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Articles by Eric Kuhn in JoVE
JoVE General
質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, 3Broad Institute of MIT and Harvard, 4Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 5Plasma Proteome Institute
安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM - MS）を有するペプチドの結合親和性の濃縮をキャプチャします。ここでは、部分的に自動化された形式で磁性粒子を使用してプロトコルを記述する。
Other articles by Eric Kuhn on PubMed
「クラッシュ」とスチュワートと主にコメントの「事故」の。
A. E. スチュワートと J. H. 主 (2002) 用語の自動車事故を放棄し、自動車のクラッシュ定義と患者のケアの庭に代入するを呼び出します。定義の庭と実証データの競合をサポートするために事故の生存者からの不在のための意義を唱えます。
心的外傷後ストレス障害と心理社会的 MVA の生存者の 2 つのサンプル内の機能します。
自動車の 2 つのサンプルの心理社会的機能 PTSD の基準 F 変数を検査するには、事故 (MVA) の生存者を調査しました。各サンプル内 MVA の生存者と心的外傷後ストレスなしの比較 3 つの時点で 4 つの心理社会的機能指標に行った。さらに、特定の心的外傷後ストレス症状のクラスターと心理社会的機能指標との関係を調べた。研究一般、MVA 生存者 PTSD と心的外傷後ストレスなしの生存者がやったよりも貧しい心理社会的機能、証拠を明らかにしました。PTSD の感情的な麻痺の症状は心理社会的機能指標の最も一貫性のある予測変数として浮上しました。これらの調査結果 PTSD の包括的な治療への影響を説明します。
質量滑液の重症の蛋白質バイオ マーカーと患者の血清リウマチとを識別するのに使用します。
タンパク質の候補のパネルを識別するには、バイオ マーカーはどの患者を予測することができます関節リウマチ （RA） のびらん性を無効に病気を開発します。
2 一年認知行動療法または支持的精神療法の将来のフォロー アップ。
我々 は、57 の自動車の事故生存、者制御の比較支持的精神療法 （サポート） への認知行動療法 （CBT） の完了の 90 ％ 以上を占めて続いた。一年結果カテゴリカル診断継続の重要な利点を示した （心的外傷後ストレスかどうか) と構造化面接対策 (CAP) CBT の以上のサポート。その他の措置は、一般に同じ結果を示した。2 年間で、我々 のフォロー アップができた一年補完の 75% だけ。CBT サポート上優遇算術の違いがそこに続けたが、これらのサンプルの唯一の違い PTSD チェックリストおよびイベント インパクト スケール スコアに減衰し、全体的にカテゴリカル診断で有意であった。非常に控えめな改善治療の終わりから 2 年間のフォロー アップにだった。
質量分析法と 13 C 標識ペプチド基準の監視複数の反応による関節リウマチ患者の血清 C 反応性蛋白の定量化。
ひと血清中のタンパク質の定量化のための一般的な方法は、質量分析法 (MS) と安定同位体標識合成ペプチドとしての社内基準を使用して開発されました。このアプローチを使用して、C 反応性蛋白 （CRP） は、関節リウマチ （RA） の診断マーカーびらん性または nonerosive のいずれかの RA 患者から、および健常者と比較して血清サンプルで検出されました。血清サンプルの小さいボリュームひと血清アルブミン (HSA) 免疫グロブリン G の選択的除去による低豊富なタンパク質 (igg 抗体) とハプトグロビンの豊かにされました。豊富な蛋白質の枯渇後タンパク質混合物の複雑さはさらに変性タンパク質離散分子量範囲に分別するサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) を使用して簡素化しました。CRP は、M(r) を含む関心の分数 = 25 000 いたプール トリプシンの消化し、[固定数量の合成ペプチドの混合物に追加されました。トリプシン ペプチドの混合物が、その後分析した nanoflow によって複数反応モニタリング (MRM) を使用して、トリプル四重極上クロマトグラフィー-タンデム MS （nanoLC-MS/MS） 質量 （TQ MS）。遷移イオンの比は CRP の独立した測定をイムノアッセイ法を使用して同じ患者試料中で評価すると CRP の定量的測度元のサンプルで提供される内因性と同位体標識ペプチドから派生します。同位体標識合成ペプチドおよび MRM の使用候補蛋白質バイオ マーカーひと血清抗体と免疫測定法の開発前の細胞診強力な分析法です。
