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Articles by Hal X. Nguyen in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Évaluation quantitative des cellules immunitaires dans le tissu blessés médullaires par cytométrie en flux: une nouvelle utilisation pour un procédé de purification cellulaire
1Institute for Memory Impairments and Neurological Disorders, University of California, 2Physical Medicine & Rehabilitation, University of California, 3Anatomy & Neurobiology, University of California, 4Sue and Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, 5Section of Molecular Biology, University of California, 6Reeve-Irvine Research Center, University of California
Quantification de l'inflammation cellulaire dans le SNC blessé / pathologiques par cytométrie en flux est compliquée par des lipides / myéline des débris qui peuvent avoir la même taille et la granulation des cellules, diminution de la sensibilité / précision. Nous avons avancé une méthode de préparation des cellules pour enlever les débris de myéline et améliorer la détection de cellules par cytométrie en flux dans la moelle épinière lésée.
Other articles by Hal X. Nguyen on PubMed
Interactions Entre Les Neutrophiles Et Les Macrophages Promouvoir Le Meurtre De Macrophage De Cellules De Muscle De Rat in Vitro
Les données actuelles indiquent que les fonctions physiologiques des cellules inflammatoires sont très sensibles à leur microenvironnement, qui est partiellement déterminée par les cellules inflammatoires et leurs cibles potentielles. Dans la présente enquête, les interactions entre les neutrophiles, les macrophages et les cellules musculaires qui peuvent influer sur la mort des cellules musculaires sont examinées. Résultats montrent qu'en l'absence des macrophages, neutrophiles tuent in vitro des cellules musculaires par des mécanismes dépendants du superoxyde, et que les faibles concentrations d'oxyde nitrique (NO) protègent contre killing médiée par les neutrophiles. En l'absence de neutrophiles, macrophages tuent les cellules musculaires par un mécanisme non dépendant, et la présence de cellules de muscle cible provoque un triplement production de NO par les macrophages, sans variation de la concentration de monoxyde d'azote synthase inductible. Des cellules musculaires qui sont cultivées par les neutrophiles et les macrophages dans les proportions observées dans blessé cytotoxicité voir musculaire au moyen d'un mécanisme non dépendant, indépendant de la superoxyde. En outre, la concentration de cellules myéloïdes qui est nécessaire pour le meurtre de muscle est fortement réduite dans les essais qui utilisent des populations de cellules myéloïdes mixtes, plutôt que des populations uniformes des neutrophiles ou des macrophages. Ensemble, ces résultats montrent que l'ampleur et le mécanisme de la cellule musculaire, tuant de cellules myéloïdes sont modifiées par des interactions entre les neutrophiles et les cellules musculaires, entre les macrophages et les cellules musculaires et entre les macrophages et les neutrophiles.
Expression D'un Muscle Spécifique, L'oxyde Nitrique Synthase Transgène Empêche La Blessure De Membrane Musculaire Et Réduit L'inflammation Des Muscles Pendant L'utilisation De Mis à Jour Le Muscle Chez La Souris
L'oxyde nitrique (non) peut fonctionner comme soit une molécule anti-inflammatoire ou pro-inflammatoire, selon sa concentration et le microenvironnement dans lequel elle est produite. Nous avons vérifié si muscle-dérivées non affecte la lyse d'inflammation et de la membrane musculaire qui se produisent dans l'utilisation de mis à jour le muscle. Les souris transgéniques avec surexpression spécifiques du muscle non neuronale synthase (nNOS) ont été générés dans laquelle transgene expression était motivée par le promoteur de l'actine muscle squelettique humain. Les souris transgéniques et même portée non transgénique ont été soumise au membre postérieur muscle