Estructura Tridimensional Del VIH-1 Partículas Similares Al Virus Por Electron Cryotomography

Journal of Molecular Biology. Feb, 2005  |  Pubmed ID: 15670606

Aunque las estructuras de casi todas las proteínas del VIH-1 se conocen en detalle atómico de cristalografía de rayos X y espectroscopía de RMN, quedan muchas preguntas acerca de cómo las proteínas individuales están dispuestas en la madurez de partícula vírica infecciosa. Aquí, nos informe de las estructuras tridimensionales de las distintas VIH-1 partículas similares a virus (VLP) que se obtuvo por cryotomography de electrones. Estas reconstrucciones reveló que mientras que las estructuras y las posiciones de los núcleos cónicos dentro de cada VLP fueron únicas, exhibieron varias características sorprendentemente consistentes, incluyendo las similitudes en el tamaño y la forma del extremo ancho de la cápside (la "base"), el posicionamiento de uniforme las regiones de base y otras de la cápsida 11Nm lejos de la capa de envoltura / MA, un ángulo de cono que típicamente varía de 24 grados a 18 grados alrededor del eje longitudinal del cono, y una densidad interna (presumiblemente parte del complejo CN / ARN ) ahuecado dentro de la base. Cápsides múltiples y anidadas se observaron. Estos resultados apoyan el modelo de cono fullereno de la cápside viral, indican que la maduración viral implica una libre re-organización de la cápside en lugar de una condensación continua, implica que ensamblaje de la cápsida es a la vez la concentración impulsada y una plantilla basada, sugieren que las interacciones específicas existir entre la cápside y el adyacente sobre / MA y las capas de Carolina del Norte / ARN, y demostrar que una forma particular, la cápside se ve favorecida con fuerza en vivo.

Peach: Un Simple Basado En Perl Sistema De Computación Distribuida Y Su Aplicación a Cryo-EM De Procesamiento De Datos

Structure (London, England : 1993). Apr, 2005  |  Pubmed ID: 15837189

Un simple sistema de procesamiento distribuido llamado "melocotón" fue desarrollado para satisfacer las crecientes demandas de cómputo de la biología estructural moderna (y otros) los laboratorios, sin costos adicionales por el uso de los recursos de hardware existentes de manera más eficiente. Un servidor central distribuye trabajos a ralentí estaciones de trabajo de tal manera que cada equipo se utiliza al máximo, pero sin perturbar intermitentes usuarios interactivos. En comparación con otros sistemas distribuidos, Peach es simple, fácil de instalar, fácil de administrar, fácil de usar, escalable y robusta. Si bien se ha diseñado para poner en cola y distribuir un gran número de pequeñas tareas a los equipos participantes, también se puede utilizar para enviar trabajos individuales automáticamente a la computadora más rápida actualmente disponibles y / o estudio de la actividad de los ordenadores un laboratorio entero. Las pruebas de robustez y la escalabilidad son reportados, así como tres aplicaciones específicas criomicroscopía de electrones, donde Peach habilitados los proyectos que de otro modo no habría sido posible sin un clúster costoso, dedicado.

Un "flip-flop" Rotación De Fase De Rutina De Doble Eje Cryotomography Electrónica

Journal of Structural Biology. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 16129619

Electron cryotomography se puede utilizar para resolver las estructuras tridimensionales de macromoléculas individuales grandes, asambleas, y las células intactas, incluso las pequeñas y medianas (aproximadamente 4.8 nm), la resolución en un estado casi nativo, pero son las restricciones en el rango de puntos de vista de acceso una limitación importante. Aquí nos informe sobre el diseño, caracterización, y la demostración de un nuevo "flip-flop" etapa de rotación que permite la recogida fácil y rutinario de dos ortogonales inclinación serie de cryosamples. Tomogramas simple y doble eje de una variedad de muestras se comparan para ilustrar cualitativamente la mejora producida por la inclusión de la segunda serie de inclinación. Exactas expresiones cuantitativas se derivan para el volumen de los restantes "pirámide perdida" en el espacio recíproco. Cuando ortogonal de inclinación de la serie se graba en + / -65 grados en cada dirección, ya que esto permite cryostage nuevos, sólo el 11% del espacio recíproco se queda sin medirse. Las tomografías sugieren que la mejora podría realizarse, sin embargo, a través de un mejor software para alinear y fusionar de doble eje de inclinación de la serie de cryosamples.

Electron Cryotomography De La Piruvato E. Coli Y 2-oxoglutarato Deshidrogenasa Complejos

Structure (London, England : 1993). Dec, 2005  |  Pubmed ID: 16338405

La piruvato deshidrogenasa de E. coli y el 2-oxoglutarato dos estrechamente relacionados, grandes complejos que ejemplifican un creciente número de "máquinas" multiproteicos cuyos dominios se han estudiado ampliamente y modelado en detalle atómico, pero cuyas estructuras cuaternaria ha quedado claro por falta de una tecnología de imagen eficaz. Aquí, el electrón cryotomography se utilizó para demostrar que las subunidades E1 y E3 de estos complejos son flexiblemente atados aproximadamente 11 nm de distancia desde el núcleo E2. Este resultado demuestra claramente que cryotomography de electrones puede revelar las posiciones relativas de las características tan pequeñas como 80 kDa en los complejos individuales, elucidar la estructura cuaternaria y la flexibilidad conformacional.

Magnetosomas Son Invaginaciones De La Membrana Celular Organizado Por La Proteína Actina MamK-como

Science (New York, N.Y.). Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16373532

Magnetosomas son orgánulos membranosos bacterianas que comparten muchas características de los orgánulos eucariotas. Usando cryotomography de electrones, se encontró que magnetosomas son invaginaciones de la membrana celular, flanqueada por una red de filamentos citoesqueleto. Los filamentos que parecía estar compuesta de MamK, un homólogo de la actina bacteriana-como la proteína MreB, que forman filamentos in vivo. En una supresión cepa mamK, el citoesqueleto magnetosoma asociada fue magnetosomas ausentes y el individuo ya no se organizan en cadenas. Así, parece que los procariotas pueden utilizar filamentos citoesqueleto para posicionar orgánulos dentro de la célula.

Una Comparación De Nitrógeno Líquido Y Helio Líquido Como Criogénicos Para Electron Cryotomography

Journal of Structural Biology. Mar, 2006  |  Pubmed ID: 16427786

La limitación principal en la resolución criomicroscopía electrónica de congelados-hidratados muestras biológicas es el daño por radiación. Desde hace tiempo se esperaba que el enfriamiento que estas muestras sólo unos pocos grados Kelvin con el helio líquido se desaceleraría este daño y permitir que estadísticamente mejor definidas las imágenes que desea grabar. Un nuevo "G2 Polara" microscopio de FEI Company se utilizó para la imagen varias muestras biológicas enfriados por cualquiera de nitrógeno líquido o helio líquido a aproximadamente 82 o aproximadamente 12 K, respectivamente, y los resultados se compararon con interés particular en las dosis (10-200 e-/A2) y resoluciones (3-8 nm) típicos de cryotomography de electrones. Serie de tres dosis simple reveló una pérdida gradual de la diferencia de aproximadamente 12K a través de los diez primeros de varios e-/A2, tras lo cual aparecieron pequeñas burbujas. Reconstrucciones sola partícula de cada imagen en una serie de dosis no mostró diferencia en la preservación de resolución media (3-5 nm) detalle estructural en las dos temperaturas. Reconstrucciones tomográficas producidos con dosis totales de entre 10 y 350 e-/A2 mostraron mejores resultados en aproximadamente 82 K que aproximadamente el 12 K para todas las dosis probadas. Por lo tanto decepcionante, enfriar con helio líquido es en realidad una desventaja para cryotomography.

Observaciones Sobre El Comportamiento Del Hielo Vítreo En Aproximadamente 82 Y Aproximadamente 12 K

Journal of Structural Biology. Mar, 2006  |  Pubmed ID: 16434212

En un intento de determinar qué enfriar con helio líquido realmente resultó desventajoso en nuestros experimentos cryotomography de electrones, más pruebas se realizaron para explorar las diferencias en hielo vítreo a aproximadamente 82 y aproximadamente 12 patrones de difracción de electrones K. mostró claramente que el hielo vítreo de interés en criomicroscopía biológica de electrones (es decir, caída de congelado, soluciones tampón de proteínas) en efecto, caer en una fase de mayor densidad cuando se irradia con tan sólo 3.2 e-/A2 aproximadamente a 12 K. La fase de alta densidad de forma espontánea se expandió a un estado se asemeja a la fase inicial, de baja densidad en un período de horas a aproximadamente 82 K. Los movimientos de fiduciales de oro y los cambios en las longitudes de túneles perforados a través del hielo confirmó estos cambios de fase, y también reveló cambios brutos en la concavidad de la capa de hielo que abarca agujeros circulares en el soporte de carbono. Breve tiempo de reutilización de los ciclos de calentamiento de aproximadamente 12 a aproximadamente 82 K y la espalda, como se requiere por la etapa de cryorotation flip-flop, no indujo un cambio de fase global, pero no permitir que ciertas cepas de la zona para relajarse. Varias observaciones inclusión de los tipos de colapso del túnel y la producción de huellas de haz sugerido que la fase de alta densidad fluye más fácilmente en respuesta a la irradiación. Finalmente, los patrones de burbujeo eran diferentes en las dos temperaturas. Se concluye que el colapso de hielo vítreo a aproximadamente 12 K alrededor de macromoléculas es demasiado rápida para explicar solo por la pérdida de contraste problemático visto, que en su lugar debe ser debido a efectos secundarios tales como cambios en la movilidad de los fragmentos radiolíticos y agua.

