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Articles by Graham Knott in JoVE
JoVE Neuroscience
集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡
Centre of interdisciplinary electron microscopy, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
このプロトコルは、樹脂の埋め込み脳組織を走査型電子顕微鏡、集束イオンビームの3次元で準備し、画像化する方法について説明します。
Other articles by Graham Knott on PubMed
成体マウスのウィスカ刺激による Gaba 作動性シナプスの樹状突起棘の形成。
開発中は、感覚的な体験の変化特に樹状突起スパインのレベルでの皮質ニューロンの構造を変更します。同じように適応は大人の皮質の可塑性に関与している？ここで我々 成体マウスを自由に移動で単一ウイスカー刺激の 24 hr 期間、36 ％、合計シナプス密度対応する皮質バレルに増加した. します。これは棘上発見興奮性および抑制性のシナプスの増加によるものです。4 日後刺激、棘への抑制性入力 pre-stimulation のレベルに戻る、トータルのシナプス密度にもかかわらず残る。層 IV 細胞の機能解析すぐに刺激と同様後 4 日後に変更された応答特性を示した。これらの結果に大脳皮質の感覚情報の流れを変更する成人では、シナプス回路の活動依存的変化を示します。
大人の皮質における経験依存的シナプス可塑性の長期の in Vivo イメージング。
行う新しいフォーム経験依存的可塑性をサポートするために大人の皮質シナプス？我々 この問題に対処するには、数週間の期間にわたってマウスのバレル皮質の個々 の錐体細胞をイメージした繰り返し。我々 は樹状構造が安定しているが、いくつかの突起が表示または非表示を発見しました。背骨の有効期間で大きく異なる: 安定した棘、約 50 ％、人口の残るは少なくとも月残り数日のために存在または少ない一方。シリアル セクション電子顕微鏡イメージングされた樹状突起セグメントのレトロスペクティブ背骨の萌芽と撤回シナプス形成と除去に関連付けられていることを明らかにしました。皮質受容野の経験依存的可塑性は増加シナプスによる売り上げ高を伴っていた。我々 の測定では、感覚的経験ドライブの形成とシナプスの除去と適応の神経回路のリモデリングこれらの変更の根底にあるかもしれないことを示唆しています。
単一ニューロンのリリース サイトの形態および分子不均一。
我々 は以前のシナプス蛋白質のためのラベリングの強度が強くシナプスのボタンの間で変わることを示しています。ここで単一ニューロンの異なるアクティブ リリース サイトで異種レベル積分膜のシナプス小胞タンパク質あるかどうか、およびこれらのサイトはシナプスの微細構造的特徴を持っている場合として質問を取り上げます。ダブル-免疫染色シナプトフィジン, シナプトタグミンに対する特定の抗体により I、VAMP1、VAMP2、我々 は異なる相対これらの積分膜蛋白質レベルに比べてボタン同じラット大脳皮質ニューロンのシナプス小胞の識別。この不均一性は [gad65 間 VAMP1 と VAMP2 も観察できます。両方ヴァンプ アイソ フォームを含む、神経伝達物質の放出に関与しているこれらのタンパク質のペアを研究することによって我々 も彼らが内面化し、FM1 43 カリウム刺激時にリリース主に 1 つのタンパク質に含まれるサイトそれにもかかわらず機能、ことを示した。電子顕微鏡を使用して、私達はこれらのアクティブ サイト シナプスの専門分野や小胞を含む機能持っていることを示す varicosities シナプス後ターゲットなし。異なる varicosities 同じニューロンのシナプス小胞タンパク質の異なる強度を示した;いくつかの varicosities は internalizing 他人は沈黙を守っていた間 FM1 43 を解放することができるだった。積分膜シナプス小胞タンパク質機能リリース サイトの中で同じニューロンの特異的分布していることが示唆されました。