déchargement suivie de rechargement, qui provoque la lyse de l'inflammation et de la membrane musculaire. Expression de NOS a diminué chez les souris transgéniques et non transgéniques lors du déchargement du muscle. Inflammation musculaire a été évaluée par immunohistochimie après 24h de muscle rechargement après 10 jours de déchargement. Muscle soléaire de souris non-transgéniques ont montré une augmentation significative de la concentration des neutrophiles (stressa) et les macrophages (11.3-fold) pendant le rechargement, par rapport à des souris qui ont connu le déchargement uniquement. Les muscles de souris transgéniques ont montré moins de 51 % de polynucléaires neutrophiles dans les muscles rechargés à celles des souris non-transgéniques, mais les concentrations de macrophages ne diffèrent pas des souris non-transgéniques. Lésion membrane musculaire a été déterminée en mesurant l'afflux d'un colorant marqueur extracellulaire. Significativement plus membrane dommage s'est produit dans les muscles des souris non-transgéniques vivre rechargement que chez les témoins ambulatoires. Cependant, dommage membranaire dans les muscles reloaded de souris transgéniques ne différait pas que chez les souris ambulatoires. Analyses de cytotoxicité in vitro ont confirmé que les neutrophiles souris lysent des membranes des cellules musculaires et a montré que l'inhibition des amendements dans les muscles et les neutrophiles co-cultures significativement accrue induite par le neutrophile lyse des cellules musculaires. Ensemble, ces résultats montrent que le muscle-dérivées non peut fonctionner comme une molécule anti-inflammatoire en muscle qu'éprouve le chargement et que non peut empêcher des dommages médiée par les neutrophiles des membranes des cellules musculaires in vivo et in vitro.
Mutation Nulle De Gp91phox Réduit La Lyse De Membrane Musculaire Lors D'une Inflammation Musculaire Chez La Souris
L'inflammation musculaire est une caractéristique commune dans une blessure musculaire et la maladie. Récemment, les enquêteurs ont émis l'hypothèse que les cellules inflammatoires peuvent augmenter ou diminuer les lésions musculaires suite à l'utilisation du muscle modifiée, bien qu'il y a peu d'observations expérimentales pour confirmer chaque possibilité. Dans cette étude, une mutation nulle de gp91phox dans les neutrophiles ont empêché la production de superoxyde dans les analyses de cytotoxicité dans lequel le muscle cellules étaient la cible et a empêché la plupart cytolyse médiée par les neutrophiles, des cellules musculaires par rapport à la souche sauvage neutrophiles in vitro. De plus, nous avons testé si déficit dans la production de superoxyde entraîne une diminution des dommages de membrane musculaire in vivo lors de l'utilisation de muscle modifiée. Gp91phox souris mutantes et souris de type sauvage ont été soumis à 10 jours du muscle du membre postérieur déchargement suivie de rechargement par retour à la locomotion normale, ce qui induit des lésions de membranes musculaires et les inflammations musculaires. Lésions de la membrane a été quantifiées en mesurant la présence de colorant marqueur extracellulaire dans les fibres de muscle soléaire reloaded. Il y avait une réduction de 90 % du nombre de fibres montrant les blessures de membrane étendue dans gp91phox souris comparées aux témoins. Mutation de gp91phox n'a pas modifié la concentration de neutrophiles ou des macrophages dans le muscle reloaded. En outre, croissance de fibres musculaires au cours de la période de rechargement n'est pas affectée par la réduction des lésions de la membrane. Ensemble, ces résultats montrent que les neutrophiles peuvent induisent la lyse membrane musculaire par le biais de superoxyde par les événements et indiquent que dommages de membrane induite par le superoxyde in vivo ne sont pas nécessaire pour la croissance cellulaire myéloïde chimiotactisme ou muscle pendant le rechargement du muscle.