Rígidos, Concretos, Y Discreta De Oro Nanopartículas / Anticuerpos Conjugados

Journal of the American Chemical Society. Mar, 2006  |  Pubmed ID: 16492049

Un método general de etiquetado rígida, específica de las proteínas con grupos de oro se ha ideado. El método se basa en la conjugación de un racimo de oro glutatión monocapa-protegida (MPC) con un fragmento de anticuerpo de cadena única Fv (scFv), mutado para presentar un residuo de cisteína expuestos. Formación eficiente de un enlace de oro-tiolato entre el MPC y scFv depende de la activación de la agrupación de oro por oxidación química. Una vez formado, el conjugado MPC-scFv se trata con un agente reductor para saciar reactividad racimo. El procedimiento se ha realizado con un MPC con un promedio de Au (71) del núcleo y un scFv dirigidos contra una proteína tetramérica, la gripe neuraminidasa. Un complejo del conjugado MPC-scFv con la neuraminidasa se aisló, y la presencia de cuatro grupos de oro fue verificada por microscopía criomicroscopía electrónica.

Estructura Tridimensional De Mycoplasma Pneumoniae Orgánulos De Apego Y De Un Modelo Para Su Papel En La Motilidad Del Vuelo a Vela

Molecular Microbiology. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16573687

Aunque la mayoría de bacterias móviles se propulsan con flagelos, otros mecanismos se han descrito incluyendo retracción de la superficie de conexión pili, la secreción de polisacáridos, o el movimiento de los motores a lo largo de pistas de proteínas de superficie. Estos han sido denominadas colectivamente como formas de motilidad 'delta'. A pesar de ser al mismo tiempo uno de los más pequeños y más simple de todas las células conocidas, Mycoplasma pneumoniae construye una extensión de células sorprendentemente grande y compleja que se conoce como el orgánulo de conexión que permite que se deslice. Aquí, las imágenes tridimensionales de los orgánulos archivo adjunto se produjeron con una claridad sin precedentes y la autenticidad con el estado de la técnica cryotomography de electrones. El orgánulo adjunto se ve que contienen una multisubunit, articulado, motor dinámico mucho más grande que un cuerpo flagelar basal y comparable en complejidad. Un nuevo modelo para su función en la que se propone gusano-como los cambios conformacionales de su electrón-denso núcleo se apalancan contra un ancla frente al citoplasma y se transmite a la superficie a través de proteínas de adhesión de capas.

En La Estructura in Situ De La Completa Treponema Primitia Flagelar Motor

Nature. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16885937

El motor flagelar bacteriano es un asombroso nanomáquina: construido a partir de aproximadamente 25 proteínas diferentes, que utiliza un gradiente electroquímico de iones para conducir la rotación a velocidades de hasta 300 Hz (ref. 1, 2). El motor flagelar consta de un fijo, la membrana embebido, el par generadora de estator y un típicamente bidireccional, el rotor gira que cambia de dirección en respuesta a señales quimiotácticas. Mayoría de los análisis estructurales hasta ahora se han dirigido al rotor purificada, y por lo tanto, se sabe poco sobre el estator y sus interacciones. Aquí se muestra, utilizando cryotomography electrones de las células enteras, el de la estructura in situ de que el motor flagelar completo de la espiroqueta Treponema primitia a una resolución de 7 nm. Veinte partículas individuales de motor fueron extraídos de cómputo de las reconstrucciones, alineados y promediados. El conjunto de estator, reveló por primera vez, poseía 16-simetría y se conecta directamente al rotor, el anillo C y una nueva P-estructura tipo anillo. El tamaño inusualmente grande del motor sugerido mecanismos para aumentar el par y los modelos soportados en donde se producen las interacciones críticas sobre el anillo C, donde nuestros datos sugieren que los dominios carboxi-terminales y medios de Flig se encuentran.

Varios Haces De Filamentos Grandes Observadas En Caulobacter Crescentus Por Electron Cryotomography

Molecular Microbiology. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16987173

Si bien la ausencia de cualquier citoesqueleto se reconoció una vez como una característica distintiva de los procariotas, ahora está claro que un número de diferentes proteínas bacterianas hacer filamentos forman in vivo. A pesar de las funciones esenciales que estas proteínas desempeñan en la forma de la célula, la segregación del genoma y la división celular, los mecanismos moleculares que han permanecido en la oscuridad, en parte, por falta de resolución de la microscopía de electrones-imágenes en las que estos filamentos pueden ser vistos actuando dentro de su contexto celular. Aquí, el electrón cryotomography se utilizó para la imagen de la ampliamente estudiado modelo procariota Caulobacter crescentus en una intacta, casi nativo del estado, produciendo reconstrucciones tridimensionales de estas células con una claridad sin precedentes y la fidelidad. Hemos observado muchos casos de haces de filamentos grandes en varios lugares de la celda y en diferentes etapas del ciclo celular. Los paquetes parece que se dividen en cuatro clases principales basadas en la forma y ubicación, se hace referencia aquí como "curvatura interna", "citoplasmáticos", "polar" y "anillo como-'. En un intento de identificar al menos algunos de los filamentos, que fotografiada células donde filamentos crescentin y MreB no estarían presentes. La curvatura interior y paquetes de citoplasma persistió, que junto con sus patrones de localización, sugieren que se componen de, que aún sin identificar las proteínas del citoesqueleto. Así filamentos bacterianos se encuentran con frecuencia como paquetes, y la variedad y la abundancia es mayor que antes se sospechaba.

Cryotomography Electrónica Preparación De La Muestra Uso De La Vitrobot

Nature Protocols. 2006  |  Pubmed ID: 17406539

Electron cryotomography es la técnica más alta resolución estructural actualmente disponibles que se pueden aplicar a objetos únicos, tales como flexibles grandes complejos de proteínas, virus irregulares, orgánulos y células pequeñas. Las muestras se conservan en un casi nativo, "congelado-hidratado" estado por vitrificación. El espesor del hielo vítreo debe ser optimizado para cada muestra, y fiduciales de oro se añaden típicamente para facilitar la alineación de la imagen. A continuación, describimos con detalle nuestros protocolos para la preparación de la muestra de electrones cryotomography incluyendo (i) la introducción de los marcadores de referencia en la muestra y (ii) la vitrificación de la muestra. Debido a que utilizan casi exclusivamente un sistema automatizado, con control climático caída de la congelación de dispositivo (el Vitrobot FEI) para vitrificar las muestras, se discute su operación y los parámetros en detalle. Una sesión en la que ocho redes están preparadas toma 1.5-2 h.

La Estructura De Deformación Aislados Synechococcus WH8102 Carboxysomes Según Lo Revelado Por Electron Cryotomography

Journal of Molecular Biology. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17669419

Carboxysomes son orgánulos como cuerpos poliédricos que se encuentran en las bacterias quimioautotróficas cianobacterias y muchos que se piensan para facilitar la fijación de carbono. Carboxysomes están delimitadas por una carcasa exterior proteínico y lleno de ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (Rubisco), la primera enzima en el CO (2) vía la fijación, pero exactamente cómo mejorar la fijación de carbono no está claro. Aquí mostramos la estructura tridimensional de carboxysomes purificada a partir de la cepa de Synechococcus WH8102 las especies según lo revelado por cryotomography de electrones. Hemos encontrado que mientras que los tamaños de carboxysomes individuales en este organismo varió de 114 nm a 137 nm, sorprendentemente, todos eran aproximadamente icosaédrica. Había en promedio alrededor de 250 RuBisCOs por carboxysome, organizados en tres o cuatro capas concéntricas. Algunos modelos de la función carboxysome dependerá de contactos específicos entre RuBisCOs individuales y la camisa, pero no hay pruebas de tales contactos se encontró: no hay patrones sistemáticos de conexión de densidades o posiciones Rubisco contra la red presunta hexagonal de la cáscara puede discernirse, y mostró las simulaciones que las fuerzas de embalaje Sólo podría ser responsable de la organización en capas de RuBisCOs.