グリア グルタミン酸トランスポーターと成熟マウス体性感覚皮質の。
成体の神経系のグルタミン酸作動性神経伝達はしっかりとグリア グルタミン酸 reuptake によって特定のトランスポーター GLT 1 および GLAST を通してニューロン-グリア細胞の相互作用によって制御されます。ここでは我々 マウスの体性感覚皮質の構造的・機能的成熟にこれらの運送者の役割を探検しました。Glt-1 および GLAST 早期かつ選択的に P10 P5 からバレルで表現されることの証拠を提供します。電子顕微鏡と共焦点式がグリア膜に制限されていることを確認します。P12 とイムノブロット法、GLAST と GLT 1 バレル パターンによって観測された増加グローバル式にもかかわらず染色は、もはや明らかです。P10 GLT 1-/- と GLAST-/- マウスで、バレルのウズラ偏析が保持されます。しかし、P9-10、デオキシグル吸収によって測定した、ウィスカ刺激への機能の応答は著しく GLT-1-/- と GLAST-/- マウスで減少です。代謝応答 GLAST-/- マウスで P11-12 では既に復元は、成人期にそのまま残りますので GLAST の役割は一時的です。ただし、GLT 1 の削除は、成人期まで機能代謝応答を損なうようです。我々 のデータは、ウィスカ表現における体性感覚皮質の機能的成熟におけるグリア グルタミン酸トランスポーターによるグリア ・ ニューロン相互作用が関与していることをお勧めします。
脳由来神経栄養因子ヘテロ マウスの大人の体性感覚皮質のシナプスの形成を変更しました。
増加の感覚刺激成人のウィスカ バレル経路では BDNF の発現を誘導する皮質層 IV におけるシナプス形成だけでなく。ここでは、我々 は BDNF BDNF 発現の減少レベルによって特徴付けられる BDNF のヘテロ マウスの微細構造解析によるニューロン間の接続の変更の役割を果たしているかどうかを調べた。シリアル セクション電子顕微鏡を使用して、シナプス密度, スパイン形態と BDNF のレベルが低下を持つマウスは野生型のコントロールからと区別がバレル区画が表示するシナプス小胞の分布を測定しました。ただし、ウィスカ刺激後 24 時間に、ヘテロ接合体マウスにおけるシナプス形成の徴候はありません。興奮性と抑制性シナプスのバランスがコントロールで変更されるに対し、アレルに一定になります。興奮性シナプスにおけるシナプス小胞の分布が同一のヘテロ接合体および野生型マウスと刺激パラダイムによる影響を受けない。背骨のボリュームは、しかし、野生型動物における刺激によって変更されず、ヘテロ接合体の動物で大幅に増加しています。これらの結果は in vivo BDNF が重要な役割が増加の感覚入力の結果としての大人の皮質回路の構造的再編果たすこと、証拠を提供します。
スパインアクチン細胞骨格の制御による脊椎の成長とシナプス形成の誘導
我々は脊椎アクチン細胞骨格、脊椎の形態形成、アクチン結合タンパク質NrbIとその欠失変異体の発現を操作することにより、シナプス形成の調節との関係を検討した。培養ラット海馬スライスの錐体ニューロンでは、NrbIは、アクチン細胞骨格に結合することにより、樹状突起棘に集中している。 1 NrbI欠失変異体の発現は、アクチン結合ドメインを含む、大幅にシナプスの樹状突起棘の密度と長さを増加させた。このhyperspinogenesisが強化されたアクチンの重合と脊椎の運動を伴っていた。シナプスの強さは、ニューロンあたりの総シナプス入力を一定に保ち、余分なシナプスを補うために減少した。我々のデータは、シナプス形成がアクチン駆動運動によって促進されているモデルをサポートしています。
細胞内ドメイン制限 Gaba 作動性神経不在で一次視覚野における感覚および視床入力の。
