidores específicos de p65/p50. En los demás casos, LMP-1 inhibe la actividad del promotor BAX. Lo más importante, la actividad de antiapoptóticos de LMP-1 disminuyó considerablemente en las células deficientes de BAX. Estos resultados indican que la inhibición de Bax puede ser una actividad importante antiapoptótico de LMP-1.
Sinérgica Inhibición De La Replicación Del Citomegalovirus Humano Por Interferón-alfa/beta Y El Interferón-gamma
Estudios recientes han demostrado que el interferón gamma (IFN-gamma) lista sinergiza con el IFN innata (IFN-alfa y IFN-beta) para inhibir el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) replicación in vitro. Para determinar si este fenómeno es compartida por otros herpesvirus, investigamos los efectos de IFN en la replicación del citomegalovirus humano (HCMV).
Pruebas De VIH Seroreactivity Exposición Y Transitorio En Archivados VIH-negativo Sera De Hemofílico Severo
Aproximadamente el 25% de hemofílicos que fueron expuestos con frecuencia a coagulación concentrados del factor (CFC) contaminados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) son actualmente VIH seronegativo. En este estudio, intentamos determinar si algunos de estos individuos estaban en cualquier momento transitorio vih seropositivo. En el temprano a mediados de los ochenta la mayoría de pacientes de hemofilia grave expusieron a CFC contaminada con el VIH. Aunque muchos de estos hemofílicos se convirtió en VIH-positivo, un pequeño porcentaje no se ha sido infectado. Actualmente para determinar que si algunos de estos individuos resistieron con éxito la infección viral, se intentó documentar la presencia de anticuerpos reactivos transitorias de VIH en muestras de plasma archivados (1980-1992) de hemofílicos graves VIH-negativos, que tenían una alta probabilidad de exposición repetida al VIH contaminan CFC. Plasma archivado muestras fueron retrospectivo evaluó mediante que una FDA aprobó VIH-1Ab HIV-1/VIH-2 (rDNA) enzimoinmunoanálisis (EIA) y un ensayo de la mancha blanca /negra occidental de VIH-1 (BM), ninguno de los cuales eran comercialmente disponible hasta finales de 1980, que fue después de que muchas de estas muestras habían sido exhaustos.
Quinasa Dependiente De Ciclina 9 Es Necesario Para La Expresión De Factor De Necrosis Tumoral-alfa-estimulados Matriz Metaloproteinasa-9 En Células De Adenocarcinoma De Pulmón Humano
El proinflamatorias citocinas factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) promueve la progresión del tumor a través de la activación de la actividad de matriz metaloproteinasa (MMP). MMP-9 es una gelatinasa secretada por las células cancerosas y las células del estroma circundantes, y contribuye a la metástasis y la invasión tumoral TNF-alfa-estimulados. Quinasa dependiente de ciclina 9 (CDK9), el componente catalítico de transcripción positivo alargamiento factor-b, fosforila residuos de serina 2 en el dominio c-terminal de la ARN polimerasa II para la elongación de la transcripción productiva y está regulado, hasta con la exposición a tensiones diferentes. Este estudio investigó el papel de CDK9 en expresión de TNF-alfa-estimulados MMP-9 en células de adenocarcinoma de pulmón humano. CDK9 actividad fue inhibida usando tres diferentes estrategias, incluyendo el inhibidor farmacológico CDK9 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB), un CDK9 dominante negativo y un ARN interferente pequeño CDK9 específicos. Todos tres enfoques reducen acumulación de TNF-alfa-mediada de MMP-9 en los medios de comunicación condicionada según lo demostrado por Zimografía de gelatina. En cambio, la transformación inducida por factor de crecimiento-beta1 acumulación de MMP-2 era inafectada por DRB. Expresión del gen MMP-9 fue examinado mediante transcripción reversa PCR en tiempo real y usando un análisis de transfección transitoria para evaluar la actividad del promotor de MMP-9. DRB redujo el aumento de los niveles de mRNA de MMP-9 inducida por TNF-alfa, pero no efecto transforming growth factor-beta1-indujo la expresión del mRNA de MMP-2. Constantemente DRB y dominante negativo CDK9 completamente abrogado TNF-alfa-estimulados de la actividad del promotor de MMP-9 humana. TNF-alfa no regular expresión o localización de CDK9 o su socio reguladora ciclina T. Sin embargo, TNF-alfa había estimulado CDK9 Unión a la ciclina T y MMP-9 gen ocupación CDK9 tanto la forma 2-fosforiladas de serina de la ARN polimerasa II. Nuestros resultados indican que CDK9 media transcripción inducida por TNF-alfa MMP-9. Interrupción de señalización usando CDK9 inhibidores de TNF-alfa podría servir como una estrategia terapéutica potencial contra la invasión tumoral y la metástasis.
