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Articles by Erin B. Fichot in JoVE
JoVE General
미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출
우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.
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미생물 매트에서 높은 분자량 DNA 추출
억제제 세포 외 고분자 물질 (Eps)과 소금 같은 존재로 인해 대부분의 미생물 매트 연구는 너무 큰 삽입 벡터 클로닝을 위한 작은 DNA 조각 귀착되는 가혹한 직접 DNA 추출 방법에 의존 했습니다. 큰 조각 관심의 유전자를 더 중대 한 접근을 제시 하기 때문에 고 분자량 (HMW) DNA 기능 metagenomic 연구에서 결정적 이다. 여기 우리는 EPS 풍부한 hypersaline 미생물 매트에서 HMW DNA를 추출 하기 위한 향상 된 방법론 보고서. 프로토콜 DNA 추출 및 정수 뒤에 폴 리 에틸렌 글리콜 (페그)와 강 수에 대 한 기계적, 화학적 방법으로 미생물 세포 분리의 조합을 사용 합니다. 프로토콜 수익률 > 2 µ g HMW DNA (> 48 kb) A260:280 비율 매트 샘플의 그램 당 > 1.7. 또한 16S rRNA 유전자 분석 변성 그라데이션 젤 전기 이동 법 및 pyrosequencing를 사용 하 여이 프로토콜 미생물 매트 사회와 DNA 추출의 다른 세 가지 표준 방법에 비해 더 높은 전반적인 계산된 다양성 지표 결과에서 대표 DNA를 추출 했다. 우리의 결과 DNA 추출 방법 metagenomic 연구에서 미생물 풍요로 움의 복구를 보장 하기 위해 사용 되는 유효성 검사의 중요성을 보여 줍니다.
특성화 및 폐수 처리 시설 및 주변 해안 생태계에 새로운 β-락 타 마 제 유전자의 정량
폐수 처리 공장 (WWTPs) 설계 구조를 수집 하는, 집중, 그리고 궁극적으로 풀어 치료 인간의 폐기물 로컬 환경에 폐수를 처리 합니다. WWTPs 대부분의 biosolids를 효율적으로 제거 하는 동안 그것은 많은 항생제와 항생제 내성 박테리아 치료 과정을 살아남을 수 표시 되었습니다. 어떻게 WWTPs 영향 농도 및 환경에 항생제 내성 유전자의 보급, 기능 metagenomic 접근 었는 폐수처리 장 내에서 새로운 항생제 저항 유전자를 식별 하는 데 사용 하 고 양적 PCR (qPCR) 시설과 지역 해안 생태계 내의 유전자 복사본 수를 확인 하기 위해 사용 되었다. 폐수처리 장 metagenomic 라이브러리에서 33 상 유전자를 드러내는 하나의 내성 clone (마이크, ≈ 416 μg ml(-1) 암 피 실린)는 시퀀스 및 주석, 포함 된 fosmid 삽입 42% 황색 포도상구균 p c 1에서에서 락 타 마를 기능적으로 특징이 β-제 동일 927-bp 유전자를 포함 하 여. 고립과 subcloning bla(M-1), 라고 하는이 유전자의 암 피 실린 저항 Escherichia의 대장균 숙주에 게 수 여. 볼륨을 정규화 하는 경우 qPCR 마지막 처리 단계에서 농도 2 배 감소 하지만 초기 치료 단계 동안 bla(m-1)의 증가 농도 보였다. DNA 농도 ng(-1) 유출, 그 bla(m-1)은 해안 생태계에 출시 되 고 전반적으로 유전 물질의 상당한 비율이 구성 제안에 형성에서 폐수처리 장 과정 전반에 걸쳐 증가 했다. 평균 방전이 해안 생태계에 매일 발표 하는 bla(M-1) 유전자의 3.9 × 10(14) 복사본 추정 했다. 또한, 유전자 모든 샘플링 된 해안 물과 침전 물 샘플 시설 주변에서 관찰 되었다. 우리의 결과 WWTPs 환경에 새로운 항 생 저항 유전자의 보급에 대 한 경로 수 있습니다 것이 좋습니다.