それによって差動入力、統合およびプリンシパルのニューロンの出力を規制する制限付きの細胞内ドメインの gaba 作動性シナプスの異なるクラスの対象がこのようなシナプス偏析の基になるメカニズムは明確ではないです。ここで 2 つの主要なクラスの gaba 作動性の分布シナプスに沿って perisomatic と錐体細胞の樹状突起のドメインが in vivo での一次視覚皮質と皮質脊髄文化間区別されたを表示します。したがって、ターゲット細胞内シナプス視床入力の独立して、おそらく分子ラベルや活動の経験に依存しないフォームが含まれます。
経験と Perisomatic Gaba 作動性神経支配一次視覚野における重要な産後の期間中の活動依存的成熟。
新皮質の gaba 作動性ネットワークは異なる生理学的性質を表示し、そのプリンシパルのニューロンの細胞内コンパートメントに神経支配をターゲット多様な介在ニューロンの細胞の種類で構成されます。抑制の監督、相馬に向けてと近位樹状突起が錐体ニューロンの出力の調節に重要であるが、perisomatic の神経支配の開発が特定のシナプス マーカーの不足のためよくわかっていません。一次視覚野では、たとえば、それかどうか、およびどの程度の形成と perisomatic シナプスの成熟皮質回路に内在しているまたは感覚的経験によって規制されている不明です。ここではその perisomatic を示す定義済みのクラス perisomatic の緑の蛍光蛋白質とシナプスそのラベル細菌人工染色体トランスジェニック マウスを用いた神経支配アイ開口後の長引く産後期開発。Perisomatic 神経支配の成熟は visual の剥奪の感覚入力のための重要な役割を implicating 第三に、しかしない第五に、生後週の間に大幅に抑制されました。組み込みの脳内メカニズムの役割を調べるするには、perisomatic シナプスから単一バスケット介在ニューロン皮質切片培養における可視化する手法を開発しました。特徴 perisomatic シナプス ターミナルの別個の分岐の延長と perisomatic ボタンの増殖を伴う紋切り型のプロセスを通じて形成されました。神経脊髄の文化にスパイクのボタンと、拡張子がないメンテナンス、末端枝の増殖のために必要があります。一緒に、我々 の結果は perisomatic シナプスの形成は皮質に固有ですが、視覚体験成熟およびパターン重要な産後の期間中に perisomatic の神経支配の皮質回路内の神経活動のレベルを調節することによって影響することができることをお勧めします。
In Vivo での新皮質における一過性と永続の樹状突起スパイン
樹状突起スパイン日間大脳皮質錐体ニューロン （レイヤー 5、2/3) in vivo の頂端の房の数ヶ月をイメージしました。薄い棘のほんの一部は、登場し、ヶ月間ほとんど太い棘を保持しながら数日間姿を消した。体性感覚皮質では、生後日 (PND) 16 PND 25 から背骨リトラクト追加、棘の純損失を超えました。永続的な棘の分数 (生涯目または = 8 日） 開発中と大人 (PND 16-25, 35%; に徐々 に成長PND 35 80 54%;PND 80-120, 66%;PND 175-225, 73%)、成人の脳にもシナプス回路の安定化を継続する証拠を提供する既知の重要な期間の閉鎖後長い。6 ヶ月齢マウスにおける棘もっとゆっくりおそらくこれらの脳部位における経験依存的可塑性の能力差を反映して、体性感覚野と比較してビジュアルで裏返します。
主知覚求心性神経支配南米オポッサム ハイイロジネズミオポッサム イエバエの発展途上の表在性脊髄後角の。
背側角表層 (SDH) の一次知覚神経支配の開発生後フクロネズミ ハイイロジネズミオポッサム イエバエの DiI と一次求心性神経のラベリング GSA-IB(4) レクチン結合とカルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP) 免疫活性と一次求心性サブポピュレーションのラベルを用いて調査しました。また、脊髄の頸部や腰部領域 SDH の神経支配のタイミング比較を行った。SDH への最初の一次求心性投射後根エントリ ゾーンの最も外側の部分から生後 5 日目で現れるし、イエコウモリの厚さ、SDH の残り罰金の分枝静脈瘤繊維によって神経支配になる前に外側のエッジに向かって SDH の周りのプロジェクト ラミナ V. SDH の神経支配はゆっくりと 2 番目と, 出生 3 週間にわたって、発生します mediolaterally によって移入になって最も背側面と静脈瘤繊維指向します。