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Articles by Frederic Berthiaume in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos
Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.
Other articles by Frederic Berthiaume on PubMed
Influencia De Señales Ambientales En La Regulación Transcripcional De Foo Y Codificación Del Clp Para F165(1) Y CS31A Adhesinas En Escherichia Coli
F165(1) (foo) y CS31A (clp) son adhesinas bacterianas sintetizadas por cepas de Escherichia coli asociada con diarrea y septicemia en lechones y terneros. Pertenecen a la familia de P-regulador y como tal están sujetos a una fase control de variación mediada por Lrp (proteína reguladora de la respuesta de leucina) y reguladores homólogos a PapI. Análisis de la expresión de fusiones transcripcionales entre los promotores de fooB o fooI y lacZ demostró que Lrp es un activador de la transcripción de foo y fooI, mientras que reprime la transcripción de clp. Además, variación de fase de foo conduce a una gran mayoría de las células de la fase-ON, mientras que la variación de fase de clp conduce a una mayoría de fase de células. Se comparó la influencia de varias señales ambientales en expresión foo y clp, con especial atención a los efectos de leucina y alanina conocido ser mediado por la inhibición de la Lrp. o represión significativa de transcripción foo y clp observó a baja temperatura, en medio LB y en presencia de glucosa, alanina y leucina. Represión de glucosa de foo pero no de clp fue totalmente aliviado por la adición de campamento. Osmolaridad y pH tuvieron poco efecto. Alanina pero no leucina y LB medio inhibido foo y clp variación de fase, bloqueo de las células en la fase de apagado. Baja temperatura inhibe la variación de fase de clp y había alterado la frecuencia del interruptor de variación de fase de foo, llevando a más células fase-OFF. Glucosa había alterada la variación de la fase de ambos operones, aumentando el número de células de fase-OFF en la población. El patrón de regulación de foo y clp es consistente con la producción de F165(1) y CS31A en ambientes de nutrientes bajos, incluso a pH moderadamente ácido o elevada osmolaridad.
Influencia De La L-leucina Y L-Alanina En Reglamento De Lrp De Foo, Codificación Para F1651, Un Homólogo Del Pap
El operón de foo codifica F165 1 fimbrias que pertenecen a la familia de P-regulador y son sintetizadas por septicémico Escherichia coli. Usando un host de Lrp-deficiente y el gen de la lrp clonado en el promotor de pBAD de arabinosa, demostramos que foo fue transcrito proporcionalmente a la cantidad de Lrp sintetizada. L-leucina y L-Alanina disminuyeron drásticamente la transcripción de estado estacionario de foo y variación de fase modificada, independientemente de la presencia de FooI. Mutaciones específicas en la región c-terminal de Lrp reducción o había suprimido el efecto represivo de estos aminoácidos, indicando que modula F165 1 afectando Lrp.
Detección De Patógenos Transmitidas Por El Agua Por El Uso De Microarrays Basadas En Oligonucleótidos
Un prototipo de microarray de pequeño-oligonucleótido fue diseñado con sondas específicas para los genes universal 16S rRNA y cpn60 de varios agentes patógenos que se encuentran generalmente en aguas residuales. Además de estos dos objetivos, sondas de oligonucleótidos específicos de WEZE se incluyeron en el microarray para aumentar su poder discriminatorio dentro de la familia Enterobacteriaceae. Cebadores universales de PCR se utilizan para amplificar regiones variables de 16S rRNA, cpn60 y WEZE genes directamente en Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium genomic DNA mezclas (binarios); E. coli, S. enterica serovar Typhimurium y Yersinia enterocolitica genomic DNA mezclas (ternarios); o ADN total de aguas residuales. Productos amplificados fueron etiquetados fluorescencia y cruzado por hibridación en el chip del prototipo. La sensibilidad de detección de S. enterica serovar que typhimurium se estimaba que alrededor del 0.1% (genomas de 10 S. enterica) del total ADN para la combinación de PCR seguida de hibridación de microarrays. La sensibilidad del prototipo podría aumentarse mediante cruzamiento por hibridación amplicones generados por genes objetivos de PCR específicos para un subgrupo bacteriano, tales como los genes WEZE, en lugar de amplicones taxonómica universal. Sin embargo, hubo pruebas de sesgo de la polimerización en cadena que afectan a los límites de detección de un determinado patógeno como cantidades cada vez mayores de un patógeno diferente, se añadieron en las muestras de prueba. Estos resultados demuestran la viabilidad de la utilización de microarrays de DNA en la detección de patógenos transmitidas por el agua en poblaciones mixtas pero también plantean el problema del sesgo de la PCR en tales experimentos.