Activación De ProMMP-2 Y Fuente Por HHV8 VGPCR En Las Células Endoteliales Arteriales Pulmonares Humanas
La hipertensión arterial pulmonar idiopática (HAPI) es asociado con herpesvirus humano 8 (HHV8) infección y demuestra la angiogénesis patológica similar a la observada con otra enfermedad HHV8-ligado, a saber, Sarcoma de Kaposi (KS). Lo importante es el HHV8 codificado viral G-receptor acoplado a proteínas (vGPCR) induce lesiones KS en un modelo murino. Investigar el impacto de la expresión de vGPCR en la actividad angiogénica de células endoteliales arteriales pulmonares humanas (HPAEC) puede producir penetración en la Biopatología de HHV8 asociada los trastornos vasculares, especialmente de PAH. HPAECs cultivadas fueron transduced con vectores retrovirales llevar control o vGPCR regiones de codificación. vGPCR expresión activa selectivamente metaloproteinasa de la matriz (MMP) -2, una matriz fundamental modulación enzima durante la angiogénesis. Un anticuerpo neutralizante de membrana tipo 1 MMP (MT1-MMP) y el inhibidor de tejido de 2 metaloproteinasas (TIMP-2) independientemente bloquean activación de MMP-2 vGPCR-inducida. vGPCR expresión unanimidad había promovido MMP-2 Activación mediante el aumento de expresión de MT1-MMP disminuyendo la expresión TIMP-2. vGPCR activa la cinasa de la fuente según lo demostrado por fosforilación de Src y su quinasa de adhesión focal de sustrato (FAK). vGPCR promueve la angiogénesis de HPAECs como lo demuestra un aumento sustancial en la tubulogenesis in vitro. Los inhibidores de la fuente PP2 y SU6656 disminución significativa de la activación de MMP-2 inducida por vGPCR y tubulogenesis. Nuestros resultados indican que vgpcr induce la activación de la MMP-2 en HPAECs a través de la regulación de la expresión de MT1-MMP y TIMP-2. vGPCR activa fuente y la inhibición de dicha activación deroga proMMP-2 activación y angiogénesis in vitro inducida por vGCPR. El estudio actual implica vGPCR como agente etiológico en HAPI e identifica la fuente y MMP-2 como posibles dianas terapéuticas en HHV8 asociados KS y HAPI.
Sarcoma De Kaposi Había Asociado a La Activación Del Receptor G-Proteína Juntada De Herpesvirus De La Ciclooxigenasa-2 En Las Células Endoteliales Vasculares
Sarcoma de Kaposi de asociados herpesvirus (KSHV) es el agente etiológico de la pantalla de sarcoma de Kaposi (KS), una neoplasia altamente vascularizada caracterizada por células endoteliales derivados del tumor spindle-shaped. Las células endoteliales microvasculares KSHV infectados demuestran mayor expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) y lesiones de KS tienen altos niveles de prostaglandina E2 (PGE2), una corta vida eicosanoides depende de la actividad de la ciclooxigenasa que se ha relacionado con la patogénesis de otras neoplasias. Determinar si la mayor expresión de la COX-2 y PGE2 producción está mediada por la angiogénicos y G-proteína codificada en KSHV tumorígena junto del receptor (vGPCR), desarrollamos un retrovirus recombinante que expresa vGPCR en humanos Umbilical Vascular endotelial células (HUVEC).
