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Articles by Edward Avezov in JoVE
JoVE General
Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero
Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.
Other articles by Edward Avezov on PubMed
PERK Dependiente De La Compartimentación De Los ERAD Y Desdobló Maquinarias Respuesta a Proteínas Durante El Estrés ER
La acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (RE) activa las quinasas de membrana ER Perk y IRE1 que conducen a la respuesta de la proteína desplegada (UPR). Hemos demostrado que la activación de la UPR provoca la segregación Perk y IRE1 del BIP y su clasificación con las proteínas mal plegadas en el compartimiento de la calidad de ER-derivada de control (ERQC), un compartimiento pericentriolar que habíamos identificado previamente. PERK fosforila traducción factor de eIF2alfa, que luego se acumula en la cara citosólica de la ERQC. Dominante negativo PERK o eIF2alfa (S51A) mutantes evitar la compartimentación, mientras que eIF2alfa (S51D) mutante, que imita a la fosforilación constitutiva, la promueve. Esto sugiere un bucle de retroalimentación donde la fosforilación eIF2alfa causa la concentración en el pericentriolar ERQC, que a su vez amplifica la UPR. ER asociada a la degradación (ERAD) es un proceso de la UPR-dependiente, también encontramos que los componentes ERAD (Sec61beta, HRD1, p97/VCP, ubiquitina) son reclutados a la ERQC, por lo que es un sitio probable para retrotranslocación. Además, se demuestra que la autofagia, propuesto para desempeñar un papel en la eliminación de agregados de proteínas, no está relacionada con la acumulación de proteínas en el ERQC.
Retículo Endoplásmico (RE) Manosidasa Que Está Compartimentado Y Requeridos Para La N-glicanos Recorte De Man5-6GlcNAc2 En La Glicoproteína Asociada a La Degradación De ER-
Se había demostrado previamente que el retículo endoplásmico (RE)-asociada degradación (ERAD) de glicoproteínas en células de mamífero implica el recorte de tres a cuatro residuos de manosa del hombre oligosacárido unida a N (9) GlcNAc (2). Un posible candidato para esta actividad, ER manosidasa I (ERManI), acelera la degradación de sustratos ERAD cuando se sobreexpresa. Aunque in vitro, a bajas concentraciones, ERManI elimina sólo un residuo específico manosa, a concentraciones muy altas puede especiales hasta cuatro alfa1 ,2-enlazadas residuos de manosa. Usando pequeño interferir desmontables ARN de ERManI, nos muestran que esta enzima es necesaria para recortar al hombre (5-6) GlcNAc (2) y para ERAD en células in vivo, que conduce a la acumulación de Man (9) GlcNAc (2) y Glc (1) hombre (9) GlcNAc (2) sobre un sustrato modelo. Por lo tanto, el recorte por ERManI a los oligosacáridos más pequeños que eliminaría la glicoproteína de la reglucosylation calnexin y ciclos obligatorios. ERManI está sorprendentemente concentrado junto con el sustrato en el ERAD pericentriolar ER derivado compartimiento de control de calidad (ERQC) que se había descrito previamente. Caída ERManI evita la acumulación de sustrato en el ERQC. Sugerimos que la ERQC proporciona una alta concentración local de ERManI, y el paso a través de este compartimento permitiría momento de ERAD, posiblemente a través de un mecanismo de ciclismo. Cuando glicoproteínas recién hechos no se puede doblar, transportar a través de la ERQC conduce a la poda de un número importante de residuos de manosa, lo que provocó una señal para la degradación.