El Plegable Periplásmico De Un Dominio De Portavehículos Pasajeros Cisteína Interfiere Con Su Translocación De Membrana Externa
Portavehículos son polipéptidos individuales que consisten en un dominio de membrana externa translocación mediar en la translocación de un dominio de pasajeros. El estado periplásmico plegado del dominio pasajero es controvertido. En las comparaciones de los dominios de pasajeros que difieren en sus propiedades de plegado, nuestros resultados sugieren que el plegamiento de los dominios de pasajeros periplásmico interfiere con la traslocación.
Procesamiento Proteolítico No Es Esencial Para Varias Funciones Del Portavehículos Escherichia Coli Adhesina Que Participan En La Adhesión Difusa (AIDA-I)
La Escherichia coli adhesina implicados en la adhesión difusa (AIDA-I), como muchas proteínas autotransporter otros, se libera en el periplasma como una proproteína objeto de tratamiento proteolítico después de su translocación a través de la membrana externa. El proproteína se escinde en un fragmento de membrana integrado, AIDAc, y un fragmento extracelular, la madurez de AIDA-I adhesina. Este último se mantiene no covalentemente asociada con la membrana externa y puede ser liberada por tratamiento térmico. El mecanismo de escisión de la proproteína y su papel en la funcionalidad de AIDA-no se entienden. Aquí, se muestra que la escisión es independiente de la cantidad de AIDA-I en la membrana externa, lo que sugiere un mecanismo autoproteolítica intramolecular o una escisión mediada por una proteasa desconocida. Se demuestra que los dos fragmentos, madura AIDA-I y AIDAc, se pueden cosolubilized y copurified en una conformación plegada y activa. Se observó que la liberación por los resultados del tratamiento de calor a partir del despliegue de AIDA-I y que la interacción de AIDA-I con AIDAc parece estar preocupada sólo por la desnaturalización. Hemos construido un punto uncleavable mutante de AIDA-I, donde se cambió una serina del sitio de corte en una leucina, y demostraron que la adhesión, autoagregación, y la formación de biopelículas mediada por el mutante son indistinguibles de los niveles de tipo salvaje. Por último, se demuestra que ambas proteínas puede mediar en la invasión de cultivos de células epiteliales. En conjunto, nuestros experimentos sugieren que el procesamiento proteolítico de AIDA-I juega un papel menor en la funcionalidad de esta proteína.
Contribución De La AIDA-I De La Patogenicidad De Un Escherichia Coli Y Porcino Diarreogénicas a Través De La Colonización Intestinal Formación De Biopelículas En Los Cerdos
Con el fin de evaluar el papel de la AIDA-I de porcino cepa de Escherichia coli diarreogénica PD20 serogrupo O143 (AIDA-I (+), STB (+)), una cepa mutante PD20M (AIDA-I (-), STB (+) ) se generó a partir PD20 cepa por un procedimiento de intercambio alélico. Además, el gen de longitud completa aida fue reintroducido en PD20M cepa para generar la cepa complementada PD20C (pTaidA, AIDA-I (+), STB (+)). Un no-patógena cepa de E. coli PD71 se utilizó como control negativo. Cada cepa se inocularon a los cerdos recién nacidos a través de un tubo estomacal. La severidad de la diarrea fue evaluado clínicamente y se evaluó la colonización intestinal por medio de histología, inmunohistoquímica (IHC), y microscopía electrónica de transmisión (TEM), incluyendo inmuno-microscopía electrónica (IGEM). El patrón de adhesión a células HeLa, la formación bacteriana de auto-agregación y la biopelícula se evaluó in vitro. Los cerdos infectados con cepas PD20 o diarrea PD20C desarrollado 16 y 28h después de la inoculación, respectivamente, en contraste con los cerdos infectados con cepas PD20M o PD71. Histología, inmunohistoquímica, TEM y los exámenes mostraron iGEM colonización bacteriana pesada con la formación de biopelículas en el intestino grueso, y marcado en la expresión in vivo de la AIDA-I proteína en cerdos infectados con cepas PD20 o PD20C en contraste con los cerdos infectados con cepas PD20M o PD71. Los ensayos in vitro mostraron en la adherencia marcada difusa de las células HeLa, una mayor formación de biopelículas bacterianas de auto-agregación y significativa (p <0,05) por la AIDA-I (+) cepas, en comparación con AIDA-I (-) las cepas. Estos resultados demuestran que la expresión de AIDA-I es esencial para la colonización intestinal y en autoagregación bacteriano in vitro y la formación de biopelículas. Así, AIDA-I puede ser considerado un determinante de virulencia importante en el desarrollo de la diarrea causada por porcino diarreogénica AIDA-I (+) E. E. PD20 en los lechones.