Une Mutation Nulle De Myéloperoxydase Chez Les Souris Empêche L'activation Mécanique Des Neutrophile Lyse Des Membranes Des Cellules Musculaires in Vitro Et in Vivo
Lyse de la membrane est un défaut commun et au début de muscles touchés par les lésions aiguës ou une inflammation. Malgré une augmentation mécanique chargement des muscles peut induire la lyse de l'inflammation et de la membrane, si les contraintes mécaniques appliquées au muscle peuvent promouvoir l'activation et la capacité cytolytique des cellules inflammatoires et d'augmenter ainsi la lésion musculaire est inconnue. Nous avons vérifié si des charges mécaniques appliquées aux cellules musculaires de souris in vitro peuvent augmenter la lyse de la membrane et si la lyse des cellules musculaires médiée par les neutrophiles est promu par les contraintes mécaniques appliquées in vitro et in vivo. Charges cycliques appliquées aux cellules musculaires pendant 24 h in vitro produit peu la lyse des cellules musculaires. De même, l'ajout de neutrophiles aux cultures de cellules de muscle en présence de la superoxyde dismutase (SOD) produit peu la lyse des cellules musculaires. Cependant, les charges mécaniques cycliques ont été appliqué à neutrophile-muscle co-cultures en présence de SOD, il y avait un effet synergique sur la lyse des cellules musculaires, suggérant que le chargement mécanique active cytotoxicité neutrophile. Toutefois, application de contraintes mécaniques à co-cultures de cellules musculaires et les neutrophiles qui sont des mutants nuls pour la myéloperoxydase (MPO) a montré aucune activation mécanique de cytotoxicité neutrophile. Ceci indique que chargement favorise la cytotoxicité neutrophile par le MPO. Tests d'activité a confirmé qu'une charge mécanique du neutrophile-muscle co-cultures significativement accrue activité MPO. De plus, nous avons testé si la lyse des membranes musculaires in vivo a été véhiculée par les neutrophiles lorsque le muscle a été soumis à des charges modifiées à l'aide d'un modèle murin de muscle rechargement après une période de déchargement. Nous avons observé que FTU-/-soléaire a montré une réduction significative de 52 % lyse de membrane par rapport aux souris de type sauvage, bien que la mutation n'a pas diminué l'extravasation de cellules inflammatoires. Ensemble, ces résultats in vitro et in vivo montrent que la charge mécanique active neutrophile médiée par lyse des cellules musculaires grâce à une voie de FTU-dépendante.
Leucocytes Polynucléaires Promouvoir La Neurotoxicité Par La Libération Des Métalloprotéases Matricielles, Les Espèces Réactives De L'oxygène, Et Le TNF-alpha
Comme les cellules immunitaires premiers à infiltrer le système nerveux après PNS traumatiques et une blessure au SNC, les neutrophiles (leucocytes polynucléaires, les PMN) peut favoriser des blessures en libérant des facteurs solubles toxiques qui peuvent affecter la survie neuronale. Neurotoxicité directe des métalloprotéases matricielles (MMP), les espèces réactives de l'oxygène (ROS), et des cytokines libérées par les PMN a été étudiée par ganglion de la racine dorsale culture (DRG) avec des cellules PMN-conditionné médias contenant MMP inhibiteur (GM6001), les charognards ROS, ou de nécrose tumorale facteur de alphaR (TNF-alphaR) d'anticorps neutralisants. Bien que les GHM exposés à PMN-conditionné médias avaient moins de 53% des neurones survivants que chez les témoins, la perte de cellules neuronales a été empêché par GM6001 (20 micromol / L), la catalase (1000 U / ml), ou le TNF-alphaR anticorps neutralisants (1,5 microg / ml ), l'élévation de la survie à 77%, 94%, et 95%, respectivement. Conformément à la protection de la GM6001, les milieux conditionnés recueillies auprès de MMP-9 PMN nulles était moins neurotoxique que celle recueillie à partir de type sauvage PMN. En outre, l'inhibition de MMP réduit PMN dérivés ROS; élimination des ROS réduite PMN dérivé activité de MMP-9, et l'inhibition du TNF-alpha réduit à la fois PMN-dérivée de MMP-9 et l'activité ROS dans les cultures PMN. Nos données fournissent la première preuve directe que les PMN axée sur la neurotoxicité est tributaire MMP, ROS, et le TNF-alpha, et que ces facteurs peuvent régulent la libération des PMN de ces facteurs solubles ou d'interagir avec l'autre à la médiation PMN axée sur la neurotoxicité.