自動車事故の生存者、クラッシュ後の 1 年間の精神の罹患率の 2 つの研究。
慢性外傷後ストレス障害 (PTSD) (1-2 歳） セカンダリ人身傷害自動車事故 （MVAs) 2 つの研究に関連付けられている精神の共同罹患率を評価しました。研究 1 では、75 治療を求めて MVA 生存 (51 PTSD) と 24 の症状がない PTSD について、SCID の評価の結果を比較しました。研究 2 では, 前向き (19 と心的外傷後ストレス、PTSD を持っていた人が、人が送金した 32 と PTSD を基準に会った 81) 彼らの事故の後 12++ ヶ月続いていた 132 の MVA 生存者の間で同様の結果を比較しました。我々 は、同等のレベルの現在の共同病的大鬱病 （53 ％）、任意の気分障害 （62-68 ％）、全般性不安障害 (26%) 任意不安障害 (42%) の両方のグループの参加者と慢性 PTSD が見つかりました。これらの共同罹患率率は非 PTSD 比較グループと同様の MVA の歴史を持つ発見よりも高かった。
研究学生の身代わりとして Traumatization で 9 月 11 日の攻撃: 近接、露出とのつながりの影響。
10 月 2001 年から 2001 年 11 月末までに 3 つの公立大学の大学生から収集にアンケートのかなり大規模なセット （アルバニー、ニューヨーク n 507、オーガスタ、n = 336、ファーゴ、ノースダコタ、n = 526 =) 急性ストレス障害 (ASD) の率と ASD の症状のレベルを評価するために次の 9 月 11 日の攻撃、現在心的外傷後ストレス障害 （PTSD） のレートと心的外傷後ストレス症状のレベル年 9 月 11 日から生じるうつ症状の現在のレベルの攻撃。我々 も情報メディア報道世界貿易センター (WTC) と人事が、血を与えるなどの修復の行為に関与の度合いにつながり、攻撃への露出が vigils に参加集まってください。ASD、ASD のハイレベルを見つけた PTSD の症状と地理的近接度ニューヨーク市 （および学生の家の近さ、アルバニー サイト内） の関数としての心的外傷後ストレス症状とジェンダー。WTC の犠牲者につながりよう露出 （テレビ視聴時間） いくつかのインスタンス内に予測だった。ASD 症状は後続の心的外傷後ストレス症状の最も強い予言者だった。2 次経路モデル PTSD 症状の分散の 60 ％ 以上を占めた。
心的外傷後ストレスと抑うつ症大学人口 1 年 9 月 11 日の攻撃後に: 近接効果。
[覚醒の以前の報告は我々 のフォロー アップとして研 Ther。、プレスで] 外傷後ストレス症状 (PTS)、うつの症状と診断可能性心的外傷後ストレス障害 （PTSD） で 3 つの公立大学 （アルバニー、ニューヨーク州、オーガスタ、ジョージア州、ファーゴ、ノースダコタ) 大学生の 2001 年 9 月 11 日から生じるの頻度のレベル。テロ、我々 の調査学生の対等なグループ (合計、n = 1313年) これら 3 つの機関で、攻撃の最初の記念日 （2002 年） 次の週から。近接効果 (アルバニー ファーゴより高かったオーガスタより高い) を見つけた PTS とうつの症状ではなく、可能性の PTSD の診断の頻度。アルバニーのサイトのデータ内で New York （ニューヨーク） に居住地の郡の近接はまた PTS の近接効果を示した。うつの症状が 2002 年 2001年対大幅に異なっていたが、算術違い PTS または可能性の PTSD の診断の頻度は有意でなかった.9 月 11 日の攻撃は、大学生の精神的な通行料も 1 年後を発揮する続けた。
組換えヒト NAD 合成酵素の活動を監視するため蛍光ベース カップリング反応。
NAD 合成酵素のニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリンへの変換を担当です。この反応は補酵素の生合成経路と、したがって、セルラー削減同等のソースを提供します。細胞の酸化還元電位の変化は多くの病気の状態で要因として関与しています。したがって、この酵素の新しいクラスの潜在的な創薬ターゲットを表すし、我々 の努力、堅牢なアッセイの使用率で高スループットの画面を開発時に焦点を当てていたしたがって。その終わりに向かって我々 サイクリング/増幅反応における乳酸脱水素酵素を用いることによって結合酵素アッセイ形式組換えひと NAD 合成酵素の測定を記述するレサズリン ジアホラーゼ経由から resorufin の蛍光世代に最終的にリンクします。