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Articles by Dor Salomon in JoVE
JoVE General
Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura
Department of Plant Sciences, Tel Aviv University
En este video, se describe un procedimiento para la expresión de las bacterias de tipo III efectores en la levadura y la identificación de los fenotipos de efectos inducidos por la inhibición del crecimiento. Fenotipos como puede ser explotada posteriormente para aclarar las funciones efectoras y objetivos.
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Omisión De La Actividad Quinasa De La Proteína De Tomate Con Resistencia Pto. Ligandos De Moléculas Pequeñas
El tomate (Solanum lycopersicum) la proteína quinasa Pto. confiere resistencia a Pseudomonas syringae pv. bacterias tomate expresar la AvrPto y proteínas AvrPtoB efectoras. Pto. reconoce específicamente los dos efectores directos de las interacciones físicas que desencadenan la activación de la respuesta inmune. En este caso, se utilizó un método químico-genético para sensibilizar a Pto. de análogos de PP1, un inhibidor de la ATP a la competencia de pequeñas moléculas. Mediante el uso de análogos de PP1 en combinación con la sensible Pto (PTO (as)), se analizó el papel de la actividad quinasa Pto. en reconocimiento de efectos y la transducción de señales. Sorprendentemente, mientras que los análogos de PP1 eficiente inhibe la actividad quinasa de Pto. (as) in vitro, que mejora la interacción de toma de fuerza (como) con AvrPto y AvrPtoB en una levadura sistema híbrido de dos. Además, en la presencia de análogos de PP1, PTO (as) mutaciones anuladas ya sea en un sitio autofosforilación crítico para la interacción Pto.-AvrPto o en los residuos catalíticamente esenciales y interactuado con ambos efectores. Además, en la presencia del análogo de PP1 3MB-PP1, una forma quinasa deficiente de toma de fuerza (como) provocó una respuesta de hipersensibilidad AvrPto-dependiente de la planta. Estos hallazgos sugieren que, en lugar de la fosforilación de por sí, es probable un cambio conformacional provocado por la autofosforilación en Pto. e imitados por la unión del ligando en la toma de fuerza (como) es un requisito previo para el reconocimiento de los efectores bacterianos. Tras el reconocimiento, la actividad quinasa parece ser prescindible para el Pto. de señalización en la planta. La estrategia química-genética aplicada aquí para desarrollar inhibidores específicos de moléculas pequeñas de Pto. representa una valiosa herramienta para el estudio de las funciones biológicas de otras quinasas de proteínas vegetales en vivo.
Un Método Químico-genético Para El Análisis Funcional De Las Proteínas Quinasas De Plantas
Genomas de plantas codificar cientos de proteínas quinasas, sin embargo, sólo una pequeña fracción de ellos las funciones y objetivos precisos de fosforilación se han identificado. Recientemente, se aplicó un método químico-genético para sensibilizar a la serina de tomate / treonina kinasa Pto. a los análogos de PP1, un ATP a la competencia y permeable a las células, de molécula pequeña inhibidora. La quinasa Pto. confiere resistencia a las bacterias Pst mediante la activación de la respuesta inmune en el reconocimiento específico de efectores bacterianos. Mediante el uso de análogos de PP1 en combinación con la toma de fuerza analógico-sensibles, que arrojan nueva luz sobre el papel de la actividad de la quinasa Pto. en reconocimiento de efectos y la transducción de señales. Aquí ampliar el uso de este método químico-genético a otra quinasa planta de defensa relacionados con la proteína, los LeMPK3 MAP quinasa. Además, demostramos que el análogo sensible, pero no de tipo salvaje quinasas son capaces de usar N naturales (6)-modificada por análogos de ATP como phosphodonors que pueden ser explotadas para el etiquetado de los objetivos de la fosforilación de la quinasa de interés. Por lo tanto, la sensibilización de las quinasas a los análogos de la PP1 inhibidor de molécula pequeña y la ATP puede ser una herramienta eficaz para el descubrimiento de las funciones celulares y los sustratos de fosforilación de las proteínas quinasas de la planta.
Ssz1 Restaura La Degradación De La Proteína Asociada a Retículo Endoplásmico En Las Células Que Expresan Defectuoso Complejo De Cdc48-ufd1-npl4 De Cdc48 Regular
El retículo endoplásmico (ER)-vía de degradación (ERAD) proteína asociada elimina proteínas aberrantes de la ER. Se indica el papel clave de Cdc48p-Ufd1p-Npl4p por ERAD deteriorada en Saccharomyces cerevisiae con mutaciones en cualquiera de este conjunto de genes. Se identificaron SSZ1 en pantallas genéticas para supresores de cdc48-10 y demuestran que estimula Cdc48p través de la red de resistencia (PDR) de drogas pleiotrópico. Un plásmido pSSZ1 restaurado deteriorada ERAD-M de 6myc-Hmg2 en cdc48-10 ufd1-2 y npl4-1, mientras que la eliminación de SSZ1 no tuvo ningún efecto. Ssz1p activa Pdr1p, el regulador principal de PDR. De hecho, plásmidos de PDR1 o su gen blanco RPN4 aumentaron de los niveles de cdc48 - 10P y había restaurado ERAD-M cdc48-10. Rpn4p regula la transcripción de las subunidades de la proteasoma y CDC48, así RPN4 borrado suprimido ERAD. Sin embargo, el nivel de disminución del proteasoma en Deltarpn4 era suficiente para degradar un sustrato citosólico, Considerando que el deterioro ERAD-M fue el resultado de la disminución Cdc48p y fue restablecido por la expresión de pCDC48. El corregido ERAD-M en las cepas hipomórfica de los Cdc48 socios ufd1-2 y npl4-1 por el plásmido pCDC48 y en células de cdc48-10 por el plásmido pcdc48-10, combinado con el hallazgo que ni pSSZ1 ni pcdc48-10 restaurado ERAD-L de CPY *-HA, apoyar nuestra conclusión que Ssz1p suprimir efectos es regular Cdc48p.