Las Mutaciones Que Afectan a La Biogénesis De La Portavehículos AIDA-I
Portavehículos son sistemas simples que bacterias Gram-negativas emplear para secretar proteínas a sus superficies o en el medio extracelular. Se componen de un dominio N-terminal de pasajeros y un dominio C-terminal que está pensado para insertar en la membrana externa y mediar en la secreción del dominio de pasajeros. A pesar de la aparente sencillez de estos sistemas de secreción, su mecanismo de desplazamiento aún no se conoce completamente. Para estudiar este mecanismo, se utilizó el autotransporter adhesina AIDA-I de E. coli. Hemos introducido mutaciones en varios sitios en una región de unión del dominio de pasajeros, cerca de la membrana de dominio embebido. Hemos observado que las mutaciones afectado dramáticamente la biogénesis de AIDA-I. Las mismas mutaciones, sin embargo, no afectó a la translocación de una construcción quimérica donde Male, la E. coli periplásmico proteína de unión a maltosa, sustituye la mayor parte del dominio de pasajeros de AIDA-I. Nuestros resultados enfatizan la función de esta región en la biogénesis de AIDA-I y sugieren que desempeña su papel mediante la interacción con y / o la promoción de plegado de los dominios de pasajeros nativos.
O-glicosilación Asegura Que La Conformación Normal De La Portavehículos Adhesin Participa En Adherencia Difusa
La Escherichia coli adhesina implicados en la adhesión difusa (AIDA-I) es una de las pocas proteínas glicosiladas encontrados en E. coli. La glicosilación está mediada por una heptosyltransferase específica codificada por el gen aah, pero poco se sabe sobre el papel de esta modificación y el mecanismo involucrado. En este estudio, se identificaron varios péptidos de AIDA-I modificados por la adición de heptosas mediante el uso de espectrometría de masas y secuenciación N-terminal de los fragmentos proteolíticos de AIDA-I. Una treonina y 15 residuos de serina fueron identificados como heptosas cojinete, lo que demuestra por primera vez que AIDA-I es O-glicosilado. Hemos observado que no glicosilada AIDA-I se expresa en cantidades más pequeñas que sus contrapartes glicosilada y muestra signos de degradación de amplias sobre la extracción de calor. También se observó que no glicosilada AIDA-I es más sensible a las proteasas e induce el estrés extracitoplásmico importante. Por último, como se ha mostrado anteriormente, hemos observado que la glicosilación se requiere para AIDA-I de la media en la adhesión a células epiteliales cultivadas, pero purificado madura AIDA-I fusionada a GST se encontró que se unen a las células in vitro o no se glicosiladas. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que la glicosilación es necesario para asegurar una conformación normal de AIDA-I y puede ser sólo indirectamente necesaria para su función de enlace de células.