Ultraestructura En 3-D De O. Tauri: Cryotomography De Electrones De Una Célula Eucariota Todo

PloS One. 2007  |  Pubmed ID: 17710148

La característica distintiva de las células eucariotas es la segregación de las principales funciones biológicas en discretas, unidas a la membrana orgánulos. La creación de modelos precisos de su complejidad ultraestructural ha sido difícil en parte debido a la limitada resolución de la microscopía de luz y la naturaleza de artefactos propensos de la microscopía electrónica convencional. Aquí se exploró el potencial de la tecnología emergente cryotomography de electrones para producir imágenes tridimensionales de una célula eucariótica entero en un estado casi nativo. Ostreococcus tauri fue elegida como la muestra porque, como picoplancton unicelulares con una sola copia de cada orgánulo, es el más pequeño eucariota conocido y por lo tanto, era probable que el rendimiento de las imágenes de mayor resolución. Las células enteras fueron estudiados en las distintas etapas del ciclo celular, produciendo reconstrucciones 3-D de los cloroplastos completos, retículos mitocondrias, retículo, los órganos de Golgi, peroxisomas, microtúbulos, y la posible distribución de ribosomas in-situ. Sorprendentemente, el núcleo fue visto abrir mucho antes de la mitosis, los microtúbulos, y mientras que uno (o dos en algunas células predivisional) fue siempre presente, no huso mitótico se observó alguna vez, lo que provocó la especulación de que un microtúbulo sola podría ser suficiente para separar los cromosomas múltiples.

La Estructura De Filamentos De FtsZ En Vivo Sugiere Un Papel De Generación De Fuerza En La División Celular

The EMBO Journal. Nov, 2007  |  Pubmed ID: 17948052

En procariotas, FtsZ (el filamentosa sensible a la temperatura proteína Z) es un GTPasa casi omnipresente que se localiza en un anillo en el borde delantero de la constricción de las membranas plasmáticas durante la división celular. Aquí nos informe de electrones reconstrucciones cryotomographic de dividir las células Caulobacter crescentus donde cada arco como filamentos se resolvieron justo debajo de la membrana interna en los sitios de la constricción. La posición de los filamentos, la orientación, el tiempo de aparición, y la resistencia a todo A22 sugirió que eran FtsZ. Los cambios previsibles en el número, duración y distribución de los filamentos en las células, donde los niveles de expresión y la estabilidad de FtsZ se han alterado el apoyo a esa conclusión. En contraste con el espesor, anillo cerrado-como la estructura sugerida por microscopía de fluorescencia, luz en todo el proceso de constricción del anillo Z fue visto aquí a consistir en sólo unos pocos cortos (aproximadamente 100 nm) filamentos espaciados de forma errática cerca del sitio de división. Densidades adicionales que conectan filamentos de la pared celular, ocasionales segmentos rectos, y torceduras bruscas también fueron vistos. Una está iterativo pellizco 'modelo se propone en la que se FtsZ genera la fuerza que constriñe la membrana en un ciclo de GTP-impulsada por hidrólisis de la polimerización, la unión de la membrana, el cambio conformacional, despolimerización, y el intercambio de nucleótidos.

Electron Cryotomography

BioTechniques. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 18019332

Electron cryotomography es una técnica emergente que permite las estructuras de objetos únicos biológicos, tales como macromoléculas individuales, virus y células enteras, incluso pequeñas para ser reconstruidas en sus casi nativos estados en tres dimensiones (3-D) a un aproximado de 5 nm de resolución . La instrumentación necesaria, la preparación de muestras y las limitaciones, la recopilación de datos, los resultados típicos, y las perspectivas futuras se resumen brevemente.

Cryotomography Electrónica De Inmaduros Viriones De VIH-1 Revela La Estructura De La AC Y Depósitos SP1 Gag

The EMBO Journal. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17396149

Los principales elementos estructurales de los retrovirus están contenidos en una única poliproteína Gag, que en el tipo de virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) comprende la EM, CA, el espaciador de péptido 1 (SP1), Carolina del Norte, SP2 y polipéptidos p6. En el inmaduro virión de VIH-1, los dominios de la mordaza están dispuestas radialmente con el dominio N-terminal de MA en la membrana y C-terminal de NC-SP2-P6 región más cercana al centro. Aquí, se presenta las estructuras tridimensionales de individuales inmaduras de VIH-1 viriones, como se obtienen por cryotomography de electrones. Las capas concéntricas de la poliproteína Gag son claramente visibles, y las proyecciones radiales de las capas de la mordaza revelan diferentes parches de orden hexagonal, dentro de la CA y las cáscaras de SP1. Promediando bien ordenadas celdas unitarias conduce a un modelo en el que cada hexámero CA está estabilizada por un paquete de seis hélices SP1. Este modelo sugiere por qué el espaciador SP1 es esencial para el ensamblaje de la celosía Gag y cómo la escisión entre el SP1 y CA actúa como un interruptor de maduración estructural controlar.

¿Cómo Electron Cryotomography Está Abriendo Una Nueva Ventana Hacia Ultraestructura Procariótica

Current Opinion in Structural Biology. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17398087

Electron cryotomography es una tecnología emergente que permite a las muestras delgadas, incluidas las pequeñas células intactas procariotas, que se toman imágenes en tres dimensiones en un casi nativo 'congelado-hidratado "estado a una resolución suficiente para reconocer complejos macromoleculares de gran tamaño en el lugar. Después de años de desarrollo visionario de la tecnología por parte de algunos pioneros clave, varios laboratorios están utilizando la técnica de producir resultados biológicos de gran importancia en el campo de la ultraestructura de procariotas. Descubrimientos recientes han incluido la generalidad y sorprendente complejidad del citoesqueleto, la conectividad de los compartimentos de membrana clave, la ubicación y la arquitectura de las máquinas macromoleculares de gran tamaño como los motores de ribosoma y flagelar, y la estructura de algunos apéndices externos extraordinarios. A través de un mayor desarrollo de tecnología, la identificación de los sistemas modelo más reveladores y el esfuerzo sostenido, cryotomography electrón está lista para ayudar a resolver muchas cuestiones de importancia fundamental sobre la ultraestructura procariotas.

Ultraestructuras Novela De Treponema Primitia Y Sus Implicaciones Para La Motilidad

Molecular Microbiology. Mar, 2008  |  Pubmed ID: 18248579

Los miembros de las espiroquetas filo de bacterias generalmente son células helicoidales propulsados ​​por flagelos periplásmico. La espiroqueta Treponema primitia es interesante debido a su papel de mutualista en el intestino de termitas, donde se cree que coopere con los protozoos que romper la celulosa y producir H (2) como un subproducto. Aquí mostramos la ultraestructura de T. primitia obtenida por cryotomography electrónica de enteros, congelados-hidratados células. Varias estructuras externas no reconocidos anteriormente fueron revelados, incluyendo como plato objetos de decoración de la membrana externa, salas de proteínas en forma de gancho sinuosos a lo largo del exterior y manojos de fibrillas que se extienden desde las puntas de las células. En el interior del periplasma, cono estructuras similares se encontraron en cada polo. En lugar de la capa de peptidoglicano único típico de otras bacterias Gram-negativas, dos capas distintas periplásmicas se observaron. Estas capas forman un espacio central abierto que contenía dos flagelos situados adyacentes entre sí. En algunas áreas, la membrana interna formada invaginaciones aplanados que sobresalían en el citoplasma. De alta velocidad las imágenes de luz microscópico de las células T. natación primitia mostraron que los cuerpos celulares se mantuvo rígido y se trasladó en una espiral en lugar de movimiento plano. En conjunto, estos resultados apoyan el modelo de "cilindro rodante" para T. movilidad primitia que postula la rotación del cilindro protoplásmico dentro de la funda exterior.