Caractérisation Des Protéines Du Complément De Primeur Et De Terminal Associé à Leucocytes Polymorphonucléaires Dans in Vitro Et in Vivo Après Une Blessure Médullaire
Le système du complément a été suggéré d'affecter une blessure ou une maladie du système nerveux central (SNC) en régulant de nombreux événements physiologiques et des sentiers. L'activation du complément suite à une blessure traumatique du SNC peut aussi entraîner la formation et le dépôt de C5b-9 complexe d'attaque membranaire (C5b-9/MAC), provoquant la lyse des cellules ou des effets sur les cellules du SNC sublytic vitaux. Bien que les protéines du complément provenant de sérum / ventilation barrière hémato-encéphalique peuvent contribuer à une blessure ou la maladie, les cellules immunitaires infiltrant peut représenter une importante source locale de complément après une blessure. Comme les cellules immunitaires premiers à infiltrer le système nerveux central dans les heures post-traumatiques, les leucocytes polynucléaires (PN) peuvent avoir une incidence des blessures grâce à des mécanismes associés à médiée par le complément d'événements. Toutefois, l'expression / association de deux protéines du complément début et la borne par PMN n'a pas été entièrement caractérisé in vitro, et n'a pas observé précédemment in vivo après lésion de la moelle épinière traumatique (SCI).
La Carence En Complément C1q Améliore Le Résultat Histologique Et Fonctionnelle Locomotrice Après Une Blessure Médullaire
Bien que des études ont suggéré un rôle pour le système du complément dans la physiopathologie de lésions de la moelle épinière (SCI), que le rôle demeure mal définie. En outre, la contribution relative des voies du complément individuel de la SCI est inconnue. Nos premières études ont révélé que l'activation du complément systémique a été fortement influencée par le patrimoine génétique et le sexe. Ainsi, pour enquêter sur le rôle de la voie classique du complément dans une contusion induite par SCI, de sexe masculin C1q knock-out (KO) et de type sauvage (WT) les souris sur un fond effectif suffisant (BUB) a reçu une légère à modérée T9 lésion par contusion avec l'impacteur horizon infini. BUB C1q souris KO exposées une meilleure récupération locomotrice par rapport aux souris WT Bub (p <0,05). Amélioration de la récupération observée chez les souris KO BUB C1q a également été associée avec un seuil a diminué pour le retrait d'un stimulus doux en utilisant des tests von Frey filament. Étonnamment, la quantification de la microglie ou les macrophages (F4/80) par analyse FACS a montré que les souris KO BUB C1q exposé un pourcentage significativement plus élevé de macrophages dans la moelle épinière par rapport à BUB WT souris 3 d post-traumatique (p <0,05). Cependant, cette réponse des macrophages accrue semble être transitoire que l'évaluation stéréologique de la moelle épinière a obtenu 28 jours après la lésion n'a révélé aucune différence dans les cellules F4/80-positive entre les groupes. L'évaluation stéréologique de la moelle épinière a montré que les souris KO BUB C1q avait réduit le volume de la lésion et une augmentation de la épargnant les tissus par rapport aux souris WT Bub (p <0,05). Ensemble, ces données suggèrent que l'initiation de la voie classique du complément par l'intermédiaire C1q est préjudiciable à la récupération après la SCI.