Escherichia Coli Toxina STb Enlaces a Sulfatado Y Su Inhibición Por Carragenina
Escherichia coli STb calor es una causa importante de diarrea en los lechones. STb fue demostrado que interactúan específicamente con sulfatado (3'-sulfogalactosyl-ceramida) presente en la superficie de las células epiteliales de los lechones yeyuno. Datos básicos carecen de la unión a STb sulfatado presente en la solución y más precisamente sobre la posible inhibición de esta interacción. Uso de tecnología de resonancia de plasmones de superficie, se compara la unión de receptor a glycoshingolipids sulfatado y otros anteriormente señaladas, con un ensayo multidisco vinculante, para interactuar también en diversos grados con la enterotoxina. Además, la inhibición de STB-sulfatado unión se estudió con galactosa libre, los residuos de galactosa-sulfato y un polímero de galactanos sulfatados conocidos como carragenano. Se determinó una constante de disociación de 2,4 ± -0,61 nM para la interacción STB-sulfatado. Estos datos indicaron que era STb unión a sulfatado con mayor afinidad que previamente determinada utilizando la toxina radiomarcada. Afinidades mucho más bajos se observaron en lactoceramide y glucoceramide. La unión de STB para sulfatado fue claramente inhibida por lambda-carragenano, pero no por galactosa, 4-SO (4)-galactosa o 6-SO (4)-galactosa. La inhibición de la STb unión a su receptor se logró utilizando lambda-carragenano en concentraciones picomolares. Luego, con el IPEC-J2 células en cultivo y citometría de flujo, se demostró que lambda-carragenano fue capaz de inhibir el proceso de permeabilización asociado con STB.
Cambio De Conformación En Un Auto-reconocimiento De Portavehículos Modula Bacteriana De La Célula-célula La Interacción
Las bacterias viven sobre todo en comunidades multicelulares, a pesar de que son organismos unicelulares, sin embargo, los mecanismos que vinculan las bacterias individuales en forma conjunta son a menudo mal entendido. La adhesina implicados en la adhesión difusa (AIDA-I) es una adhesina de cepas de Escherichia coli diarreogénicas. AIDA-Yo también media bacteriana de auto-agregación y la formación de biopelículas y por lo tanto podría ser importante para la organización de las comunidades de los agentes patógenos. Utilizando proteína purificada y bacterias enteras, nos proporcionan pruebas directas de que AIDA-I promueve la auto-agregación al interactuar con ella misma. Utilizando diversas técnicas biofísicas y bioquímicas, se observó un cambio conformacional en la proteína durante la AIDA-AIDA interacciones, el fortalecimiento de la idea de que se trata de una interacción muy específicos. La auto-asociación de AIDA-I es de alta afinidad, pero puede ser modulada por cloruro de sodio. Se observa que una sal biliar, desoxicolato de sodio, también evita que AIDA-I oligomerización y bacterianas de auto-agregación. Por lo tanto, proponemos que AIDA-I, y la mayoría de los probables Portavehículos otros similares como el antígeno 43 (Ag43) y TIBA, organizar a las comunidades bacterianas de los patógenos a través de un mecanismo de auto-reconocimiento de que es sensible al medio ambiente. Esto podría permitir que las bacterias para cambiar entre los modos de vida multicelulares y unicelulares para completar su infección.
Composición Molecular De Staufen2 Contienen Ribonucleoproteínas En Cerebro De Rata Embrionaria
Mensajero de partículas de ribonucleoproteína (mRNPs) se utilizan para el transporte de los ARNm a lo largo de las dendritas neuronales a su sitio de la traducción. Numerosas proteínas de unión a ARNm y de reglamentación dentro de mRNPs finamente regular el destino de determinado con el ARNm. Su combinación específica define diferentes tipos de mRNPs que a su vez están relacionados con las funciones específicas sinápticas. Una de estas proteínas de unión a ARNm, Staufen2 (Stau2), se demostró que el transporte de mRNAs dendríticas largo de los microtúbulos. Su expresión desmontables en las neuronas se demostró que cambiar la morfología columna y funciones sinápticas. Para comprender mejor los mecanismos moleculares por los cuales Stau2 modula la función sináptica en las neuronas, es importante para identificar y caracterizar las proteínas co-factores que regulan el destino de Stau2 contienen mRNPs. Para este fin, un enfoque proteómico se utilizó para identificar co-inmunoprecipitadas proteínas en Staufen2 contienen mRNPs aisladas a partir de cerebros de ratas embrionarias. El enfoque proteómico identificaron las proteínas de unión del mRNA (PABPC1, hnRNP H1, YB1 y HSC70), las proteínas del citoesqueleto (alfa y beta-tubulina) y RUFY3 una proteína mal caracterizado. Mientras PABPC1 y YB1 asociado con Stau2 contienen mRNPs a través de ARN, HSC70 está directamente ligado a Stau2 y esta interacción está regulada por la ATP. PABPC1 y YB1 proteínas forman puntos lagrimales en las dendritas de las neuronas del hipocampo de ratas embrionarias. Sin embargo, mal co-localizada con Stau2 en los complejos dendríticas grandes que sugieren que son más bien los componentes de las partículas de mRNA Stau2 contienen. En conjunto, estos resultados representan un paso más en la caracterización de Stau2 contienen mRNPs en las neuronas y proporcionar nuevas herramientas para estudiar y comprender cómo Stau2 contienen mRNPs son transportados, en traslación silenciados durante el transporte y / o local expresó de acuerdo a las necesidades de la célula.