Cryo-EM Estructura De Vps4p Dodecameric Y Su Complejo Con Vta1p 02:01

Journal of Molecular Biology. Mar, 2008  |  Pubmed ID: 18280501

El tipo I AAA (ATPasa asociada con una variedad de actividades celulares) ATPasa Vps4 y su cofactor Vta1p/LIP5 función en los eventos de remodelación de membrana que acompañan a la citocinesis, la biogénesis multivesiculares cuerpo, y el retrovirus en ciernes, aparentemente por la conducción desmontaje y reciclado de la membrana ESCRT asociado (complejo endosomal clasificación requerida para el transporte)-III complejos. A continuación, presentamos las reconstrucciones de electrones criomicroscopía de dodecameric complejos de levadura Vps4p con y sin la interacción de los microtúbulos y el transporte (MIT), N-terminal de dominios y Vta1p co-factores. Los dominios de la ATPasa de la forma Vps4p una estructura similar a una taza compuesto de anillos apilados hexaméricas. Los dos anillos de adoptar conformaciones dramáticamente diferentes, con la "parte superior" anillo formando un conjunto abierto que define los lados del recipiente y el anillo inferior formando un conjunto cerrado que forma el fondo del recipiente. Los dominios N-terminales del MIT del anillo superior en localizar el eje de simetría por encima de la cavidad de la taza, y la unión de seis monómeros Vta1p prolongados provoca densidad adicional a aparecer tanto por encima como por debajo del recipiente. Las estructuras sugieren modelos en los que Vps4p MIT y dominios Vta1p realizan ESCRT-III sustratos por encima del recipiente y ayudar a transferir ellos en el recipiente que se bombea a través del centro del conjunto dodecameric.

Hacia Un Mejor Entendimiento De Biomecánica De Células Bacterianas

Annual Review of Biochemistry. 2008  |  Pubmed ID: 18355161

Después de décadas de investigación en genética y la bioquímica, el metabolismo básico de las bacterias es algo muy asumido. Además de metabolismo básico, sin embargo, las células bacterianas también llevan a cabo una serie de tareas mecánicas, tales como el mantenimiento de una forma característica, se desplazan dentro de su medio ambiente, la segregación de su genoma, y ​​se dividan. Los principales avances en tecnologías de imagen como la microscopía de luz de fluorescencia (FLM) y un electrón cryotomography (TEC) ha proporcionado una nueva visión de las ultraestructuras bacterianas que realizar estas tareas. Ahora está claro, por ejemplo, que las bacterias están muy bien organizados, poseen citoesqueletos, genomas especialmente dispuestos, compartimientos internos y cuidadosamente colocados máquinas macromoleculares. Estas estructuras y sus funciones se revisan en forma de un informe de avance hacia una comprensión completa biomecánico de una célula bacteriana generalizada. El objetivo de la eventual integración de los datos genéticos, bioquímicos, imágenes y biofísica en la espacialmente explícitos, los modelos de predicción mecánica de células enteras se pone de relieve.

Ubicación Y Arquitectura De La Matriz Caulobacter Crescentus Quimioreceptor

Molecular Microbiology. Jul, 2008  |  Pubmed ID: 18363791

Un nuevo método para registrar tanto las de fluorescencia y crio-EM imágenes de pequeñas células bacterianas se ha desarrollado y utilizado para identificar las matrices quimiorreceptoras en cryotomograms de células intactas Caulobacter crescentus. Nos muestran que en células de tipo salvaje se conservan en un estado casi nativo, los quimiorreceptores se hexagonal lleno de un espaciado reticular de 12 nm, a sólo unas pocas decenas de nanómetros de distancia del motor flagelar que ellos controlan. Las matrices se encuentran siempre en el lado convexo de la célula, lo que demuestra que las células Caulobacter mantener dorsal / ventral así como anterior / posterior asimetría. La colocación de la estructura cristalina conocida de un trímero de dímeros de receptores en cada vértice de la retícula representa bien para la densidad y está de acuerdo con otras limitaciones. Basado en este modelo para la disposición de los receptores, hay entre uno y dos mil receptores por matriz.

Reducción De La Dosis De Radiación Y De Mejora De Imagen En Imagen Biológica a Través De Tomografía Por Igual-pendiente

Journal of Structural Biology. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 18771735

La tomografía de electrones es actualmente la modalidad de mayor resolución de imagen disponible para estudiar las estructuras 3D de macromoléculas asambleas pleomórficas, virus, orgánulos y las células. Por desgracia, la resolución se limita actualmente a 3-5 nm por varios factores, incluyendo la tolerancia de dosis de muestras biológicas y la inaccesibilidad de ciertos ángulos de inclinación. Aquí mostramos la primera demostración experimental de la tomografía por igual-pendiente (EST) para aliviar estos problemas. Como una prueba de principio, se aplicó a la reconstrucción de EST congelados hidratados moléculas hemocianina de lapa ojo de la cerradura de una inclinación de la serie tomada con incrementos de pendiente constante. En comparación con la ponderación de retroproyección (WBP), la técnica de reconstrucción algebraica (ART) y la técnica de simultánea de reconstrucción algebraica (SART), reconstrucciones EST exhibieron un mayor contraste, menos ruido periférico, más fácilmente detectables límites molecular y la reducción de faltantes efectos de cuña. Más importante aún, las reconstrucciones EST incluyendo sólo dos tercios de las imágenes originales parecían tener la misma resolución que las reconstrucciones WBP completos, lo que sugiere que o bien EST puede reducir la dosis necesaria para llegar a una resolución dada o permitir una mayor resolución para ser alcanzados con una dosis determinada. EST se aplicó también a la reconstrucción de una célula bacteriana congelados-hidratados de una inclinación de la serie se toma con constantes incrementos angulares. Los resultados confirmaron los mismos beneficios cuando la norma se inclina se utilizan.

Un Cryogen Mejora De La Congelación Profunda De Agua

Microscopy and Microanalysis : the Official Journal of Microscopy Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18793481

El uso de una mezcla de alcano que permanece en estado líquido a 77 K para congelar muestras tiene ventajas sobre el uso de un alcano puro que es sólido a 77 K. Se encontró que una mezcla de metano y etano no dio una tasa de enfriamiento adecuado para producir hielo vítreo, pero una mezcla de propano y etano hizo resultado en hielo vítreo. Además, la última mezcla producía menos daño a los especímenes montados en una muy delgada, frágil sustrato de carbono perforado.

Una Proteína De La Asociación De Auto-crítica Para Cromosoma Adjunto De La División, Y La Organización Polar En Caulobacter

Cell. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18805089

Polarización de la célula es una parte integral de muchos procesos bacterianos no relacionados. ¿Cómo la polarización celular intrínseca se consigue es poco conocida. En este caso, aportar pruebas de que Caulobacter crescentus utiliza un poste de multimérica-organización de los factores (Popz) que sirve como un centro para alcanzar simultáneamente varias funciones de polarización. Durante la segregación cromosómica, polar Popz captura la parB * Ori compleja y, con ello cromosomas hermanos anclas en polos opuestos. Este paso es esencial para la estabilización de los gradientes bipolares de un inhibidor de la división celular y la creación de la división cerca de midcell. Popz también afecta a la morfogénesis del tallo polar y media la localización polar de la morfogénesis y el ciclo celular y las proteínas de señalización CckA DivJ. Acumulación de Polar Popz, que es esencial para su actividad polarizante, se puede lograr de manera independiente de la división y no parece estar dictada por la curvatura del poste. En su lugar, la evidencia sugiere que la localización de Popz depende en gran medida libres de multimerización Popz cromosoma regiones, de acuerdo con un mecanismo de auto-organización.

FcRn Mediada Por Anticuerpos De Transporte Través De Las Células Epiteliales Reveladas Por Tomografía Electrónica

Nature. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18818657

El receptor Fc neonatal (FcRn) transporta la IgG materna a través de barreras epiteliales, lo que proporciona al feto o al recién nacido con la inmunidad humoral antes de que su sistema inmunológico es completamente funcional. En ratas recién nacidas, FcRn transfiere IgG de la leche a la sangre por apical a basolateral transcitosis través de las células epiteliales intestinales. La diferencia de pH entre los apicales (pH 6,0-6,5) y basolateral (pH 7,4) lados de las células epiteliales intestinales facilita el transporte eficiente unidireccional de IgG, porque FcRn une IgG a pH 6.0-6.5, pero no a pH 7 o más. Como la leche pasa a través del intestino neonatal, la IgG materna se elimina por FcRn-que expresan las células en el intestino delgado proximal (duodeno y yeyuno); proteínas restantes son absorbidos y degradados por FcRn células negativas en el intestino delgado distal (íleon). Aquí se utiliza la tomografía de electrones para hacer transcitosis yeyunal visible directamente en el espacio y el tiempo, el desarrollo de un nuevo etiquetado y métodos de detección de mapa individual Nanogold marcado con Fc dentro de vesículas de transporte y al mismo tiempo para caracterizar estas vesículas por inmunomarcaje. La combinación de la tomografía de electrones con una etiqueta que no cause endocítica nos permitió identificar de manera concluyente el receptor unido-ligandos, resolver la interconexión de las vesículas, determinar si una vesícula fue asociada a los microtúbulos, y precisa remontar FcRn mediada por el transporte de IgG. Nuestros resultados presentan un cuadro complejo en el que se mueve a través de redes Fc de vesículas tubulares entrelazados e irregular, sólo algunas de las cuales son asociadas con microtúbulos, ya que migra a la superficie basolateral. Las nuevas características de transcitosis se ha dilucidado, incluyendo transporte que afecte a las vesículas multivesiculares internas del cuerpo o los túbulos y exocitosis a través de depresiones revestidas de clatrina. Marcadores para el reciclaje temprano, tarde y cada uno de los endosomas vesículas marcadas en las clases morfológicas diferentes y superpuestas, revelando la complejidad espacial en el endo-lisosomal trata de personas.

