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Articles by David M. Kwinter in JoVE
JoVE General
Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas
Department of Biological Sciences, Simon Fraser University
Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.
Other articles by David M. Kwinter on PubMed
Sequestosome 1/p62 Enlaces Familiar ALS Mutante SOD1 Para LC3 Mediante Un Mecanismo Independiente De La Ubiquitina
La 1 proteína p62/sequestosome ha sido identificada como un componente de inclusiones de proteína patológica en enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). P62 también se ha implicado en la autofagia, un proceso de degradación masiva de proteínas intracelulares y organelos. Autofagia es un camino crítico para degradar proteínas mal plegadas o estropeadas, incluyendo el ALS vinculados a familiar de cobre-zinc superóxido dismutasa (SOD1) mutantes. Divulgamos previamente que p62 interactuó con mutantes de ALS de SOD1 y que el dominio de la ubiquitina-Asociación de p62 se prescindibles para la interacción. En este estudio, se identificaron dos regiones distintas de p62 que eran esenciales para su unión a mutante SOD1: el N-terminal Phox y Bem1 (PB1) dominio (residuos 1-104) y una región interna independiente (residuos 178-224) denominado aquí como región de interacción mutante SOD1 (SMIR). El dominio PB1 es necesario para la condición apropiada oligomérica de p62 y el SMIR es la región real interactuando con mutante SOD1. El SMIR, W184 conservados, H190 y R183 cargado positivamente, R186, K187 y K189 de residuos son esenciales para la interacción de SOD1 p62-mutante como sustitución de estos residuos con alanina resultaron en suprimió significativamente vinculante. Además, SMIR y la secuencia de p62 responsable de la interacción con LC3, una proteína esencial para la activación de la autofagia, son independientes entre sí. En las células que carecían de p62, la existencia de mutante SOD1 en ácidos autolysosomes disminuido, sugiriendo que P62 puede funcionar como un adaptador entre mutante SOD1 y el mecanismo de autofagia. Este estudio proporciona un nuevo mecanismo molecular por el cual mutante SOD1 puede ser reconocido por p62 de manera independiente de la ubiquitina y dirigido por la vía de degradación de la autofagia-lisosoma.
Disfunción Mitocondrial En La Esclerosis Lateral Amiotrófica
La etiología de la degeneración de la motoneurona en restos de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) para ser mejor entendido. Basado en los estudios de pacientes de ALS y modelos de animales transgénicos, se cree que es probable que sea una enfermedad multifactorial y multisistémica. Muchos mecanismos se han postulado para ser involucrados en la patología de la ELA, tales como estrés oxidativo, glutamato excitotoxicidad, daño mitocondrial, transporte axonal defectuoso, patología de la célula glia y metabolismo de RNA aberrante. Las mitocondrias, que juegan papeles cruciales en la supervivencia celular, la apoptosis y la excitotoxicidad, han demostrado ser un objetivo temprano en la patogenia de la ALS y contribuir a la progresión de la enfermedad. Defectos morfológicos y funcionales de las mitocondrias fueron encontrados en pacientes humanos y ratones ALS overexpressing mutante SOD1. Mutante SOD1 fue encontrado para ser preferentemente asociado con mitocondrias y posteriormente deteriorar la función mitocondrial. Estudios recientes sugieren que el transporte axonal de mitocondrias a lo largo de los microtúbulos y dinámica mitocondrial también puede interrumpirse en ALS. Estos resultados también muestran la importancia de mantener el funcionamiento mitocondrial en axones y uniones neuromusculares, apoyando el emergente "morir al usuario" modelo axonopathy de ALS. En esta revisión, vamos a discutir cómo la disfunción mitocondrial se ha ligado a las variantes de ALS de SOD1 y los mecanismos por los cuales daño mitocondrial contribuye a la etiología de la enfermedad.
Secuencia De Localización Nuclear De FUS Y La Inducción De Gránulos De Estrés Por Mutantes De ALS
Mutaciones en fundido en sarcoma (FUS) se han divulgado a causa un subconjunto de la esclerosis de lateral amiotrófica (ALS) casos. Salvaje-tipo FUS se localiza principalmente en los núcleos de las neuronas, pero los mutantes de la ALS en parte son mislocalized en el citoplasma y pueden formar inclusiones. Demostramos que los residuos de 32 aminoácidos del c-terminal de FUS constituyen una secuencia efectiva de localización nuclear (NLS) ya que dirigidas beta-galactosidasa (LacZ, 116 kDa) al núcleo. Eliminación de o las mutaciones de la ALS en el NLS causaron mislocalization citoplasmática de FUS. Además, identificamos la proteína de unión a poli-A (PABP1), un marcador de gránulo de estrés, como un interacción socio de FUS. Grandes focos citoplásmicos de PABP1-positivo (es decir, gránulos de estrés) colocalized con las inclusiones de FUS mutantes pero estuvieron ausentes en células de FUS-expresión de tipo salvaje. Procesamiento de cuerpos, que se relacionan funcionalmente con gránulos de estrés, fueron junto a pero no colocalized con las inclusiones de FUS mutantes. Nuestros resultados sugieren que las mutaciones de la ALS en FUS NLS pueden deteriorar la localización nuclear de FUS, inducir inclusiones citoplásmicas y gránulos de estrés y potencialmente perturbar el metabolismo de RNA.