GSA-IB(4) レクチンとラベリングまた脊髄後角の外側端の繊維と SDH は P5 の GSA-IB(4) 上の SDH/ラミナ V 一次求心性神経、脊髄への彼らの予測を作っているときに表されることを示すラベル。対照的に、CGRP 免疫陽性の求心性神経は外側脊髄後角にはいくつかの短い突起が観察されたときの生後日 7 日まで明らかでなかった。これらの求心性神経パターンと同様、数日の待機時間が GSA-IB(4) プロジェクトの開発に続いてください。CGRP ラベリングの大人のパターン生後 30 日目まで見られなかったに対し GSA-IB(4) によるラベリングの大人のパターンは生後 20 日目についてによって達成されます。電子顕微鏡開発途上の SDH の地域でいくつかの未熟なシナプス生後 10 日で明らかに、糸球体のシナプスの (およびこうして一次求心性起源の) の前駆体であると考えのプロセスは、最初に生後 16 日目で見ていたし、その生後日 28 と 55 の間の決定的な外観を採用します。新生児ハイイロジネズミオポッサムの前肢の構造と機能の開発は後肢よりもより高度なですが、我々 大幅な遅延の証拠はほとんど脊髄の侵略の一次求心性神経によって頚椎・腰椎地域で発見します。吻側および尾側脊髄切片のおおよそ類似の幼外観とともに、これらの観測は、彼らが支配する四肢とは異なり、脊髄地域大 rostrocaudal グラデーションの成熟に出品しないという、お勧めします。
軸索の枝と大人の新皮質におけるボタンの細胞タイプに固有の構造の可塑性。
レイヤー （L） 1 のマウスのバレル皮質の in vivo における軸索のイメージを作成します。視床と L2/3/5 または錐体細胞識別された L6 からの軸索の明瞭な形態に基づきます。その分岐パターンやサイズ ヶ月の倍以上は安定していた。ただし、軸索の枝とボタン セル型固有の再編成を表示しました。視床皮質求心性神経の可塑性が主に伸長および分岐 (範囲, 1 150 microm 4 日間; 軸索の全長の約 5%), 中ボタンの大半の撤回のため保存 9 ヶ月間 (永続化 1 ヶ月以上約 85%)。対照的に、L6 軸索 terminaux ボタンは非常にプラスチック製であった (永続化 1 ヶ月以上約 40%)、他皮質軸索のボタンは、可塑性の中間レベルを示した。回顧的電子顕微鏡ボタン新しいシナプスを作ることを明らかにしました。私たちのデータ構造の塑性軸索の枝とボタンの特定の機能回路のリモデリングに寄与することをお勧めします。
毛様体神経栄養因子アストロ サイトがアクティブになります、そのグルタミン酸トランスポーター GLAST と GLT 1 ミクロ ドメイン、いかだを再配布し、in Vivo グルタミン酸ハンドリングが向上します。
グルタミン酸恒常 in vivo 活性化アストロ サイトの機能の役割を研究するには、我々 を介してレンチ ウイルス媒介性遺伝子配達毛様体神経栄養因子 (CNTF) のラット線条持続アストロ サイトの活性化モデルを使用しました。CNTF 活性化アストロ サイト肥大、表現の未熟な中間径フィラメント蛋白質と非常にそのグルタミン酸トランスポーター GLAST および GLT 1 のグリコ フォーム.CNTF 過剰発現グルタミン酸取り込みの重要ないかだ機能膜マイクロ ドメインに再分配 GLAST および GLT 1 の生産。対照的に、CNTF は神経タンパク質の発現と線条体中のとげのあるニューロンから記録された自発的なグルタミン酸伝達の検出可能な影響を与えなかった。これらの結果は、組換え CNTF 混合ニューロン ・ グリア線条体文化上の応用による in vitro でレプリケートされました。マイクロダイアリシス ラット線条体を使用して、我々 キノリン (QA) によって誘導される細胞外グルタミン酸の蓄積が減少したが見つかりました CNTF で 3 倍。この結果に沿って CNTF は QA 誘起 [(18) F] 大幅増加 - フルオロ - 2-デオキシグル コース取り込み、アストロ サイトによるグルタミン酸取り込みの間接インデックス。一緒に、これらのデータはより良い細胞外グルタミン酸の増加レベルのハンドリングにつながる表現型および分子変更マーク CNTF 活性化アストロ サイト in vivo に関連付けられていることを示しています。活性化アストロ サイトしたがってグルタミン酸の恒常性の欠陥を含む病理学的条件での重要な prosurvival エージェントがあります。