Expresión De Xanthomonas Campestris Pv. Vesicatoria Tipo III Efectores En La Levadura Afecta El Crecimiento Celular Y La Viabilidad
La bacteria gram-negativa Xanthomonas campestris pv. vesicatoria es el agente causal de la enfermedad de las manchas en el tomate y el pimiento. X. campestris pv. patogenicidad vesicatoria depende de un sistema de secreción tipo III entrega de proteínas efectoras en las células huésped. La hipótesis de que alguna X. campestris pv. efectores vesicatoria orientar conservadas procesos celulares eucariotas y fenotipos examinados inducidas por su expresión en levadura. De los 21 efectores han sido evaluados, 14 inhibieron el crecimiento de la levadura en condiciones normales o de estrés. Ensayo de viabilidad reveló que XopB y XopF2 proliferación celular atenuada, mientras AvrRxo1, XopX, y XopE1 fueron citotóxicos. La inspección de las características morfológicas y contenido de ADN de células de levadura se indica que la citotoxicidad causada por XopX y AvrRxo1 se asoció con la detención del ciclo celular en G0 / 1. Curiosamente, XopB, XopE1, XopF2, XopX y AvrRxo1 que inhibía el crecimiento de la levadura también causó fenotipos, como clorosis y muerte de las células, cuando se expresan, ya sea en las plantas hospedantes o no hospedantes. Finalmente, la capacidad de varios efectores de causar fenotipos en levadura y plantas era dependiente de sus residuos catalíticos putativo o motivos de localización. Este estudio apoya el uso de la levadura como un sistema heterólogo para el análisis funcional de X. campestris pv. vesicatoria efectores de tipo III, y establece el escenario para la identificación de sus objetivos eucariotas moleculares y los modos de acción.
Sensibilización De Quinasas De Proteínas Vegetales a La Inhibición Específica De Moléculas De ATP a La Competencia
La naturaleza altamente conservada del dominio catalítico de la proteína quinasa y la baja permeabilidad de las membranas celulares de las plantas constituyen un desafío para el desarrollo de inhibidores específicos que quinasas específicas individuales de proteínas in vivo. A continuación, describimos un método químico-genético para sensibilizar específicamente quinasas de plantas individuales que penetran en las células moléculas pequeñas que no inhiban las quinasas de tipo salvaje. En este enfoque, una sola sustitución de aminoácidos se introduce en el sitio de unión a ATP de la enzima que permite la unión específica de ATP-competitivos moléculas. Cell-permeables moléculas entonces se puede utilizar para apuntar específicamente el alelo sensibilizado en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que no expresan la forma de tipo salvaje de la quinasa. Esta estrategia proporciona una herramienta útil para la caracterización funcional de las proteínas quinasas en planta y para la disección de las vías de señalización en el que están involucrados.
Un Simple a Base De Levadura Estrategia Para Identificar Los Procesos Celulares De Acogida Blanco De Las Proteínas Efectoras Bacterianas
Proteínas efectoras bacterianas, que se entregan en la célula huésped a través del sistema de secreción tipo III, desempeñan un papel clave en la patogenicidad de bacterias gram-negativas por la modulación de los procesos de acogida diferentes celulares en beneficio del patógeno. Para identificar los procesos celulares específicos por los efectores bacterianos, hemos desarrollado una estrategia simple que utiliza una gran variedad de cepas de levadura supresión instalados en una sola placa de 96 pocillos. La matriz es único en que se ha optimizado computacionalmente tal que a pesar del pequeño número de cepas de deleción, que cubre la mayoría de los genes en la levadura, sintético red de interacción letal. Las cepas de deleción de la matriz son examinados para detectar la hipersensibilidad a la expresión de un efector bacteriana de interés. Las cepas de eliminación de hipersensibilidad se analizan las interacciones de sus letales sintéticos para identificar blancos potenciales del efector bacteriana. Se describe la identificación, la utilización de este enfoque, de un proceso celular dirigido por el Xanthomonas campestris XopE2 tipo III efector. Curiosamente, descubrimos que XopE2 afecta a la pared celular de la levadura y la respuesta de estrés del retículo endoplásmico. Más generalmente, el uso de una sola placa de 96 pocillos hace que el proceso de selección al alcance de cualquier laboratorio y facilita el análisis de un gran número de efectores bacterianas en un corto período de tiempo. Por lo tanto, proporciona una plataforma prometedora para el estudio de las funciones y objetivos celulares de efectores bacterianos y otras proteínas de virulencia.