我々 はゴシポールによる結合アッセイ形式、最適化条件および反応阻止 NAD 合成酵素の反応速度を提示 [1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-3,3'-dimethyl-5,5'-bis(1-methylethyl)-[2, 2'-binaphthalene]-8、8'-dicarboxaldehyde] および 384 ウェルのマイクロタイター プレートの均一性の統計情報を示すことによって、アッセイの堅牢性を示しています。以下、総称して我々 の結果アッセイ法が堅牢でこのクラス酵素 NAD + 生合成経路の関与のためにうってつけであることを示します。
心拍数の自動車事故の生存者の救急部、手代木心理反応、ASD、PTSD の重症度： 6 ヶ月前向き研究。
この小規模な研究の救急部 （エド） と急性ストレス障害 (ASD) と心的外傷後ストレス障害 （PTSD） の症状の重症度で提示自動車事故の生存者の心拍数の関係を調査します。また、エドと解離と手代木遭難で報告された 2 週間の posttrauma での生存者の心拍数の関係を調べます。50 自動車事故 (MVA) 生存者だった評価 2 週間, 1 (N = 42)、3 (N = 37) と 6 ヶ月 （N = 37) ポスト MVA。心拍数の ED で自己申告による ASD 症状の重症度と心的外傷後ストレス症状の重症度の臨床医評価 6 ヶ月がのみ 1 または 3 ヶ月で予測しました。被爆者の心拍数の ED で大幅に解離がない手代木苦痛と相関があった。これらの知見は、ASD と慢性的な心的外傷後ストレス症状の重症度の予測因子としての高いエド心拍数の役割をサポート、研究以前の矛盾の結果を明確に助けるかもしれない。
定量的、多重アッセイ低豊富な蛋白質ターゲット質量分析法と安定同位体希釈によるプラズマのため。
バイオ マーカーの探索ではその存在とレベルその後血清または血漿で検証しなければならない候補マーカーのリストを生成します。検証パラダイム シフト公平な発見アプローチからターゲットを絞った、仮説駆動型のメソッドを表すし、依存して特定定量的アッセイ ターゲット蛋白質の選択的検出の最適化します。多くの蛋白質バイオ マーカーの臨床的通貨ナノグラム/ミリリットル範囲以下プラズマに存在しているし、日付 MS ベースのメソッドによってアクセスされています。安定同位体希釈質量分析法をここに記述する結合を使って複数の反応を監視の定量的、開発多重 1 10 ng/ml の範囲で定量限界 3 から変動なしイムノアフィニティーカラム濃縮タンパク質、ペプチドの 15% にパーセント係数を達成するためプラズマ中の六つの蛋白質のための試金。試料処理方法と十分なスループットがあり、回復、および再現性堅牢な検出と定量のタンパク質を開発し、外因性タンパク質の添加により消耗したイムノ プラズマに最適化された健康なドナーからの候補者のバイオ マーカーを有効にします。定量的モニタリングの試金が設計され、署名のペプチッドのために最適化された複数の反応テスト タンパク質から派生します。既知の濃度のスパイク蛋白質でプラズマを用いた較正曲線に基づき、各ターゲット蛋白質の quantitation 1 10 ng/ml の範囲と直線性の限界を少なくとも 1 つの署名ペプチド通常関心の測定範囲で 2 桁以上いたことが決定。検出の限界は、頻繁に高 picogram/ミリリットル範囲にあった。アッセイ パフォーマンスのこれらのレベルは、最大 MS によるプラズマにおけるタンパク質の直接解析に比べて 1000-fold 向上を表し、LC 複数反応モニタリング/MS 前ペプチド レベルでの強い陽イオン交換クロマトグラフィーによる豊富なタンパク質の枯渇と最小限の分別を含むシンプルで堅牢なサンプル処理によって達成されました。ここに示すメソッドは、低レベルのタンパク質血の定量的 MS アッセイを開発するための強固な基盤を提供します。
過敏性腸症候群の治療における集団認知療法の制御された評価。