新皮質における経験依存的および細胞型特異背骨の成長。
小説の感覚的経験を大人の新皮質における機能的回路を調整するがシナプス メカニズムは不明のまま。脳の回路は成長と樹状突起棘シナプス形成と除去の撤回に変えることができます。層 5 b の頂端の房の (L5B) マウスのバレル皮質の錐体細胞、樹状突起スパインのサブセットの表示、ほとんど棘ヶ月のため永続的であるに対し日間で消えます。ベースラインの条件下で新しい棘はほとんどが一時的なものし、はほとんど 1 週間以上生き残る。過渡棘は永続的な棘が多い通常 dffits は小さいことに傾向があります。ほとんどの興奮性シナプス皮質における棘上発生するシナプス サイズと alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole のプロピオン酸 (AMPA) 受容体数背骨ボリュームに比例するので、錐体細胞の励起おそらくシナプスを介して永続的な棘上駆動されます。ここで、我々 世代と永続的な棘の損失小説の感覚的経験によって強化されてかどうかテストします。1 か月の大脳皮質の適応的機能変化を誘導するパラダイムに代替のひげ、トリミング後の樹状突起スパイン繰り返しイメージしました。ウイスカー トリミング新しい棘安定化し、不安定に以前永続棘。新しい永続的な棘は常にシナプスを形成しました。彼らは優先的 L5B ニューロンに単純な房ではなく、複雑な頂タフツに追加されました。我々 のデータは、小説の感覚的経験が皮質ニューロンのサブクラスで新しい棘の安定化を駆動を示しています。これらのシナプス変化おそらく経験に依存する特定の新皮質回路のリモデリング根底にあります。
背骨の成長シナプス形成 in Vivo 成人大脳皮質に先行します。
樹状突起スパインが出たり消えたりする経験依存的に。いくつかの新しい棘シナプスを含むように示されているが、少し背骨添加とシナプスの形成、これらのイベントの相対的な時間コースとの関係について知られているまたはかどうか彼らは軸索のボタンの de novo 成長に結合されています。私たち大人のマウスのバレル皮質の樹状突起棘の利得および損失を追跡 1 ヶ月以上をイメージしました。我々 は棘の微細構造を分析し、ボタンに関連付けられたシリアル セクション電子顕微鏡を使用して。4 D のためまたはより常に永続化棘シナプスがあったに対し再建後まもなく彼らはしばしば登場棘シナプス、欠けていた。新しい棘大規模な表面のボリューム比率と他のシナプスを優先的に問い合わせたボタンがあった。いくつかのインスタンスでは、2 つの新しい棘同じ軸索に連絡。我々 のデータは、脊椎の成長にはシナプスの形成とその新しいシナプス フォーム既存ボタンに優先的前にある見る。
成体マウス皮質アストロ サイト カバレッジとグルタミン酸トランスポーター発現の可塑性。
アストロ サイトはグルタミン酸細胞外のコンパートメントからの除去で主要な役割を果たします。このクリアランスは、グルタミン酸受容体の活性化を制限し、シナプス応答に影響を与えます。この関数はアストロ サイトの GLT1 と GLAST その高親和性グルタミン酸トランスポーターの発現レベルだけでなく、その周りシナプス、ポジショニングに依存しています。西部のしみの分析と電顕シリアル セクションを使用して、我々 はこれらのパラメーターの大人の皮質感覚活動の変化をどのように影響を検討しました。マウスを使用して、我々 は 24 h が見つかりましたウィスカの刺激の GLT1 と GLAST 式バレル野の対応する皮質列が 2 倍に増加。刺激を停止した後は、ニューロンのグルタミン酸トランスポーター EAAC1 式全体で不変に残った一方、基底レベル 4 d を返します。同じ地域からの微細構造の解析は、感覚刺激の興奮性のシナプスの樹状突起棘上のアストロ サイトの包絡も大幅な増加を引き起こすことを示した。変更の神経活動の期間とグルタミン酸のシナプスのリリース、増加のアストロ サイト カバレッジのブートン背骨インターフェイスとアストロ サイトのプロセスにおけるグルタミン酸トランスポーター発現の増加につながることを締結します。