Organización Molecular De Las Bacterias Gram-negativas Peptidoglicano

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 19033194

El componente de la tensión de sustentación de la pared celular bacteriana - un multi-gigadalton bolsa molécula similar a la llamada sáculo - se sintetiza a partir peptidoglicano. Considerando que la composición química y la estructura 3-dimensional de la subunidad de peptidoglicano (en al menos una conformación) son conocidos, la arquitectura del sáculo montado no lo es. Un valor de cuatro décadas de experimentos de microscopía de electrones y bioquímicos han dado lugar a dos de las principales modelos 3-D peptidoglicano: "Laminado" y "andamio", en el que las hebras de glicano son paralelas y perpendiculares a la superficie celular, respectivamente. Aquí se resuelve la arquitectura básica de purificado, congelados-hidratados sacculi cryotomography a través de electrones. En el sáculo Gram-negativa, una sola capa de glicanos son paralelas a la superficie celular, aproximadamente perpendicular al eje longitudinal de la celda, que rodea la célula en un desorganizado aro-como la moda.

Biología Celular. Filamentos De La Proteína Sorprendidos En El Acto

Science (New York, N.Y.). Jan, 2009  |  Pubmed ID: 19164739

Cryo-tomografía Electrónica De La Adhesión Mediada Por El Homophilic L1 Molécula De Adhesión Celular Neural

Structure (London, England : 1993). Mar, 2009  |  Pubmed ID: 19278660

La adhesión celular neuronal L1 molécula participa en las interacciones homophilic importantes para guía de axones y el desarrollo neuronal. Los detalles estructurales de adhesión homophilic mediadas por L1 y otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas que contengan una disposición herradura N-terminal de cuatro dominios similares a inmunoglobulinas son desconocidos. Aquí hemos utilizado la crio-tomografía electrónica para estudiar los liposomas para que las formas intactas o truncada de la L1 ectodominio estaban unidas. Reconstrucciones tomográficas reveló una interfaz de adhesión con un patrón regular y repetitivo consistente con las interacciones entre pares de herraduras aportadas por proteínas L1 de liposomas vecinos. Las características del patrón cambió cuando los carbohidratos unidos a N fueron alteradas mediante la eliminación de los ácidos siálicos o la conversión de complejo a altas glicanos manosa o oligomannose, lo que sugiere un papel regulador de carbohidratos en L1-adhesión mediada homophilic. Utilizando los resultados de las tomografías y las estructuras cristalinas de moléculas relacionadas con el L1-, se presenta un modelo estructural para la adhesión mediada por L1 homophilic que depende de la proteína-proteína, proteínas, carbohidratos, y las interacciones de hidratos de carbono en hidratos de carbono.

Totalmente Automatizado, Secuencial Inclinación De La Serie Con La Adquisición Leginon

Journal of Structural Biology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19361558

Tomografía electrónica se ha convertido en una herramienta única y poderosa para la investigación de las estructuras de las células individuales, los virus y macromoléculas. La recogida de datos es, sin embargo, consume tiempo y requiere instrumentos costosos. Para optimizar la productividad, hemos incorporado uno de los programas de adquisición existentes de la serie de inclinación, UCSF Tomo, en la bien desarrollada la microscopía electrónica automática Leginon paquete de recopilación de datos para habilitar completamente automática y secuencial de inclinación de la serie de adquisición. Aquí se describe cómo UCSF Tomo se integró en Leginon, lo que los usuarios tienen que hacer para establecer una sesión de recogida de datos, el desarrollo del procedimiento de recogida automática, la cantidad de datos archivados sobre el proceso se puede acceder y utilizar, y cómo el software ha sido probado.

Electron Cryotomography: Una Nueva Vista En Ultraestructura Microbiana

Current Opinion in Microbiology. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19427259

Electron cryotomography (TEC) es una tecnología emergente que permite que las muestras delgadas, como las pequeñas células bacterianas a ser filmadas en 3D en un estado casi natural de la resolución "molecular" (aproximadamente 4 nm). Como tal, la TEC se empieza a dar la tan esperada información sobre las posiciones y las estructuras de filamentos del citoesqueleto, elementos de la pared celular, la motilidad máquinas, matrices quimiorreceptoras, compartimientos internos y ultraestructuras otros. Aquí se explica brevemente la TEC, revise sus recientes contribuciones a la microbiología, y concluir con un debate sobre las perspectivas de futuro.

Nanogold Como Un Marcador Específico De Electrones Cryotomography

Microscopy and Microanalysis : the Official Journal of Microscopy Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19460172

Mientras cryotomography electrones (TEC) ofrece "molecular" de resolución de imágenes en tres dimensiones de las muestras biológicas únicas y hacinamiento de la muestra, y / o limitaciones de resolución puede hacer que sea difícil identificar los componentes específicos macromoleculares. Aquí se utilizó un grupo 1,4 nm Nanogold específicamente unido al fragmento Fc de la IgG para controlar su interacción con el receptor Fc neonatal (FcRn), un receptor unido a membrana que transporta la IgG a través de las células en ácidos vesículas intracelulares. TEC se utilizó para los complejos de imagen formada por Nanogold marcado con Fc unidos a FcRn unido a la superficie exterior de los liposomas sintéticos. En las resultantes reconstrucciones tridimensionales, 1.4 nm partículas Nanogold fueron distribuidos principalmente a lo largo de las interfaces donde 2:1 FcRn-Fc complejos bicapas lipídicas puente adyacentes. Estos resultados demuestran que el 1,4 nm grupo Nanogold es visible en tomogramas de muestras típicamente gruesas (aproximadamente 250 nm) grabadas con desenfoca apropiado para grandes macromoléculas y por lo tanto es un marcador eficaz.

Arquitectura Universal De Matrices Quimiorreceptoras Bacterianas

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19805102

Quimiorreceptores son componentes clave del sistema de señales de alto rendimiento de transducción que controla la quimiotaxis bacteriana. Quimiorreceptores se localiza típicamente en un grupo en el polo celular, donde las interacciones entre los receptores de la agrupación se cree que contribuyen a la alta sensibilidad, amplio rango dinámico, y la adaptación precisa del sistema de señalización. Anteriores estudios estructurales y genómica han producido modelos en conflicto, sin embargo, para la disposición de los quimiorreceptores de los racimos. Uso de células enteras de electrones de la crio-tomografía, aquí nos muestran que los quimiorreceptores de diferentes clases y en muchas especies diferentes que representan a varios filos de bacterias más importantes están todos dispuestos en una altamente conservada, de 12 nm de forma hexagonal en consonancia con la propuesta de "trímero de dímeros de" organización . Las diferentes longitudes observadas de los receptores confirman los modelos actuales para la metilación, grupo flexible, de señalización, y el enlazador sub-dominios en vivo. Nuestros resultados sugieren que el mecanismo básico y la función de agrupación receptor es universal entre especies bacterianas y se conservan por lo tanto durante la evolución.

Organización, Estructura Y Montaje De Alfa-carboxysomes Determinado Por Cryotomography De Electrones De Las Células Intactas

Journal of Molecular Biology. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19925807

Carboxysomes son cuerpos de inclusión poliédricos que juegan un papel clave en el metabolismo autotrófico en muchas bacterias. Usando cryotomography electrones, hemos examinado carboxysomes en sus estados nativos dentro de las células intactas de tres bacterias quimiolitoautotróficas. Hemos encontrado que carboxysomes generalmente se agrupan en grupos distintos dentro del citoplasma, a menudo en la vecindad inmediata de los gránulos de polifosfato, y una red regular de la densidad con frecuencia se conecta a gránulos carboxysomes cercanas. Pequeños cuerpos granulares se observaron también dentro de carboxysomes. Estas observaciones sugieren una relación funcional entre carboxysomes y gránulos de polifosfato. Carboxysomes exhiben mayor tamaño, forma, y ​​la variabilidad de la composición en las células que en preparaciones purificadas. Por último, se observó carboxysomes en distintas fases de montaje, así como las estructuras filamentosas que se atribuyen a la proteína de cubierta mal instalado. Sorprendentemente, no más de un carboxysome parcial se observó nunca por célula. Basándose en estas observaciones, se propone un modelo para el montaje carboxysome en el que la cáscara y el interior de la RuBisCO (ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa) Forma red al mismo tiempo, probablemente guiado por interacciones específicas entre las proteínas de concha y RuBisCOs.