我々 は、2 つのサイトで無作為化, 210 患者ローマ II 診断された過敏性腸症候群 （IBS） の 3 つの条件の 1 つに、少なくとも中程度の重大度: グループ ベース認知療法 （CT; n = 120）、心理教育的支援団体 (n = 46) アクティブ制御、または集中的症状と日常ストレスの監視として (n = 44)。初期の治療を完了する 1 つ百八十八参加者。これらの症状を監視しかけて CT に交差しました。毎日症状の日記から派生した複合胃腸症状メジャーで解析を扱うことを意図の CT と心理教育的支援団体条件ではなく、CT の監視集中的症状に比べ大幅により改善され、心理教育的支援グループの違いはありませんでした。治療の補完の胃腸症状の同じ複合尺度上の間で再び CT と心理教育的支援団体症状を監視するのに統計的に有意に優れていたが症状複合、またはその他のメジャーの差は認められなかった。個々 の IBS の症状に CT と心理教育的支援の削減で腹部の痛みや圧痛と鼓腸の症状を監視するのに統計的に優勢であった。患者のグローバルな評価治療の終わり 2 つのアクティブ条件症状症状軽減全体的な痛みと幸福感の改善に関する監視する優れた ct の腸の規則の変更を監視するに統計的に優れた示した。175 患者 3 ヵ月フォロー アップのデータ メンテナンスの大幅な改善を明らかにしたまたはマギル疼痛アンケートを含むすべての IBS 症状で有意な改善を続けた。グループ CT と心理教育的援助は、任意のメジャーに違いありませんし続けたグループをサポートします。我々 したがって、そのグループの CT の注目プラセボ対照の条件に優れているわけで結論します。
ストレス症状増悪 IBS 患者の間での役割。
200 以上の治療を求めて過敏性腸症候群 （IBS） の患者がストレスと胃腸症状の日常の受験対策としてストレス (ライフ イベント以上 12 ヶ月、1 ヶ月以上の激論) の回顧的措置の 4 週間完了します。またストレス対策 66 nonill コントロールを得た。過敏性腸症候群患者は、コントロールよりもより頻繁に口論およびコントロールよりも大きなストレス影響を報告します。構造方程式モデリングを使用して、データが両方の週の胃腸 (GI) 症状インデックスの堅牢な自己相関効果のモデルとの整合性と発見 (r =。 84) およびストレス指標 (r =。 73)、IBS 症状ストレスの強い同時効果だけでなく (r =。 90） と逆 (r =。 41)。データも GI 徴候で週 t 1 と t + 2、週 t におけるストレスの影響があったが、彼らは同時週効果および/または自己相関効果を介して媒介されたモデルと一致していた。週 t + 1 または t での胃腸症状週 t におけるストレスから統計的に有意な独立経路 + 2 はなかった。したがって、応力と症状の相互関係を因果関係のよりより多くのサポートです。
ターゲットを絞った質量分析法と安定同位体希釈による患者の血漿中の心血管バイオ マーカーの定量化。
バイオ マーカー候補の検証では、特定のアッセイを選択的に検出し、アクセスできる毛細管のターゲット蛋白質の定量化が必要です。検証の主な目的は、最高品質の候補検出フェーズからのみ前方前臨床検証に取られていることを確認する画面潜在的なバイオ マーカーにです。臨床グレード イムノアッセイ用抗体試薬はしばしば候補者の数が少ないため存在するため、代替方法論は、統計的に実存し得る血清または血漿サンプル数で新しいと根拠のない候補者の資格情報が必要です。複数反応の監視には、安定同位体希釈質量を結合を使用して、プラズマ中の六つの蛋白質心臓傷害の臨床的有効性の定量的、多重アッセイを開発しました。説明プロセス抗体蛋白質またはペプチッドの immunoaffinity 濃縮用必要ありません。制限の検出と定量のターゲット蛋白質のためのサロゲートとして使用される各署名ペプチドの合成ペプチドと健康なドナーからのプラズマを用いた標準添加法によって決定しました。2 から 15 ng/ml のターゲット蛋白質のほとんどの射程距離 quantitation の制限。ナノグラム/ミリリットル範囲心臓 troponins などで低豊富な蛋白質のマーカーの心臓傷害を含む各ターゲット蛋白質から派生した 2 つの署名ペプチドの定量計測が得られました。内・ interassay 係数変化のあった主に < 10 と 25 ％、それぞれ。構成されたマルチプレックス アッセイは、[時間の 3 点 6 アルコール中隔アブレーション肥厚性閉塞性心筋症の患者にわたってこれらの蛋白質のレベルを測定するために使用されました。これらの結果は、MS ベースの多重アッセイ検出のための最初のデモと心臓傷害ミリリットル/低ナノグラム範囲に関連付けられている蛋白質の濃度変化の定量化です。我々 の結果はまた、これらの試金が必要な精度、再現性、および小説と未同定候補バイオ マーカーの血液中のタンパク質の検証用に適用する感度を保持することを示します。
多重開発アッセイ トロポニンをし、インターロイキン-33 プラズマにおけるペプチド イムノアフィニティーカラム濃縮とターゲットを絞った質量分析法による。