GAD67 を介した GABA の合成とシグナリング視覚皮質の抑制性シナプス神経支配を調節します。
神経活動による gaba 作動性抑制回路の開発の形をしたが、基になるメカニズムは明確であります。ここでは、GABA は主に、抑制の送信機として知られているとき思春期の脳の gaba 作動性神経支配調節する GABA の新規機能を示しています。条件付きのノックダウン レート制限合成酵素 GAD67 思春期の視覚野におけるバスケット介在ニューロンの軸索の枝分かれでセル自律赤字、錐体細胞と神経支配フィールドの複雑さの周り perisomatic シナプス形成結果;同じ操作は、後の保守 perisomatic シナプスの少し影響があった。GABA の欠乏のこれらの効果は、GABA 受容体アゴニストで GABA の reuptake を抑制することにより救出されました。生殖細胞のノックダウン GAD67 がない GAD65 の GAD67 の特定のロールにおける perisomatic の神経支配の成熟を示唆して、類似の赤字を示した。GABA の細胞内レベル神経の作業によってモジュレートされますので、我々 の結果 GAD67 を介した GABA 合成抑制性神経支配パターンの活動依存的な調節に巻き込みます。
樹状突起スパインの可塑性 ― in Vivo での研究から理解現在。
感覚的な体験の変化、成人の脳の神経回路の機能を変更します。この柔軟性の接続の強さを変更するには、ニューロンの能力に依存しています。成人大脳皮質の興奮性結合最も in vitro および組織学的解析が示されていることで神経可塑性に関与する樹状から突起スパインに発見されます。今の in vivo イメージング技術の最近の発展は成体脳における経験依存的可塑性を探索する機能を提供します;感覚のマップの機能的組織再編に伴う変化神経接続の。多光子レーザ走査型顕微鏡トランスジェニック マウス皮質ニューロンに蛍光蛋白質を表現するのでは、棘の大部分は週のイメージングの期間を通して存在ですが、棘の割合が日常的に見え隠れし、つつ、過渡にされます。ごく一部が表示され、シナプス形成を安定化し、この割合は、感覚的経験の変化によって影響を受けることができます。このシナプスの形成は、優先的な軸索のブートン区画で既に存在に連絡糸状仮足のような脊椎の初期世代を介して行われます。これらの特殊なコンパートメントのシナプスの伝達には神経回路網の機能再編で中心的な役割を再生結果を巻き込みます。
PSD 95 一酸化窒素シグナル伝達を介してシナプス形成と Multiinnervated の脊椎形成を促進します。
シナプス後密度 95 (PSD-95) はシナプス構造と可塑性の重要な調節因子であります。しかし、シナプス形成と組織への貢献は不明であります。複合電子顕微鏡、遺伝的、および薬理学的アプローチを使用して、それを通して PSD 95 シナプス形成を調節する新しいメカニズムを発見します。我々 は、PSD 95 過剰発現はスパイン形態の影響を受けるが、また、最大 7 つのシナプス前端子によって連絡 multiinnervated 棘 （ミス） の形成を推進見つけます。複数の連絡先の形成は、具体的に PSD-95, 一酸化窒素 （NO） 合成酵素 (NOS) との対話の PDZ(2) ドメインの削除によって防がれました。同様に、PSD 95 過剰発現の小さな干渉 RNA を介したダウンレギュレーションを組み合わせてまたは varicosities と multisynapse の形成への分化に軸索 NOS の薬理学的封鎖を防ぐ。逆に、NO ドナーや環状グアノシン一リン酸アナログの海馬スライス治療ミスを誘発しました。NOS 封鎖も海馬文化発展途上、背骨とシナプスの密度が減少。NOS-PSD-95 の相互作用とないシグナル伝達を介してのシナプス後サイト近くの軸索とシナプス形成を促進することが示唆されました。