Bactofilins, Una Clase Ubicua De Las Proteínas Del Citoesqueleto Mediación Localización Polar De Una Sintasa De La Pared Celular En Caulobacter Crescentus

The EMBO Journal. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19959992

El citoesqueleto tiene una función clave en la organización temporal y espacial de las dos células procariotas y eucariotas. Aquí, se presenta la identificación de una nueva clase de polímeros que forman las proteínas, denominadas bactofilins, que están ampliamente conservados entre bacterias. En Caulobacter crescentus, dos paralogues bactofilin cooperan para formar una estructura laminar que recubre la membrana citoplasmática en la proximidad del poste de células tallo. Estos conjuntos de mediar en la localización polar de una sintasa peptidoglicano implicados en la morfogénesis del tallo, complementando así la función del citoesqueleto de actina similar y la maquinaria de división celular en la regulación de la biogénesis de la pared celular. En otras bacterias, bactofilins puede establecer varilla en forma de filamentos o asociarse con el aparato de la división celular, lo que indica una considerable flexibilidad estructural y funcional. Bactofilins polimerizar espontáneamente en ausencia de cofactores adicionales in vitro, formando estable de cinta o de varilla como haces de filamentos. Nuestros resultados sugieren que estas estructuras han evolucionado como una alternativa a los filamentos intermedios, sirviendo como versátiles andamios moleculares en una variedad de vías celulares.

Las Mutaciones En La Ruta De Biosíntesis De Lipopolisacárido Interferir Con La Curvatura De La Célula Crescentin Mediada En Caulobacter Crescentus

Journal of Bacteriology. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20435724

Morfogénesis celular bacteriana requiere la coordinación entre varios sistemas celulares, incluyendo el citoesqueleto bacteriano y la pared celular. En el vibrioid bacteria Caulobacter crescentus, el de filamentos intermedios-como la proteína crescentin forma una envoltura celular asociada a la estructura del citoesqueleto, que controla el crecimiento de la pared celular para generar la curvatura de la célula. Se realizó un análisis genético para encontrar otros componentes celulares importantes para la curvatura de la célula. Aquí mostramos que la supresión de un gen (wbqL) que participan en el lipopolisacárido (LPS) suprime la ruta de biosíntesis de la curvatura de la célula. La pérdida de función WbqL conduce a la acumulación de una aberrantes polisacáridos O-especies y para la liberación de la capa de S en el medio de cultivo. Experimentos epistasis y microscopía muestran que la producción ni capa S ni O-polisacárido se requiere para la morfología de las células curvada per se, sino que la producción de la alteración de O-polisacárido especies suprime curvatura celular por aparentemente interfiere con la capacidad de la estructura crescentin asociar con el envoltura celular. Nuestros datos sugieren que las perturbaciones en una vía celular que en sí es totalmente prescindible para la curvatura de la célula puede causar un trastorno de la morfogénesis de células, destacando la delicada armonía entre los sistemas celulares no relacionados. Usando el mutante wbqL, también muestran que el conjunto normal y propiedades de crecimiento de la estructura crescentin son independientes de su asociación con la envoltura celular. Sin embargo, esta asociación envoltura es importante para facilitar la interrupción local de la estructura estable crescentin en el sitio de división durante la citocinesis.

DIPM, Un Nuevo Factor Necesario Para El Peptidoglicano Remodelación Durante La División Celular En La Caulobacter Crescentus

Molecular Microbiology. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20497502

En las bacterias, citocinesis es dependiente de las enzimas líticas que faciliten la remodelación de la pared celular durante la constricción. En este trabajo, se identifican una proteína hasta ahora no caracterizada periplásmico, DIPM, lo que se requiere para la división celular y la polaridad en Caulobacter crescentus. DIPM se compone de cuatro peptidoglicano vinculantes (LysM) dominios y un C-terminal-como lysostaphin (LytM) de dominio peptidasa. Se une a sacculi mureína aislado in vitro, y ha sido contratado para el sitio de la constricción través de la interacción con la proteína de la célula FtsN división. Análisis mutacional mostró que los dominios LysM son necesarias y suficientes para la localización de DIPM, mientras que su dominio peptidasa es esencial para la función. De acuerdo con un papel en la hidrólisis de la pared celular, DIPM se encontró a interactuar con la mureína purificada sacculi in vitro e inducir la lisis celular a la sobreproducción. Su inactivación causa defectos graves en invaginación membrana externa, resultando en un retraso significativo entre compartimentación citoplásmica y separación final de las células hijas. En general, estos resultados indican que DIPM es un componente periplásmico de la divisome C. crescentus que facilita la remodelación de la capa de peptidoglicano y, por tanto, la constricción coordinada de la envoltura celular durante el proceso de división.

Electron Cryotomography

Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20516135

Electron cryotomography (TEC) es una tecnología emergente que permite que las muestras delgadas como complejos macromoleculares y pequeñas células bacterianas para obtener imágenes en 3-D en un estado casi nativo "molecular" (aproximadamente 4 nm) de resolución. Como tal, la TEC se empieza a dar la tan esperada información sobre las posiciones y las estructuras del citoesqueleto fi lamentos, elementos de la pared celular, la motilidad máquinas, matrices quimiorreceptoras, compartimientos internos y ultraestructuras otros. Este artículo describe la técnica y un resumen de sus contribuciones a la biología de la célula bacteriana. Para comparables revisiones recientes, véase (Subramaniam 2005; Jensen y Briegel 2007, Murphy y Jensen 2007; Li y Jensen 2009). Para una revisión sobre la historia, los detalles técnicos, y una aplicación más amplia de la tomografía de electrones en general, véase, por ejemplo (Subramaniam y Milne 2004; Lucic et al 2005;. Leis et al 2008;. Midgley y Dunin Borkowski-2009).

La Enzima Metabólica CTP Sintasa Forma Filamentos Del Citoesqueleto

Nature Cell Biology. Aug, 2010  |  Pubmed ID: 20639870

Formación de filamentos, las proteínas del citoesqueleto son esenciales para la estructura y organización de todas las células. Homólogos bacterianos de las principales familias del citoesqueleto eucariotas han sido descubiertos, pero los estudios sugieren que aún más quedan aún por identificar. Se demuestra que la enzima metabólica CTP sintasa (CTP) de forma filamentos en Caulobacter crescentus. CTPS es bifuncional, como los filamentos que forma regular la curvatura de las células de C. crescentus independientemente de su función catalítica. El papel morfogénica de CTPS requiere su interacción funcional con el filamento intermedio, crescentin (CRES). Interesantemente, la Escherichia coli CTPS homólogo también forma filamentos tanto in vivo como in vitro, lo que sugiere que la polimerización CTPS puede ser ampliamente conservado. CTPS E. coli puede reemplazar las funciones enzimáticas y morfogénica de C. CTPS crescentus, lo que indica que por esta bacteria se ha adaptado una conservadas a formar los filamentos de proteína para un papel secundario. Estos resultados implican CTPS como un nuevo miembro bifuncional del citoesqueleto bacteriano y sugieren que la localización y la polimerización puede ser importantes propiedades de las enzimas metabólicas.

Bacteriana TEM: Contribuciones Clave a Partir De Cryo-microscopio

Methods in Cell Biology. 2010  |  Pubmed ID: 20869517

Algunas bacterias son algunos de los organismos modelo más importantes para la biología y la medicina. Aquí hacemos una revisión de microscopios electrónicos se han utilizado para las células bacterianas de imagen, que resume los detalles técnicos de los distintos métodos, las ventajas y desventajas de cada uno, y las ideas principales biológicos que se han obtenido. Tres estructuras de ejemplo concreto, "mesosomas", "filamentos del citoesqueleto," y "nucleoide", se utilizan para ilustrar cómo los avances metodológicos han dado forma a nuestra comprensión de la ultraestructura bacteriana. Los métodos que implican la deshidratación y las manchas de metal son ampliamente practicado y han puesto de manifiesto muchas características ultraestructurales, pero pueden generar artefactos engañosos y no han logrado preservar las estructuras importantes, como el citoesqueleto bacteriano. La invención de la crio-microscopía electrónica, que permite a las células bacterianas a ser fotografiado en un congelado hidratado, un estado casi nativo sin necesidad de la deshidratación y las manchas, ya ha dado lugar a nuevas e importantes ideas. Los esfuerzos para identificar y localizar las estructuras de proteínas específicas en la crio-ME imágenes se resumen.