Changements Des Phénotypes Macrophage Et Concurrence Des Macrophages Pour Le Métabolisme De L'arginine Influent Sur La Gravité De La Pathologie Du Muscle Dans La Dystrophie Musculaire
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie la plus commune, létale, atrophie musculaire chez les enfants. Les études antérieures ont montré que les macrophages musculaires peuvent jouer un rôle important dans la promotion de la pathologie dans le modèle de souris mdx de DMD. Dans la présente étude, nous examinons le mécanisme par lequel macrophages mdx dystrophie de promouvoir et d'évaluer si le phénotype des macrophages change entre le stade de nécrose musculaire de pointe (4 semaines d'âge) et la régénération du muscle (12 semaines). Nous trouvons que les muscles de 4 semaines mdx contiennent une population de pro-inflammatoires, classiquement activés macrophages M1 qui lysent muscle in vitro par des mécanismes médiée par le NO. Ablation génétique du gène chez les souris mdx iNOS réduit aussi considérablement lyse membrane musculaire chez des souris mdx 4 semaines in vivo. Toutefois, 4 semaines mdx muscles contiennent également une population de macrophages de M2a alternativement activés, qui expriment l'arginase. Essais in vitro montrent que les macrophages M2a réduisent la lyse des cellules musculaires par les macrophages par le concours de l'arginase dans les cellules de M2a avec iNOS dans les cellules pour leur substrat commun, enzymatique, M1 M1 arginine. Au cours de la transition entre la pointe aiguë de pathologie mdx, jusqu'à l'étape régénératrice, expression d'IL-4 et IL-10 augmentations, ce qui peut désactiver le phénotype de la M1 et favorisent l'activation d'un CD163 +, M2c phénotype qui peut augmenter la réparation des tissus. Nos résultats montrent que la stimulation d'IL-10 des macrophages active leur capacité à promouvoir la prolifération de cellules satellites. Désactivation du phénotype M1 est également associée à une réduction de l'expression d'iNOS, IL-6, MCP-1 et IP-10. Ainsi, ces résultats montrent que les sous-populations distinctes des macrophages peuvent promouvoir une blessure musculaire ou réparer la dystrophie musculaire, et que les interventions thérapeutiques qui affectent l'équilibre entre les populations de macrophage de M1 et M2 peuvent influer sur le cours de la dystrophie musculaire.
Analyse Quantitative De L'inflammation Cellulaire Après Lésion De La Moelle épinière Traumatique: Preuve Que La Réponse Inflammatoire Dans Le Multiphasique Aiguë Pour L'environnement Chronique
Les lésions traumatiques aux résultats du système nerveux central dans la perturbation de l'hémato-encéphalique / barrière épinière, suivie par l'invasion des cellules et d'autres composants du système immunitaire qui peuvent aggraver les blessures et affecter la réparation et la régénération ultérieure. Bien que des études de neuro-inflammation chronique de la moelle épinière lésée des animaux sont cliniquement pertinente pour la plupart des patients vivant avec le traumatisme de la moelle épinière ou du cerveau, on sait très peu sur les neuroinflammation chronique, même si plusieurs études ont testé le rôle de la neuroinflammation dans la période aiguë après une blessure. La présente étude caractérise une méthode de la cellule roman qui évalue la préparation, rapidement et efficacement, les changements dans les principaux types de cellules immunitaires par cytométrie de flux dans la moelle épinière lésée, tous les jours pour les 10 premiers jours, puis périodiquement jusqu'à 180 jours après lésion de la moelle épinière. Ces données démontrent quantitativement un roman en fonction du temps de réponse multiphasique de l'inflammation cellulaire dans la moelle épinière après lésion de la moelle épinière et sont vérifiés par stéréologie quantitative de immunomarqué sections de la moelle épinière à des moments choisis. La phase précoce de l'inflammation cellulaire est composé principalement de neutrophiles (avec un pic un jour post-traumatique), les macrophages ou la microglie (avec un pic de 7 jours après la lésion) et les cellules T (avec un pic 9 jours après la lésion). La phase tardive de l'inflammation cellulaire a été détecté après 14 jours post-traumatiques, a atteint un sommet après 60 jours après la lésion et est resté détectable tout au long de 180 jours après la lésion pour les trois types de cellules. En outre, la phase tardive de l'inflammation cellulaire (14-180 jours après la lésion) ne coïncide pas avec soit des améliorations supplémentaires, ou décrémente de nouvelles, en fonction locomotrice en plein champ, après lésion de la moelle épinière. Cependant, le blocage de chimioattractant C5a médiée par l'inflammation après 14 jours post-traumatique récupération locomotrice réduite et la myélinisation dans la moelle épinière lésée, ce qui suggère que la réponse inflammatoire tardive a une fonction réparatrice. Ensemble, ces données fournissent un nouvel éclairage sur l'inflammation cellulaire de la moelle épinière et d'identifier une réponse étonnante et prolongée multiphasique de l'inflammation cellulaire. Comprendre le rôle de cette réponse multiphasique dans la physiopathologie de la moelle épinière pourrait être déterminante pour la conception et la mise en œuvre de stratégies rationnelles de traitement thérapeutique, y compris les deux interventions à base de cellules et pharmacologiques.