新生樹状突起スパインの迅速な機能的成熟
シナプス形成と除去と背骨の成長と収縮は、開発中および成体脳における脳の回路を形成する上で重要な役割を果たしており、まだ背骨の形態形成と機能シナプスの形成との間の時間的な関係は不完全に定義されたままになります。我々は、異なる年齢の棘を識別するために、海馬の錐体細胞をイメージした。その後、新生棘とその古い隣人の特性を解析するために2光子グルタミン酸アンケージング、全細胞記録し、Ca（2 +）の画像を使用していました。新しい棘は、同等のボリュームの成熟した棘と区別できなかったグルタミン酸に敏感な電流を表明した。いくつかの棘はごくわずかAMPA受容体を介した応答を示したが、これらの "サイレント"棘の発生は、背骨の年齢と相関しました。対照的に、NMDA受容体媒介性のCa（2 +）の蓄積は、新しい棘で有意に低かった。新しい棘は、電子顕微鏡たシナプスを用いて再建した。我々のデータは、新生棘の伸長と肥大がしっかりとグルタミン酸作動性シナプスの形成と成熟に結合されているモデルをサポートしています。
慢性頭蓋窓でマウスの新皮質の長期的な、高解像度イメージング
経験依存的可塑性の細胞および回路のメカニズムを理解するために、神経細胞とそのシナプスは長期間にわたって無傷の脳で検討する必要があります。二光子励起レーザー走査顕微鏡（2PLSM）は、一緒に蛍光タンパク質の発現と、in vivoで神経構造の高分解能イメージングを可能にします。このプロトコルでは、長期的イメージングのためのマウス大脳皮質に光アクセスを取得するために、慢性頭蓋ウィンドウについて説明します。小さな骨弁は永久に広い視野（約0.8〜12ミリメートル（2））との明確なイメージングウィンドウを提供する、歯科用アクリルのある場所に密封されたカバーガラスに置き換えられます。手術は約1時間以内に完了することができます。準備は、任意の画像の間隔で数ヶ月の期間にわたってイメージングすることができます。画像ウィンドウのサイズが大きい標識細胞の低密度で、マウスの小さな神経構造の継続的な構造的な可塑性のイメージングを容易にします。全体の樹状突起と個々のニューロンの軸索の東屋は、再構築することができます。
GFP 標識細胞の in Vivo と光と電子顕微鏡分析のためのスライス標本を以前イメージを準備するためのプロトコル。
緑色蛍光タンパク質 (GFP) の in vivo イメージング-そのまま脳のラベル付きニューロンが使用されているますます神経可塑性を勉強します。しかし、観察された変化変更として解釈する神経細胞の接続でシナプスについての情報が必要です。我々 ここで軸索と樹状突起以前ライブ マウスまたは 2 光子レーザー顕微鏡を用いたスライス標本をイメージした GFP 標識神経細胞の光と電子顕微鏡を用いたを分析することができることにまた示す両方周辺の区画のそれらと同様、イメージされたニューロンのシナプスの形態学的復元可能します。我々 は、固定、スライスおよび免疫標識関心のニューロンをローカライズする方法については、2 日間にわたってイメージ化された組織ですについて説明します。エポキシ樹脂に埋め込まれた後は、全体のニューロン光顕微鏡を用いて詳細な形態素解析用 3 次元 (3 D)、描画できます。特定の樹状突起と軸索できますがさらに直列薄い切片、電子顕微鏡 （EM） と入力し、シリアルの画像を分析した微細構造イメージングします。
ほぼ等方性シリアル電子顕微鏡画像におけるシナプス連絡先の自動検出とセグメンテーション