Cryo-EM, Parte A: Recogida De Muestras Preparación Y Datos. Prefacio

Methods in Enzymology. 2010  |  Pubmed ID: 20887849

Sumérgete Congelación De Electrones Criomicroscopía

Methods in Enzymology. 2010  |  Pubmed ID: 20887853

Acuosas muestras biológicas debe ser "conservado" (estabilizado) antes de que puedan ser colocados en el alto vacío de un microscopio electrónico. Entre los diversos enfoques que se han desarrollado, la congelación mantiene caída de la muestra en el estado más natural y por lo tanto el método de elección siempre que sea posible. Hunda congelación para aplicaciones estándar de electrones criomicroscopía procede por la difusión de la muestra en una película delgada a través de una rejilla EM y luego rápidamente se sumerge en un criógeno (generalmente etano líquido), pero el éxito depende críticamente de las propiedades de la rejilla y la muestra, la producción de una película delgada uniforme, la temperatura y la naturaleza del criógeno, y las condiciones se sumergen. En este capítulo se revisa la congelación de inmersión principios, técnicas, instrumentos, problemas comunes y consideraciones de seguridad.

Luz De Electrones Correlacionados Y Cryo-microscopio

Methods in Enzymology. 2010  |  Pubmed ID: 20887863

Óptica y electrónica de crio-microscopía de que cada uno ha demostrado ser herramientas poderosas para el estudio de las estructuras biológicas en un estado casi nativo. La microscopía óptica proporciona información de localización importante, mientras que la microscopía electrónica proporciona la resolución necesaria para resolver los finos detalles estructurales. Imagen de la misma muestra por la luz y de electrones crio-microscopía es un poderoso nuevo enfoque que combina las fortalezas de ambas técnicas para proporcionar nuevos conocimientos sobre la ultraestructura celular. En este capítulo, los métodos y la instrumentación que actualmente se utilizan para correlacionar la luz y de electrones crio-microscopía se describen en detalle.

Una Descripción De Los Instrumentos, Muestras, Protocolos, Y Análisis Que Pertenecen Al Campo Cada Vez Mayor De Cryo-EM

Methods in Enzymology. 2010  |  Pubmed ID: 20888466

Cryo-EM, Parte B: Reconstrucción En 3-D. Prefacio

Methods in Enzymology. 2010  |  Pubmed ID: 20888955

La Corrección De La Esfera De Ewald En Alta Resolución De Una Sola Partícula Reconstrucciones

Methods in Enzymology. 2010  |  Pubmed ID: 20888969

Para evitar los problemas de cristalización y las limitaciones de tamaño de la RMN, ha sido durante mucho tiempo la esperanza de que una sola partícula de crio-microscopía electrónica (crio-ME) con el tiempo daría reconstrucciones atómicamente interpretables. Para la clase más favorable de las muestras (grandes virus icosaédricos), uno de los principales obstáculos es la curvatura de la esfera de Ewald, que lleva a una ruptura del teorema de proyección utilizado por convencionales en tres dimensiones los programas de reconstrucción (3D). En este artículo examinamos el problema de fondo y nuestra implementación del método "paraboloide" la reconstrucción, lo que supera la limitación al promediar la información de las imágenes grabadas desde diferentes puntos de vista.

En Vivo De La Asamblea De Un Virus Arqueales Estudió Con Cryotomography Electron Plenario De Células

Structure (London, England : 1993). Dec, 2010  |  Pubmed ID: 21134637

Se aplicaron células enteras cryotomography de electrones para la arquea Sulfolobus infectado por el virus de Sulfolobus turreted icosaédrica (STIV), que pertenece al linaje PRD1-adeno virus de dsDNA. STIV infección inducida por la formación de la pirámide-protuberancias con facetas muy definidas en la superficie celular. Tenían una sección transversal más gruesa que la membrana citoplásmica y no contienen una capa de superficie exterior de proteínas (capa S). Órganos Intrapyramidal menudo ocupado el volumen de las pirámides. Viriones maduros, procapsids sin núcleos del genoma, y ​​las partículas parcialmente ensamblados se identificaron, lo que sugiere que la membrana cápsida interna y coassemble en el citoplasma para formar una procapsid. Una reconstrucción de dos clases, utilizando un algoritmo de máxima verosimilitud de manifiesto que ninguna transformación de la cápside dramático ocurrió en el empaquetamiento del ADN. Los viriones tienden a formar grupos apretados o matrices, mientras que cuasicristalinos procapsids su mayoría dispersos al aire libre o en los bordes de los clusters. El estudio reveló imágenes vívidas de STIV conjunto, la maduración y distribución de partículas en la celda.

Largos Filamentos Helicoidales No Se Ven Las Células En El Cerco Cryotomograms Electrónicas De Bacterias De Forma Bacilar

Biochemical and Biophysical Research Communications. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21419100

¿Cómo en forma de bastoncillos formar y mantener su forma es una cuestión importante en la biología de la célula bacteriana. Los resultados de la microscopía de luz fluorescente han llevado a muchos a creer que el MreB homólogo de actina y un número de otras proteínas forman largos filamentos helicoidales a lo largo de la membrana interna de la célula. Aquí nos muestran utilizando cryotomography electrones de seis diferentes en forma de varilla especies bacterianas, en la resolución macromolecular, que no largas (> 80 nm) existen alrededor de filamentos helicoidales o bien a lo largo de la superficie de la membrana interna. También utilizamos la correlación de crio-microscopía de luz fluorescente (crio-FLM) y la tomografía crio-electrónica (ECT) para identificar los haces citoplasmáticos de MreB, mostrando que los filamentos de MreB son detectables por la TEC. A la luz de estos resultados, la estructura y función de MreB debe ser examinada de nuevo: en lugar de actuar como un gran andamio rígido que se localiza en la pared celular de la maquinaria sintética, pasando complejos MreB puede aplicar tensión a las crecientes cadenas de peptidoglicano para garantizar su inserción ordenada, lineal .

Mecanismo Alternativo Para La Adsorción Del Bacteriófago a La Bacteria Caulobacter Crescentus Mótiles

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21613567

2D y 3D crio-microscopía electrónica, junto con los ensayos de adsorción cinética de CB13 y CBK fagos infectados crescentus Caulobacter, da una idea de los mecanismos de infección. CB13 y CBK interactuar activamente con el flagelo y, posteriormente, se unen a receptores en el polo de la célula. Se presentan evidencia de que la primera interacción del fago con el flagelo bacteriano se lleva a cabo a través de un filamento en la cabeza del fago. Este contacto con el flagelo facilita la concentración de partículas de fago alrededor del receptor (es decir, los portales pilus) en la superficie celular bacteriana, aumentando así la probabilidad de infección. Filamentos de fagos de cabeza no han sido bien caracterizadas y su función se describe aquí. Filamentos de Fago en la cabeza de manera sistemática puede ser la base de las interacciones iniciales de fagos con sus anfitriones en otros sistemas y, posiblemente, representan un mecanismo generalizado de la propagación del fago eficiente.

La Diversidad Estructural De Las Bacterias Motors Flagelar

The EMBO Journal. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21673657

El flagelo bacteriano es una de las nanomáquinas más sorprendente y bien estudiado de la naturaleza. Su pared celular anclado el motor utiliza la energía química para hacer girar un filamento de micras de largo y propulsar a la bacteria a los alimentos y lejos de las toxinas. Aunque se sabe mucho sobre los motores flagelares de ciertos organismos modelo, su diversidad en todo el reino bacteriano es muy bien caracterizada, que permite la tergiversación ocasional del motor como una máquina de todos los idiomas, ideal. A continuación, presentamos una encuesta electrónica cryotomographical de las arquitecturas de motor flagelar a través de las bacterias. Mientras que un núcleo estructural conservada se observó en todas las 11 bacterias con imagen, las estructuras sorprendentemente nuevos y divergentes, así como diferentes simetrías se observó que rodea al núcleo. Correlacionar las estructuras de motor con la presencia y ausencia de genes de motor particulares de cada organismo sugirió la ubicación de cinco proteínas implicadas en el aparato de exportación incluyendo flii, cuya posición por debajo del anillo C fue confirmada por imágenes una supresión cepa. La combinación de estructuras conservadas y adaptados especialmente ven en la foto arroja luz sobre cómo este complejo de proteínas nanomáquina ha evolucionado para satisfacer las necesidades de las diferentes especies.

Nanopods Una Nueva Estructura Bacteriana Y El Mecanismo Para La Implementación De Las Vesículas De Membrana Externa

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21687732

Bacterianas vesículas de membrana externa (OMV) son paquetes de material periplásmico que, a través de las proteínas y otras moléculas que contienen, la función metabólica proyecto en el medio ambiente. Aunque la producción de OMV se ha generalizado en proteobacterias, que han sido ampliamente estudiados sólo en los agentes patógenos, que habitan en ambientes completamente hidratado. Sin embargo, muchos (probablemente la mayoría) de los hábitats de bacterias, tales como el suelo, son sólo parcialmente hidratado. En esta última, el agua se distribuye característicamente como películas sobre las partículas del suelo que son, en diluyente promedio, que son típicos de OMV (ca. 10 ≤ película de agua nm frente a 20 a> 200 nm ;) OMV.