彼らは臨床的に検証を進める前に蛋白質バイオ マーカー候補探索プロテオミクスから定量的患者サンプルで確認しなければなりません。ここではペプチド イムノアフィニティーカラム濃縮安定同位体希釈質量分析法 (SISCAPA-MRM) 候補者バイオ マーカーの検証のために適したパフォーマンスをアッセイを構成する使用できると相まってことを示します。原則の証拠として、私 （cTnI）、心臓傷害の確立バイオ マーカーとインターロイキン (IL-33)、33、新興の免疫と心血管マーカーは、堅牢な免疫検査用が現在利用されていないトロポニン SISCAPA アッセイを構成しました。
積極的な安全でない男性の退役軍人の PTSD の住宅治療を受けてで運転。
積極的な危険な運転と 474 の男性の退役軍人復員軍人援護局住宅の治療心的外傷後ストレス障害 （PTSD） の受信に調べた。具体的には、著者らは PTSD 積極的な危険な運転とイラクとアフガニスタン戦争の退役軍人退役軍人他より高いリスクであったかどうかに関連付けられていた場合評価。サンプルの約 3 分の 2 は寿命が積極的な運転と三分の一報告の現在積極的な運転を報告しました。心的外傷後ストレス障害の重大度は積極的な運転、しかしない危険な運転の他の形態と関連していた。イラクとアフガニスタンの退役軍人の率が高い支持し、より頻繁に積極的な運転よりも他のベテランでした。PTSD の重症度の会計後、年齢、収入、およびイラクとアフガニスタン戦争ベテランれ配偶積極的な運転頻度や不定期シートベルトの使用を予測しました。
自動化の研究室間の評価は、血漿中のタンパク質を定量化するためのマルチプルリアクションモニタリング質量分析に結合ペプチドイムノ濃縮を多重化
高精度、感度とスループットを持つ組織や生体液中のタンパク質の多数を定量化することができないでは、バイオマーカー研究における主なボトルネックです。我々は以前MRM-MSに抗ペプチド抗体（SISCAPA）を使用してイムノ濃縮をカップリングすると、高感度、特異度、精度の血漿中のタンパク質を定量化するために多重化することができる免疫MRMアッセイを生成することを実証した。ここで我々は3つの独立したラボでの多重化の研究室間のパフォーマンス（8プレックス）免疫MRM-MSの最初の体系的評価を報告する。段階的な研究は、アッセイCV、LOD、LOQおよびリカバリの各処理と分析のステップの効果が評価されたで行われた。検出限界は血漿30μlのアッセイでのタンパク質の1 ng / mLの以下であった。アッセイの再現性は、プラズマの酵素消化を含めて、全体の免疫MRM-MSの分析プロセスのために、それぞれ、11％のLOQと<14％以上の中央値内と研究室間でのCVSでは、検証研究のための受け入れられた。トリプシン消化し、その必要なサンプルの処理はほとんどのアッセイのばらつきを拠出し、消化タンパク質から標的ペプチドの回収率を減少させた。アッセイの精度を5％向上させながら、代わりに消化過程での損失を考慮して安定同位体標識ペプチドの内部標準として安定同位体標識したタンパク質を使用して、ほぼこのためのアッセイの精度を倍増した。我々の結果は、免疫MRM-MSは独立した研究所を渡って再現することができる多重化やプラズマのような複雑なマトリックス中のタンパク質を測定するために広く採用される可能性を秘めていることを示している。
ペプチドアフィニティベースの質量分析を用いた大規模の評価を定量的プロテオミクスアッセイ開発
安定同位体の基準とそれぞれのタンパク質の代理としてのペプチドの定量的測定を提供するために、複数の反応モニタリング質量分析法による安定同位体希釈し、検出したペプチドの抗ペプチド抗体による捕捉（SISCAPA）カップル親和性濃縮。本稿では、大規模なアッセイ開発のための戦略を通知するためにSISCAPAアッセイに適した抗体の産生の成功率を決定するためのフィージビリティ·スタディを説明します。ワークフローは、単一のタンパク質ターゲットから最大5 proteotypicペプチドは、個々のウサギを免疫するために使用された多重免疫戦略が含まれている設計されています。 89蛋白質のターゲットを表す403 proteotypicトリプシンペプチドの合計が免疫原として使用されました。抗ペプチド抗体価をELISAにより測定した、89のタンパク質を表す220抗ペプチド抗体は、アフィニティー精製のために選ばれました。これらの抗体は、トリプシン消化したヒト血漿マトリックスを使用してSISCAPA-マルチプルリアクションモニタリングアッセイにおいて、その性能に関して特徴付けられた。生成されたアッセイの半分以上は100 ng / ml以下の濃度のタンパク質に対応するヒト血漿中で0.5未満fmolの/μLの濃度で標的ペプチドを検出することが可能であった。多重化5のペプチド免疫原の戦略は、この評価試験では、標的蛋白質の100％の作業分析の生成に成功しました。これらの結果は、単一の研究室では、年間数百のアッセイを開発し、SISCAPAアッセイの費用対効果の高い世代のために計画できるようにすることが可能であることを示します。