我々は、走査型電子顕微鏡、集束イオンビーム（FIB / SEM）で撮影した成体哺乳類の大脳皮質のシリアル電子顕微鏡画像の興奮性、シナプスを、推定される非対称の完全自動検出とセグメンテーションのためのプロトコルを説明します。手順は、対話型機械学習に基づいており、唯一の訓練のためのいくつかのラベルの付いたシナプスを必要とします。統計的学習は、各ボクセルの3D地区の幾何学的特徴で実行され、完全にデータの高Z-解像度を悪用することができます。 1948年の409画像×3独立した専門家による手動の注釈付きの1342ピクセルで111シナプスの定量的な検証データセットにアルゴリズムの誤り率は、専門家（0.89の精度で0.92リコール）に匹敵することが判明した。当社のソフトウェアは、訓練データと3次元の結果を可視化し、校正する可能性をラベリングするための便利なインターフェイスを提供しています。ソースコード、テストデータセットと地上の真理アノテーションは、Webサイトhttp://www.ilastik.org/synapse-detection上で自由にご利用いただけます。
GABA シグナル シナプス除去と軸索剪定皮質抑制性介在ニューロンの開発を促進します。
証拠を蓄積 GABA 抑制性のシナプス伝達を超えて機能し、抑制性のシナプス脊椎動物の脳の開発を制御するが、基になる細胞メカニズムはよく理解されていないことを示します。我々 ライブ イメージング皮質 gaba 作動性神経軸索の間に日の時間スケール分から単一細胞遺伝子操作マウス大脳皮質の抑制性シナプス形成の明確な手順におけるその役割を調べるための GABA 放出のと組み合わせています。私たち以前は、介在、発展途上の GABA 合成遺伝子ノックダウンによる GABA シグナル抑制性シナプスと軸索の成熟を促進する示されています。ここで我々 バスケット介在ニューロンで GABA 放出の完全封鎖、逆の効果を明らかに通常のシナプス構造と軸索・ ブートン密度のセル自律の増加の結果が見つかりました。これらの結果は GABA はあたりの se シナプス形成の必要はありませんが、また小説ファセット gaba シナプスの除去と軸索剪定を調節するを発見だけでなくを示しています。ライブ イメージングでは、一時的なボタンの数が多い発展途上の gaba 作動性軸索を形成がサブセットのみが安定したことを明らかにしました。リリース封鎖は大幅に増加したブートン安定性とフィロポディア密度につながった、軸索分岐拡張子を増加し、支店撤回減少しました。GABA シナプスの開発機能の主要なコンポーネント伝送を介した撤廃 nascent 連絡先のサブセットであることが示唆されました。したがって、GABA はリズミカル特定 nascent 連絡先他 nascent シナプスの成熟を促進しながら除去によって抑制性シナプス形成を調節する可能性があります。
Supervoxel に基づくセグメンテーション Em 画像スタック学んだ形状特徴とミトコンドリアの。
ミトコンドリアが神経機能で重要な役割を果たすことがますます明らかになってきた。最近の研究はミトコンドリア形態細胞生理学とシナプス機能に重要なことを示すし、ミトコンドリアの欠陥や神経変性疾患の間のリンクが強く疑われます。電子顕微鏡検査 (EM)、すべての 3 つの方向で非常に高い解像度より密接にこれらの問題に見て重要なツールの 1 つですが、それを生成するデータの膨大な量自動解析が必要なこと。自然の 2 D 画像上で動作するように設計の芸術コンピューター ビジョン アルゴリズムは EM データいくつかの理由のために適用するとパフォーマンスが低下する傾向にあります。最初に、典型的な EM ボリュームの薄いサイズ最も近代的なセグメンテーション スキーム難治性レンダリングします。さらに、ほとんどのアプローチは簡単にノイズとテクスチャ データに内在戸惑うローカル統計のみに頼って、重要な図形の手がかりを無視します。最後に、強い画像勾配が常にオブジェクトの境界に対応していることの従来の仮定は、気が散る膜の散乱によって違反になります。この作業では、これらの問題のアドレス スキームをパーティショニングを自動化されたグラフを提案する.Supervoxels ボクセルの代わりに動作によって計算の複雑さを低減、形状特徴のターゲット オブジェクトの 3次元形状を記述する能力が組み込まれていて、真の境界の特徴的な外観を認識することを学ぶ。我々 の実験に我々 のアプローチ セグメント ミトコンドリア パフォーマンス レベルに近いことは人間 annotator ですることができますし、最新の 3次元セグメンテーション手法よりも優れているを示しています。