Cánceres Ováricos Sobreexpresan La Proteína Antimicrobiana HCAP-18 Y Sus Derivados LL-37 Aumenta La Invasión Y Proliferación De Células De Cáncer De Ovario
El papel de los péptidos proinflamatorios, LL-37 y su pro-forma, humano antimicrobiana proteína catiónica 18 (hCAP-18), en el desarrollo del cáncer y la progresión es mal entendido. En el tejido dañado y se inflaman, LL-37 funciona como un factor quimioatrayentes, mitógeno y pro-angiogénicos, sugiriendo que el péptido puede potenciar la progresión tumoral. El objetivo de este estudio fue caracterizar la distribución de hCAP-18/LL-37 en el tejido ovárico normal y canceroso y examinar los efectos de LL-37 en las células de cáncer de ovario. Expresión de hCAP-18/LL-37 fue localizado a las células inmunes y granulosa de tejido ovárico normal. Por el contrario, los tumores ováricos muestran niveles significativamente más altos de hCAP-18/LL-37, donde observó la expresión en el tumor y las células del estroma. Expresión de la proteína estadísticamente se comparó con el grado de infiltración y microvasos densidad de células inmunitarias en tumores ováricos epiteliales derivadas y se observó una correlación significativa para ambos. Se demostró que el tumor ovárico tejido lisados y líneas celulares de cáncer de ovario expresan hCAP-18/LL-37. Tratamiento de líneas celulares de cáncer de ovario con recombinante LL-37 estimuló la proliferación, quimiotaxis, invasión y expresión de metaloproteinasa de la matriz. Estos datos demuestran por primera vez eso hCAP-18/LL-37 es significativamente sobreexpresada en tumores ováricos y sugieren LL-37 puede contribuir a la tumorigénesis ovárica a través de la estimulación directa de las células tumorales, la iniciación de la angiogénesis y el reclutamiento de células inmunes. Estos datos proporcionan más evidencia de la relación existente entre las moléculas proinflamatorias y progresión del cáncer de ovario.
Motilidad Cytotrophoblast Extravillous Estimulada Por El Factor De Crecimiento Epidérmico Está Mediada Por La Activación De Akt, PI3-K Y Kinases De Proteína Activada Por Mitógeno P38 Tanto P42/44
Invasión del trofoblasto es un esquema temporal y espacialmente regulado de eventos que puede dictar el resultado del embarazo. La evidencia sugiere que el potente mitógeno factor de crecimiento epidérmico (EGF) regula la diferenciación citotrofoblasto (CTB) y la invasión durante el embarazo temprano.
Inhibición Del Péptido De La Infección Por Citomegalovirus Humano
El citomegalovirus humano (HCMV) es la infección viral congénita más frecuente en los Estados Unidos y Europa causando morbosidad y mortalidad significativas a la madre y el niño. HCMV también es un patógeno oportunista en individuos inmunocomprometidos, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-pacientes con SIDA y órganos sólidos y los receptores de trasplante alogénico de células madre infectados. Los tratamientos actuales para enfermedades asociadas a HCMV son insuficientes debido a la aparición de resistencia medicamentosa y citotoxicidad, que requiere de nuevos enfoques para limitar la infección HCMV. El objetivo de este estudio fue desarrollar péptidos terapéuticos dirigidos a la glicoproteína B (gB), una glicoproteína principal de HCMV que es altamente conservada a través de la familia Herpesviridae, que inhiben específicamente la fusión de la envuelta viral con la membrana de la célula anfitrión prevenir la infección y la entrada HCMV.