Remodelación De Peptidoglicano Y La Reconversión De Una Membrana Interna En Una Membrana Externa Durante La Esporulación

Cell. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21884938

Dos rasgos distintivos del phylum Firmicute, que incluye las clases de bacilos y clostridios, son su capacidad para formar endosporas y su "gram-positivo" de una sola membrana, gruesa pared celular de estructura envolvente. Longum Acetonema es parte de una familia menos conocida (el Veillonellaceae) de clostridios que endosporas forma sino que son sorprendentemente "gram negativo", que posee tanto una membrana interna y externa y una pared celular delgada. Aquí, presentamos resolución macromolecular, 3D electrones imágenes cryotomographic de vegetativas, esporulantes, y germinar células A. longum que muestran que durante el proceso de esporulación, la membrana interna de la célula madre se invierte y se transformó para convertirse en la membrana externa de la célula germinar. Peptidoglicano persiste a lo largo, dando lugar a una versión revisada del "continuo" modelo de su papel en el proceso. Junto con los análisis genómicos, estos resultados apuntan a la esporulación como un mecanismo por el cual la membrana externa bacteriana puede haber surgido y longum A. como un posible "eslabón perdido" entre las bacterias de una y dos con membrana.

Organización De La Más Pequeña Del Eje Eucariotas

Current Biology : CB. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21906950

En los metazoos, plantas y hongos, el puesto de control del husillo retrasos hasta la mitosis cada cromosoma se une a uno o más de sus propios kinetochore microtúbulos (kmts). Algunos eucariotas unicelulares, sin embargo, se ha informado que tienen menos kmts de cromosomas [1-5]. Si este es el caso, no está claro cómo el puesto de control del husillo puede ser satisfecha. En la gran mayoría de los estudios anteriores, las células mitóticas se fija químicamente a temperatura ambiente, pero esto no siempre preservar las estructuras dinámicas y / o pequeños, como eje de MTs y cinetocoros [6]. De hecho, después de más alta resolución estudios han revertido algunas afirmaciones anteriores [7-11]. Aquí nos muestran que en el Ostreococcus Tauri (el más pequeño eucariota se conoce), la mitosis involucra un menor número de microtúbulos del huso que los cromosomas. O. culturas Tauri fueron enriquecidos por las células mitóticas y de alta presión de congelados, y luego fotografiada en 3D tanto en plástico y en una casi nativo ("congelado-hidratado") Estado a través de la tomografía de electrones. Las células mitóticas tienen un distintivo intranuclear heterocromatina libre de "túnel del eje", con aproximadamente cuatro cortos y uno largo en ocasiones, incompletos (sin cerrar) los microtúbulos en cada extremo del túnel del eje. Debido a que otros aspectos de punto de control del eje O. tauri parecen típica, estos datos sugieren que O. 20 Tauri los cromosomas están unidos físicamente y separados como un solo o un pequeño número de grupos.

Las Matrices Quimiorreceptoras Activados Permanecen Intactas Y Bolsas Hexagonal

Molecular Microbiology. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 21992450

Quimiorreceptores bacterianas se agrupan en exquisitively sensibles, ajustables y muy ordenadas, las matrices polares. Mientras que estas matrices sirven como paradigmas de la señalización celular en general, no está claro qué cambios conformacionales transducción de señales desde las puntas periplasmic, donde se unen atrayentes y repelentes, a los dominios de señalización citoplasmáticas. Informes de apoyo en conflicto y el concurso de la hipótesis de que la activación provoca grandes cambios en el empaquetamiento de las matrices, hasta e incluyendo su desmontaje completo. Usando cryotomography electrón, aquí se muestra que en Caulobacter crescentus, las matrices quimiorreceptoras en las células cultivadas en diferentes medios e inmediatamente después de la exposición a la galactosa atrayente toda exposición a los mismos 12 nm hexagonal de empaquetamiento, tamaño de la matriz y otros parámetros estructurales. Mutantes ΔcheB y ΔcheR que imitan los estados-atrayentes o repelentes determinado con anterioridad a la adaptación también muestran la estructura de la red misma. Llegamos a la conclusión de que la señal de transducción y amplificación debe llevarse a cabo sólo a través de pequeños cambios conformacionales a nanoescala.

Tomografía De Electrones De Las Células

Quarterly Reviews of Biophysics. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 22082691

El microscopio electrónico ha contribuido una visión profunda de la estructura biológica desde su invención hace casi 80 años. Los avances en la instrumentación y metodología en las últimas décadas han permitido a la tomografía de electrones para convertirse en la más alta resolución en tres dimensiones (3D) técnica de imagen disponible para los objetos únicos, como las células. Las células se pueden obtener imágenes ya sea de plástico incrustado o congelados hidratado. Entonces la serie de imágenes de proyección están alineados y la espalda-proyectado para generar una reconstrucción 3D o 'tomografía'. En este artículo examinamos cómo tomografía electrónica ha comenzado a revelar la organización molecular de las células y cómo las tecnologías existentes y futuras prometen perspectivas aún mayores en la biología celular estructural.

Los Microtúbulos En Bacterias: Tubulinas Antiguos Construir Un Homólogo De Cinco Protofilamento Del Citoesqueleto Eucariota

PLoS Biology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22162949

Los microtúbulos juegan un papel crucial en la citocinesis, el transporte y la movilidad, y por tanto son objetivos excelentes para medicamentos contra el cáncer. Todas las tubulinas evolucionaron de un ancestro común que compartimos con el pariente lejano de la célula bacteriana proteína FtsZ la división, pero al mismo tiempo tubulinas eucariotas se convirtió en altamente conservados que forman los microtúbulos heterodímeros, presumiblemente bacteriana FtsZ continuó funcionando como un solo protofilamentos homopoliméricas como lo hace hoy. Los microtúbulos no han sido encontrados en las bacterias, y no tenemos idea de su evolución desde el ancestro tubulina / FtsZ. Usando criomicroscopía electrón, aquí se muestra que la tubulina y microtúbulos homólogos BtubA BtubB forma de bacterias y sugieren que estos se conoce como "los microtúbulos bacterianas" (BMT). BMT comparten características importantes con sus homólogos eucariotas, tales como protofilamentos rectos y las interacciones similares protofilamento. BMTs se compone de sólo cinco protofilamentos, sin embargo, en lugar del típico 13 en eucariotas. Estos y otros resultados sugieren que en lugar de ser derivado de tubulina eucariótica moderna, BtubA y BtubB surgió de productos intermedios de tubulina primeros que se formaron pequeños microtúbulos. Como nos muestran que los microtúbulos bacterianas pueden ser producidos en abundancia in vitro sin acompañantes, deben ser herramientas útiles para la investigación tubulina y la detección de drogas.

El Crecimiento Y La Localización De Gránulos Polihidroxibutirato En Ralstonia Eutropha

Journal of Bacteriology. Mar, 2012  |  Pubmed ID: 22178974

La bacteria Ralstonia eutropha forma de gránulos citoplasmáticos polihidroxibutirato que son una fuente de material termoplástico biodegradable. Aunque se sabe mucho sobre la bioquímica de la producción de polihidroxibutirato, la biología celular de la formación de los gránulos y el crecimiento sigue siendo poco clara. Estudios anteriores han sugerido que los gránulos forman ya sea en la membrana interna, en un andamio central, o en el citoplasma. Aquí hemos utilizado cryotomography electrónica para monitorear la génesis y el desarrollo de gránulos en 3 dimensiones (3-D) en un casi nativo, "congelado-hidratado" del Estado en las células intactas Ralstonia eutropha. Ni los gránulos nacientes dentro de la membrana celular ni andamios se observaron. En su lugar, los gránulos de todos los tamaños residió hacia el centro del citoplasma a lo largo de la longitud de la célula y exhibió una capa superficial discontinua más consistente con un revestimiento parcial de proteínas que cualquiera de un lípido mono o bicapa. Supuestamente gránulos de fusión también se observaron, lo que sugiere que los gránulos pequeños se genera continuamente y luego crecen y se fusionan. En conjunto, estas observaciones apoyan un modelo de la que forma la biogénesis gránulos en el citoplasma recubierta no por fosfolípidos, pero por la proteína. Anterior delgada sección de microscopía electrónica (EM), microscopía de fluorescencia y microscopía de fuerza atómica (AFM) de lo contrario los resultados pueden reflejar tanto las diferencias en la condensación nucleoide y la muestra inducidas por la preparación de artefactos.