El Crecimiento De La Fase Dependiente De La Expresión Del Operón Que Codifica Para Los Glucosilada Portavehículos Adhesina AIDA-I De Escherichia Coli Patógena
La adhesina involucrados en la adherencia difusa (AIDA-I) es un autotransporter encuentra en las cepas patógenas de E. coli que causan diarrea en humanos y cerdos. La proteína AIDA-I está glicosilada por una enzima específica, la heptosyltransferase AIDA-asociado (aah). El gen aah es inmediatamente aguas arriba del gen aida, lo que sugiere que forman un operón. Sin embargo, los mecanismos de regulación de la AAH y de los genes de aida son desconocidos. El uso de un clínicos de E. coli cepa expresar AIDA-I, se identificaron dos supuestos promotores 149 y 128 nucleótidos aguas arriba de la AAH. Usando QRT-PCR, se observó que aah y Aida se transcriben en una forma dependiente de crecimiento, principalmente en el comienzo de la fase estacionaria. Western Blot confirmó que la expresión de proteínas sigue el mismo patrón. Usando una fusión de un gen reportero, se observó que la regulación del promotor aislado aah coincidió con este patrón de transcripción y expresión. Por último, hemos encontrado glucosa a ser una inanición represor y nutrientes a ser un inductor. En conjunto, nuestros resultados sugieren que, en la cepa y las condiciones que hemos estudiado, aah-AIDA se transcribe como un mensaje bicistrónico partir de un promotor aguas arriba de la AAH, con la máxima expresión bajo condiciones de limitación de nutrientes, tales como alta densidad celular.
Un Motivo Estructural Es El Sitio De Reconocimiento Para Una Nueva Familia De Proteínas Bacterianas O-glicosiltransferasas
La Escherichia coli Adhesin Participa en la adhesión difusa (AIDA-I) es una proteína multifuncional que pertenece a la familia de Portavehículos monoméricas. Esta adhesina puede ser glicosilada por el heptosyltransferase AIDA-asociado (AAH). Glicosilación parece estar restringida al dominio extracelular de AIDA-I, que comprende repeticiones imperfectas de una secuencia de consenso 19-amino-ácido y se prevé para formar una β-hélice. Aquí, mostramos que Aah homólogos se pueden encontrar en muchas bacterias Gram-negativas, incluyendo Citrobacter rodentium. Hemos demostrado que una proteína de AIDA-al igual que está glicosilada en esta especie por el homólogo Aah. Estamos entonces a analizar el mecanismo de reconocimiento de sustrato de la E. coli Aah heptosyltransferase. Hemos encontrado que un péptido correspondiente a una repetición del consenso 19-amino-ácido es suficiente para el reconocimiento y la glicosilación por Aah. Estudios de mutagénesis sugerido que, inesperadamente, Aah reconoce un motivo estructural típico de beta-hélices, pero no una secuencia específica. De acuerdo con este hallazgo, se observó que el dominio extracelular de la pertactina Bordetella pertussis, una β-helicoidal polipéptido carece de la secuencia consenso 19-amino-ácido, podría estar glicosilados por Aah. En general, nuestros resultados sugieren que Aah representa el prototipo de una nueva familia grande de proteínas bacterianas O-glicosiltransferasas que modifican varios sustratos reconocidos a través de un motivo estructural.
